コスト効率と適応性のあるスクラッチ移行アッセイ

要約

また、機器を多用する方法を用いずに細胞移動を決定する新しい手法を提供する、スクラッチ移行アッセイにコスト効率の高い方法を提示します。線維芽細胞はこのプロトコルで使用されたが、それは適応され、細胞の移動に影響を追加の細胞タイプおよび影響を研究するために利用することができる。

要約

細胞の移動は、生理学的および病理学的事象の両方において重要な要素である。正常な細胞移動は、免疫応答の開発や取り付けなどの重要な機能に必要です。細胞の移動過程で欠損または変化が起こると、有害な結果(すなわち、癌転移、創傷治癒、瘢痕形成)を有する可能性がある。細胞移動の重要性のために、手頃な価格、適応性、反復可能な細胞移動アッセイへのアクセスが必要です。一般的なスクラッチ移行アッセイを利用して、一般的な実験室機器を用いた細胞移動解析の新しい手法を開発しました。説明された方法は、タイムラプス顕微鏡を使用せずに関心のある特定の領域を再キャプチャすることを可能にする視覚的なマーカーを使用しています。さらに、移行マトリックス基質の変更から薬理学的修飾剤の添加に至るまで、実験計画において柔軟性を提供します。さらに、このプロトコルは、細胞の移動を調べる際にいくつかの方法では考慮されない、細胞の移動の領域を説明する方法を概説します。この新しいアプローチは、より多くの聴衆にスクラッチ移行アッセイを提供し、研究者が細胞移動の生理学的および病理生理学的影響を調べるより大きな機会を提供する。

概要

細胞の移動は、多くの生理学的事象および病理学的事象にとって極めて重要である。それは、開発中に、免疫応答を取り付けるために、および適切な創傷治癒^1、2、3のために必要^とされる。これらの細胞移動イベントの多くは、物理的または化学的な信号によって引き起こされる可能性があります。例えば、免疫応答中に、白血球は化学誘引剤²に応答して傷害部位に向かって移行する。さらに、白血球はまた、追加の免疫細胞の移動を誘導するためにサイトカインを放出し、ならびに創傷治癒過程に関与する線維芽細胞などの他の細胞タイプ、およびしたがって、多細胞応答⁴を始動する。細胞の移行能力は、適切な生理機能のために不可欠です。しかし、細胞の移動が未チェックになると、それは有害な反応を有し、慢性炎症、血管疾患、癌転移、および傷害治癒^{障害2、3、4、5、6、7}などの病理学的事象に寄与する可能性がある。傷の治癒障害は、細胞移動の欠陥による糖尿病患者の一般的な苦痛であり、これらの欠陥に対処しなければ、さらなる合併症(例えば、切断^8、9)につながる可能性がある。この研究は、他の研究と同様に、正常な生理学的または病理学的状態下で細胞移動が起こるプロセスをさらに理解する必要性を示しており、この研究分野を進めるために不可欠である。これを達成するためには、これらのアッセイを行うために必要な機器を持っていない可能性のある研究者がアクセス可能で手頃な価格の移行アッセイを利用する必要があります。

現在、細胞移動に関する幅広いトピックを検討するために利用可能な様々な移行アッセイがあります。2D と 3D の両方の移行モデルが開発されており、それぞれがセル移行に影響を与える特定の領域を対象としています。3D移行モデルは、通常、細胞浸潤研究に関連しており、細胞外マトリックスが細胞移動^に及ぼす影響を評価する10,11,12であり、2D移行アッセイは応用範囲が広く、主に細胞移動中の化学学的移動、創傷治癒、および機能的変化を研究するために使用される^{13、14、15、16。}これらのアッセイのいくつかは、特定の研究者にこれらのアッセイの可用性を減らすことができるボイデンチャンバーや除外リングなどの追加の機器を必要とします。よりコスト効率の高いアッセイの1つは、創傷治癒および細胞移動^14,17における一般的な変化を評価するために典型的に使用されるスクラッチアッセイである。ほとんどの研究所はスクラッチアッセイを実施するために装備されていますが、細胞の移動を追跡するために使用される機器は、利用できないか、購入するには高価すぎる傾向があります。これには、逆顕微鏡とライブイメージングシステムを必要とするタイムラプス顕微鏡が含まれます。これらの高価な機器は、すべての実験室に一般的にアクセスできるわけではありません。したがって、この観察は、より容易に入手可能な機器で細胞移動の評価を可能にする新しいプロトコルの必要性を強調する。

ここで示すプロトコルは、セルの移行を評価する新しい手頃な方法を提供します。この方法は、スクラッチアッセイに関連する同じ手順に従いますが、基礎科学の実験室で一般的に入手可能な機器を利用して細胞移動を調べる分析において異なります。共通の装置を使用するこのプロトコルはタイムラプス顕微鏡法を使用しないで細胞の移動のより正確な決定を可能にする。この方法は、移行の決定に加えて、セルの移行に大きな影響を与えるスクラッチ領域の可変要因も考慮します。全体として、細胞移動解析のためのこの新しいプロトコルは、より多くの研究室が細胞移動の分野を探索し、貢献する機会を提供します。

プロトコル

1. 一般的な細胞培養

1. 1 g/L グルコースを含むダルベックコの修飾イーグルス培地 (DMEM) の培養心臓線維芽細胞、 ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、および14.2 mM NaHCO 3、14.9 mM HEPES、15%の熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、2%L-グルタミン、および0.02%の抗菌試薬(材料表を参照)を補い、37°Cで_CO2インキュベーターで維持した。
2. 90〜95%の合流まで培養心臓線維芽細胞は、通過0(P0)で到達する。この時点で線維芽細胞は、移行アッセイに使用される48ウェルプレートに分割する準備ができています。

2. 移行プレートの準備

1. 黄色または明るい色の永久マーカーを使用して、ウェルの中心を下に、線を引くことによって48ウェル細胞培養プレートを準備します。次に、ウェルを 3 つの別々の対象領域に分割する 3 つのハッシュマークを描画します。これらのセクションは、イメージングに使用されます。
   注:ライトカラーの永久マーカーを使用すると、移動セルのイメージングが容易になります。黒や青などの暗いマーカーは、移動セルの視覚化を防ぎます。
2. 基質(例えば、コラーゲン)上の移動を評価する場合は、特定の基質に使用される指示および濃度に従って、この時点でウェルをコーティングする。
3. プレート〜15,000-20,000心線維芽細胞、P1は、各ウェルおよび培養細胞に、正常な培養条件(前のセクションに記載された条件)の下で、90〜95%の合流に達するまで。合流は24-48時間の間に達する必要があります。
   注: 移行プレートを設定する場合は、正のコントロール (3T3 セル¹⁸など、既知の移動セル)、負のコントロール (傷なしのセル) と空白のウェルを含める必要があります。

3. スクラッチ移行アッセイと固定

1. 細胞が90-95%の合流度に達したら、滅菌P200ピペットチップを使用して、描かれた線に沿ってメディアとスクラッチを取り除きます。
   注:P200ピペットチップは、スクラッチアッセイ^10、14、19で使用される一般的なピペットチップサイズです。また、複数の試行が複数のスクラッチラインになる可能性があるため、P200 チップを使用して 1 回のパスのみを行います。
2. 低血清培地(1.5%FBS)でウェルをすすい、未接続の心臓線維芽細胞を除去します。
3. 各ウェルに低血清培地500μLを加えます。薬理学的薬剤を使用する場合は、この時点でそれらを追加します。
   注:低血清培地は、細胞の移動を可能/促進し、線維芽細胞が増殖するのを防ぎ、移行アッセイ²⁰の結果をゆがめる可能性があるために使用されます。このプロトコルでは、1.5% FBS が使用されました。
4. 37°Cで5%CO2インキュベーターで24時間、線維芽細胞をインキュベートする前に0時間の画像をキャプチャします。
   1. 20倍の目的で反転した顕微鏡を使用して0時間画像をキャプチャします。井戸ごとに2つの0時間の画像を撮ります。これにより、移行のラインをより完全にカバーできます。
   2. マーキング(ラインとダッシュ)を使用して、井戸を配置してスクラッチラインの上半分をキャプチャします。中間ダッシュのイメージングを避けて、同じ移行領域が 2 回イメージ化されないようにして、結果が歪む可能性があります。
   3. イメージングソフトウェア(材料表)を使用して、0 hの画像#1をキャプチャします。次に、プレートを動かして、カメラの視界にスクラッチのウェル/ラインの下半分を配置します。ここでも、中央ダッシュのキャプチャは避けてください。所定の位置に入ると、0 h イメージ #2をキャプチャします (図 1)。
      注: 0 時間の両方のイメージで中間ダッシュを回避すると、移行の領域を 2 回キャプチャできなくなります。
5. 24時間インキュベートした後、ウェルから培地を取り出し、1x無菌PBSでウェルを洗浄する(今後、使用される1xPBSはすべて無菌である)。
6. ヒュームフードに4%パラホルムアルデヒド500 μLを加え、室温(RT)で10分間インキュベートします。
7. パラホルムアルデヒドを取り除き、RTでそれぞれ5分間1倍PBSで3倍洗います。
8. 細胞を洗浄したら、24時間画像を取り込むか、1xPBSを各ウェルに加え、後で4°Cに置きます。細胞は、画像の準備ができるまで、1〜2週間4°Cにとどまることができます。
   1. 300 μLの透過性溶液(1x PBSおよび0.01%トリトン X-100)を各ウェルに加えて細胞を透過させます。RTで30分間穏やかで絶えず揺れる細胞/プレートをインキュベートします。
   2. パーメビライジング溶液を取り除き、1%クマシーブリリアントブルーステイン(3%クマシーブリリアントブルー、10%酢酸、45%メタノール、45%dH2 O)を10分間、RTで穏やかで絶え間ない揺れを加えます。
      注:プレートが細胞外マトリックス基板でコーティングされている場合は、移行アッセイを行う前に、クーマシー染色でコーティングされたプレートをテストしてください。 図2 は、マトリックス基板がこのアッセイと共に使用でき、細胞の可視化に影響を与えないことを示しています。
   3. RTで1x PBSで3倍の井戸を洗浄し、それぞれ5分間連続して揺れ動きます。
   4. 1x PBSの300 μLを加え、24時間画像をキャプチャした後。
   5. 0 h 画像をキャプチャするために使用したのと同じ位置にウェルを揃えて 24 時間画像をキャプチャします。これを達成するために、以前にキャプチャした0 h画像を開き、永久マーカーで作られたマーキングを使用して、井戸を同じ位置に整列させます。中央の線と追加のダッシュマークを使用すると、24 h イメージと 0 h イメージの間で近い位置に配置できます (図 1)。

0時間と24時間の画像の準備

1. 0時間と24時間の画像をイメージングソフトウェアで同じ井戸と位置で撮影した画像を開く(材料表)。
2. 0 h イメージに新しいレイヤーを作成します。次に、新しいレイヤーをクリックし、テキストをダブルクリックしてレイヤーの名前を「線画」に変更します。
   注: このレイヤーは、この時点からライン レイヤーと呼ばれます。
3. ブラシツール( ブラシ アイコン)をクリックし、サイズを10 px、色を赤に設定します。
4. 線レイヤーを選択した状態で、スクラッチ領域の輪郭を描く 2 本の別々の線を描画します。これらの線が移動領域を示しているため、線はセルに接触してはいけません。
5. 移動ツール(矢印アイコン)をクリックし、Ctrlボタンを押しながら、ラインレイヤーと背景レイヤーの両方をクリックします。
6. 0 h 画像の中央をクリックし、24 時間の画像の中央に両方のレイヤーをドラッグします。
7. 今24 h画像を使用して、0 hの背景レイヤーをクリックし、不透明度を50%に変更します。
8. Ctrl ボタンを押 したまま 、0 h の背景とライン レイヤーの両方をクリックし、レイヤーを自由に変換します (編集 >自由変換)。自由な変換を使用して、0 時間の背景と線の画像を 24 時間の背景イメージに合わせます。このステップは、0 h および 24 h イメージのオーバーレイを生じ、24 h イメージ上の正しい位置に移行領域をマークする線を配置する必要があります。
9. 24時間背景画像に0時間の背景とラインレイヤーを正常にオーバーレイした後、0 hの背景レイヤーを削除します。0 h 背景レイヤーをクリックして削除し、右クリックしてレイヤーの削除 をクリックします。
10. 0 h の背景画像を削除すると、線と 24 時間の背景レイヤー (現在は移行イメージと呼ばれます) が残ります。ライン レイヤーは、24 時間画像上の移動/スクラッチ領域を示し、移動セルの数を決定するために使用できます。
11. 新しい移行イメージとしてフォトショップ ファイルと TIFF/JPEG の両方として保存します。注 : このプロセスを示す代表的な図を 図 3に示します。

5. 移動するセルの数をカウントする

1. 移行イメージを開きます。これは、TIFF/JPEG ファイルを受け入れるプログラム (資料一覧) で実行できます。
2. 2 本の赤い線に触れるだけでなく、その間に位置するセルの数をカウントします。
3. イメージあたりの移動セル数を記録します。ウェルごとに 2 つのマイグレーション・イメージが存在し、これらの値は、マイグレーション領域の値が修正されるまで組み合わせるべきではありません (次のセクションで詳しく説明します)。

6. 移行の領域を決定する

1. セクション 5 ( 資料一覧) のイメージング ソフトウェア プログラムで移行ラインを含む 24 時間イメージを開きます。
2. この画像として保存する「マイグレーションエリア画像」として保存します。
3. 保存後、背景レイヤーをクリックし、右クリックして[レイヤーの削除]をクリックします。これは画像にスクラッチ線のみを残すはずです(図3)。
4. ブラシツール(ブラシアイコン)を使用すると、スクラッチの行間の領域を塗りつぶします。ブラシの色と、移行の線を描画するために使用する色を一致させます。
5. イメージをグレースケールに変更して白黒のイメージを生成し(Image>Mode>グレースケール)、イメージを保存します (図 4)。
6. 解析ソフトウェア (資料一覧) を起動し、解析ソフトウェア内の 「移行領域」ファイルを開きます。
7. 移行ラインの領域を決定するには、[ イメージ]-[調整]→[しきい値] をクリックします。黒の移行領域が赤になり、パーセント領域が [しきい値] ボックスに表示されます。この領域は、画像でキャプチャされた領域全体と比較して、移行ラインがカバーする領域の割合として報告されます。
8. 移行ラインのパーセンテージ領域を記録し、この値が同じイメージの移動セルの数とペアになっていることを確認します。

7. データ分析

1. 移動するセルの数をスクラッチのパーセント領域に正規化します。移行するセルの数を、移行ラインのパーセント領域で割ります (移行されたセルの割合 ( 移行されたセルの割合 ) 。ウェルごとの移行に基づく平均ではなく、イメージごとにこれを行います。
2. イメージごとの値を正規化した後、個々のウェルを表す 2 つのイメージの値を追加します。この値は、グラフィカルおよび統計分析に使用されます。実験計画に複数の反復が含まれていた場合。統計分析前の平均反復値。

結果

この手順は、ほとんどのラボで費用対効果が高く、容易に適応可能な、細胞移動を研究するための新しいアプローチを文書化しています。多くの研究では、細胞の移動を評価するためにタイムラプス顕微鏡を使用してきましたが、この方法に必要な機器は多くの研究室で容易に入手できません。線やダッシュを使用して境界を使用すると、高価な機器を使用せずに、異なる時点で特定の対象?...

ディスカッション

スクラッチ移行アッセイに対するこの新しいアプローチは、研究者が細胞移動の変化を調べるためのよりアクセスしやすい方法を提供します。このアッセイは、他のスクラッチアッセイと同様のスクラッチを投与するための同じ手順に従うが、細胞移動¹⁰のイメージングおよび正確な分析のための新しい方法を提供する。この方法は、タイムラプス顕微鏡とライブセルイメ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe All Apps	Adobe		This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile	MIDSCI	AVR1	Tips are autoclaved to sterilize
AxioCam Erc 5s Camera	Zeiss	426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250	Fisher Scientific	BP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells	Fisher Scientific	07-200-86
DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate	Fisher Scientific	MT10014CM
Image J	NIH		This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	AC416785000
Premium US origin fetal bovine serum	Innovative Research	IFBS-HU
Primocin	InvivoGEN	ant-pm-2	This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts
Zeiss Primovert Microscope	Zeiss	491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 software	Zeiss		software comes with camera purchase