Un ensayo de migración de arañazos rentable y adaptable

Resumen

Presentamos un método rentable para el ensayo de migración de arañazos que proporciona un nuevo enfoque para determinar la migración celular sin el uso de métodos intensivos en equipos. Mientras que los fibroblastos se utilizaron en este protocolo, se pueden adaptar y utilizar para estudiar tipos celulares adicionales e influencias en la migración celular.

Resumen

La migración celular es un componente clave en eventos fisiológicos y patológicos. La migración celular normal es necesaria para funciones esenciales como el desarrollo y el montaje de una respuesta inmunitaria. Cuando se produce un defecto o alteración con el proceso de migración celular, puede tener resultados perjudiciales (es decir, metástasis de cáncer, cicatrización de heridas y formación de cicatrices). Debido a la importancia de la migración celular, es necesario tener acceso a un ensayo de migración celular que sea asequible, adaptable y repetible. Utilizando el ensayo común de migración de arañazos, hemos desarrollado un nuevo enfoque para analizar la migración celular que utiliza equipos de laboratorio generales. El método descrito utiliza marcadores visuales que permiten recuperar áreas específicas de interés sin el uso de microscopía de lapso de tiempo. Además, proporciona flexibilidad en el diseño experimental, que van desde la alteración del sustrato de la matriz de migración hasta la adición de modificadores farmacológicos. Además, este protocolo describe una manera de tener en cuenta el área de migración celular, que no se considera mediante varios métodos al examinar la migración de celdas. Este nuevo enfoque ofrece un ensayo de migración de arañazos a un público más amplio y proporcionará una mayor oportunidad para que los investigadores examinen el impacto fisiológico y fisiopatológico de la migración celular.

Introducción

La migración celular es crucial para muchos eventos fisiológicos y patológicos. Es necesario durante el desarrollo, para el montaje de una respuesta inmune, y para la cicatrización de heridas adecuada^1,2,3. Muchos de estos eventos de migración celular pueden desencadenarse por señales físicas o químicas. Por ejemplo, durante una respuesta inmunitaria, los leucocitos migrarán hacia un sitio de lesión en respuesta a un quimioatractant². Además, los leucocitos también liberarán citoquinas para inducir la migración de células inmunitarias adicionales, así como otros tipos de células, como los fibroblastos, que están involucrados en el proceso de cicatrización de heridas, y por lo tanto, iniciando una respuesta multicelular⁴. La capacidad de las células para migrar es esencial para la función fisiológica adecuada; sin embargo, cuando la migración celular no se controla, puede tener una respuesta adversa y contribuir a eventos patológicos, como inflamación crónica, enfermedad vascular, metástasis de cáncer, y deterioro de la cicatrización de heridas^2,3,4,5,6,7. El deterioro de la cicatrización de heridas es una aflicción común de los diabéticos debido a defectos en la migración celular, y si estos defectos no se abordan, podría conducir a complicaciones adicionales (por ejemplo, amputación^8,9). Este estudio, así como otros, han indicado la necesidad de comprender mejor el proceso por el cual se produce la migración celular, ya sea en condiciones fisiológicas o patológicas normales, y es vital para promover este campo de investigación. Para lograrlo, es necesario que haya ensayos de migración disponibles que sean accesibles y asequibles para aquellos investigadores, que pueden no poseer el equipo necesario para llevar a cabo estos ensayos.

Actualmente, hay una variedad de ensayos de migración disponibles para examinar una amplia gama de temas relacionados con la migración celular. Se han desarrollado modelos de migración 2D y 3D, cada uno dirigido a áreas específicas que afectan a la migración celular. Los modelos de migración 3D se asocian típicamente con estudios de invasión celular y evalúan el impacto de la matriz extracelular en la migración celular^10,11,12, mientras que los ensayos de migración 2D tienen un mayor rango de aplicación y se utilizan principalmente para estudiar la migración quimiotáctica, la cicatrización de heridas, y los cambios funcionales durante la migración celular^13,14,15,16. Varios de estos ensayos requieren equipos adicionales, como cámaras Boyden o anillos de exclusión, lo que puede reducir la disponibilidad de estos ensayos a ciertos investigadores. Uno de los ensayos más rentables es el ensayo de arañazos, que se utiliza normalmente para evaluar la cicatrización de heridas y los cambios generales en la migración celular^14,17. Mientras que la mayoría de los laboratorios están equipados para llevar a cabo un ensayo de rasguño, el equipo utilizado para rastrear la migración celular tiende a no estar disponible o demasiado caro para comprar. Esto incluye la microscopía de lapso de tiempo, que requiere un microscopio invertido y un sistema de imágenes en vivo. Estas costosas piezas de equipo no son comúnmente accesibles para todos los laboratorios. Por lo tanto, esta observación pone de relieve la necesidad de un nuevo protocolo que permita evaluar la migración celular con equipos más fácilmente disponibles.

El protocolo presentado aquí proporciona una forma nueva y asequible de evaluar la migración celular. Este método sigue el mismo procedimiento asociado con los ensayos de arañazos, pero difiere en el análisis del examen de la migración celular mediante la utilización de equipos más comúnmente disponibles en un entorno de laboratorio de ciencias básicas. Este protocolo que utiliza equipos comunes permite una determinación más precisa de la migración celular sin el uso de microscopía de lapso de tiempo. Además de determinar la migración, este método también tiene en cuenta los factores variables en el área de rayado que se ha observado que afectan en gran medida a la migración de celdas. En general, este nuevo protocolo para el análisis de migración celular ofrece una oportunidad para que más laboratorios exploren y contribuyan al campo de la migración celular.

Protocolo

1. Cultivo celular general

1. Cultivo de fibroblastos cardíacos en el medio de águilas modificadas (DMEM) de Dulbecco que contienen 1 g/L de glucosa, piruvato de sodio, L-glutamina, y suplementado con 14,2 mM de NaHCO₃, 14,9 mM HEPES, 15% de suero bovino fetal inactivado térmicamente (FBS), 2% L-glutamina y 0,02% de reactivo antimicrobiano (ver Tabla de materiales)y mantenido en incubadora de_CO2 a 37 oC.
2. Cultivo de fibroblastos cardíacos hasta que se alcanza una confluencia del 90-95% en el paso 0 (P0). En este punto, los fibroblastos están listos para dividirse en una placa de 48 pozos, que se utiliza para el ensayo de migración.

2. Preparación de la placa de migración

1. Preparar una placa de cultivo celular de 48 pozos dibujando una línea, usando un marcador permanente amarillo o de color claro, en el centro del pozo. A continuación, dibuje tres marcas hash que dividan el pozo en tres áreas de interés separadas. Estas secciones se utilizarán para la toma de imágenes.
   NOTA: El uso de un marcador permanente de color claro permitirá obtener imágenes fáciles de las células migratorias. Los marcadores oscuros, como el negro o el azul, impedirán la visualización de las celdas migratorias.
2. Si evalúa la migración sobre un sustrato (por ejemplo, colágeno), cubra el pozo en este momento siguiendo las instrucciones y concentraciones utilizadas para el sustrato específico.
3. Placa de 15.000-20.000 fibroblastos cardíacos, P1, en cada pozo y células de cultivo, en condiciones normales de cultivo (condiciones enumeradas en la sección anterior), hasta que alcanzan el 90-95% de confluencia. La confluencia debe alcanzarse entre 24-48 horas.
   NOTA: Al configurar la placa de migración, asegúrese de incluir un control positivo (una celda migratoria conocida, como celdas 3T3^18),un control negativo (celdas sin rascacielos) y un pozo en blanco.

3. Scratch migración ensayo y fijación

1. Una vez que las células alcancen el 90-95% de confluencia, retire los medios y rasque a lo largo de la línea dibujada usando una punta de pipeta estéril P200.
   NOTA: Una punta de pipeta P200 es la punta de pipeta común de tamaño utilizado con el ensayo de^{arañazos 10,14,19}. Además, solo haga una pasada con la punta P200 ya que más de un intento puede dar lugar a varias líneas de rayado.
2. Enjuague el pozo con medios séricos bajos (1,5% FBS) para eliminar cualquier fibroblastos cardíacos no asociados.
3. Añadir 500 l de medios séricos bajos a cada pocól. Si utiliza algún agente farmacológico, agréguelos en este momento.
   NOTA: Se utilizan medios séricos bajos porque permiten/promueven la migración celular y evitan que los fibroblastos proliferen, lo que podría sesgar los resultados del ensayo de^{migración 20}. Para este protocolo, se utilizó el 1,5% de FBS.
4. Capturar imágenes de 0 h antes de incubar los fibroblastos en una incubadora de 5% de_CO2 a 37oC durante 24 h.
   1. Captura imágenes de 0 h con un microscopio invertido con un objetivo de 20x. Tome dos imágenes de 0 horas por pozo. Esto permitirá una cobertura más completa de la línea de migración.
   2. Usando las marcas (línea y guiones), coloque el pozo para capturar la mitad superior de la línea de rasguño. Evite tomar imágenes en el tablero central para asegurarse de que la misma área de migración no se toma una imagen dos veces, lo que podría sesgar los resultados.
   3. Utilice el software de imágenes (Tabla de materiales) para capturar #1 de imagen de 0 h. A continuación, mueva la placa para colocar la mitad inferior del pozo /línea de arañazo a la vista de la cámara. Una vez más, evite capturar el tablero central. Una vez en su lugar, capture la imagen de 0 h #2 (Figura 1).
      NOTA: Evitar el guión medio en ambas imágenes de 0 h evitará capturar áreas de migración dos veces las cuales si se hace podría producir resultados repetidos y sesgar los datos.
5. Después de la incubación durante 24 h, retire el medio del pozo, y lave el pozo con 1x PBS no estéril (en adelante, la 1x PBS utilizada no es estéril).
6. En la campana de humos, añadir 500 l de 4% de paraformaldehído al pozo e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).
7. Retire el paraformaldehído y lave 3x con 1x PBS durante 5 minutos cada uno en RT.
8. Una vez que las células se lavan, proceda a capturar imágenes de 24 h o agregue 1x PBS a cada pozo y colóquelos a 4 oC hasta un momento posterior. Las células pueden permanecer a 4 oC durante 1-2 semanas hasta que estén listas para la imagen.
   1. Permeabilizar las células mediante la adición de 300 l de solución permeabilizante (1x PBS y 0.01% tritón X-100) a cada pocómata. Incubar células/placas con balanceo suave y continuo durante 30 min en RT.
   2. Retire la solución permeabilizante y agregue una mancha de 1% Coomassie Brilliant Blue (3% Coomassie Brilliant Blue, 10% ácido acético, 45% metanol y 45% dH₂O) durante 10 min con un balanceo suave y continuo en RT.
      NOTA: Si las placas están recubiertas con un sustrato de matriz extracelular, asegúrese de probar una placa recubierta con tinción de Coomassie antes de realizar el ensayo de migración. La Figura 2 muestra que un sustrato de matriz se puede utilizar con este ensayo y no la visualización del impacto de las células.
   3. Lavar los pozos 3x con 1x PBS en RT con balanceo continuo durante 5 minutos cada uno.
   4. Después de lavados, añada 300 l de 1x PBS y capture imágenes de 24 h.
   5. Capture imágenes de 24 h alineando el pozo en la misma posición que se utilizó para capturar las imágenes de 0 h. Para lograr esto, abra las imágenes de 0 h capturadas previamente y utilizando la marca hecha con el marcador permanente, alinee el pozo en la misma posición. La línea hacia abajo las marcas de guiones centrales y adicionales debe permitir una alineación estrecha entre la imagen de 24 horas y la imagen de 0 h (Figura 1).

4. Preparación de imágenes de 0 h y 24 h

1. Abrir imágenes de 0 h y 24 h tomadas del mismo pozo y posición en software de imagen (Tabla de materiales).
2. Cree una nueva capa en la imagen de 0 h. A continuación, haga clic en la nueva capa y cambie el nombre de la capa a "capa de línea" haciendo doble clic en el texto.
   NOTA: Esta capa se denominará capa de línea desde este punto.
3. Haz clic en la Herramienta Pincel (icono de pincel) y establece el tamaño en 10 px y el color en rojo.
4. Con la capa de línea seleccionada, dibuje dos líneas separadas que delineen el área del rasguño. Las líneas no deben tocar ninguna celda debido a estas líneas que marcan el área de migración.
5. Haga clic en la herramienta Mover (icono de flecha) y luego presione el botón Ctrl y haga clic en las capas de línea y fondo.
6. Haga clic en el centro de la imagen de 0 h y arrastre ambas capas al centro de la imagen de 24 horas.
7. Ahora usando la imagen de 24 h, haga clic en la capa de fondo 0 h y cambie la opacidad a 50%.
8. Manteniendo presionado el botón Ctrl, haga clic en la capa de fondo y línea 0 h y luego transforme libremente las capas (Editar> Transformación Libre). Usando la transformación libre, alinee el fondo de 0 h y la imagen de línea con la imagen de fondo de 24 horas. Este paso da como resultado la superposición de la imagen 0 h y 24 h, que es necesaria para colocar las líneas que marcan el área de migración en la posición correcta en la imagen de 24 horas.
9. Después de superponer correctamente las capas de fondo y línea de 0 h en la imagen de fondo de 24 horas, elimine la capa de fondo 0 h. Para eliminar, haga clic en la capa de fondo 0 h, haga clic con el botón derecho y haga clic en Eliminar capa.
10. La eliminación de la imagen de fondo de 0 h dejará solo la línea y la capa de fondo de 24 horas (ahora denominada imagen de migración). La capa de línea indicará el área de migración/arañazo en la imagen de 24 horas y se puede utilizar para determinar el número de celdas migratorias.
11. Guardar como la nueva imagen de migración como un archivo de photoshop y un TIFF/JPEG. NOTA: una figura representativa que representa este proceso se presenta en la Figura 3.

5. Contar el número de células migratorias

1. Abra la imagen de migración. Esto se puede hacer en un programa que acepta archivos TIFF/JPEG (Tabla de materiales).
2. Cuente el número de celdas que se encuentran en el medio, así como tocar las dos líneas rojas.
3. Registre el número de celdas migratorias por imagen. Habrá dos imágenes de migración por pozo, y estos valores no deben combinarse hasta después de que los valores se hayan corregido para el área de migración (detallada en la sección siguiente).

6. Determinar el área de migración

1. Abra la imagen de 24 horas que contiene las líneas de migración en el programa de software de imágenes en la sección 5 (Tabla de materiales).
2. Guardar como esta imagen como "Imagen de área de migración".
3. Después de guardar, haga clic en la capa de fondo, haga clic con el botón derecho y haga clic en Eliminar capa. Esto debe dejar sólo las líneas de arañazo en la imagen (Figura 3).
4. Usando la Herramienta Pincel (icono de pincel) rellena el área entre las líneas de scratch. Haga coincidir el color del pincel con el color utilizado para dibujar las líneas para la migración.
5. Cambie la imagen a una escala de grises para generar una imagen en blanco y negro (Imagen>Modo>Escala de grises)y, a continuación, guarde la imagen (Figura 4).
6. Inicie el software de análisis (Tabla de materiales) y, a continuación, abra el archivo "Area of Migration" dentro del software de análisis.
7. Para determinar el área de la línea de migración, haga clic en Imagen>Ajustar>Umbral. El área de migración negra se volverá roja y el área de porcentaje se indicará en el cuadro Umbral. El área se notificará como el porcentaje de área que cubre la línea de migración en comparación con toda el área capturada en la imagen.
8. Registre el área de porcentaje para la línea de migración y asegúrese de que este valor está emparejado con el número de celdas de migración para la misma imagen.

7. Análisis de datos

1. Normalice el número de celdas migratorias al área de porcentaje del rasguño. Divida el número de celdas migratorias por el área porcentual de la línea de migración (en % de migración de las celdas migradas). Haga esto por imagen y no un promedio basado en la migración por pozo.
2. Después de normalizar los valores por imagen, agregue los valores de las dos imágenes, lo que representa un pozo individual. Este valor se utilizará para el análisis gráfico y estadístico. Si el diseño experimental contenía varias réplicas. Valores de réplica promedio antes del análisis estadístico.

Resultados

Este procedimiento documenta un nuevo enfoque para estudiar la migración celular que es rentable y fácilmente adaptable para la mayoría de los laboratorios. Muchos estudios han utilizado la microscopía de lapso de tiempo para evaluar la migración celular, pero el equipo necesario para este método no está fácilmente disponible para muchos laboratorios. Mientras que la utilización de líneas y guiones para la demarcación permite la capacidad de recapturar áreas específicas de interés en diferentes puntos de ti...

Discusión

Este nuevo enfoque para el ensayo de migración de arañazos proporciona un método más accesible para que los investigadores examinen los cambios en la migración celular. Si bien este ensayo sigue el mismo procedimiento para administrar un rasguño similar a otros ensayos de scratch, proporciona un nuevo método para la creación de imágenes y el análisis preciso de la migración celular^10. En lugar de utilizar métodos intensivos en equipos de microscopía de lapso de tiempo y cámaras de im...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe All Apps	Adobe		This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile	MIDSCI	AVR1	Tips are autoclaved to sterilize
AxioCam Erc 5s Camera	Zeiss	426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250	Fisher Scientific	BP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells	Fisher Scientific	07-200-86
DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate	Fisher Scientific	MT10014CM
Image J	NIH		This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	AC416785000
Premium US origin fetal bovine serum	Innovative Research	IFBS-HU
Primocin	InvivoGEN	ant-pm-2	This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts
Zeiss Primovert Microscope	Zeiss	491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 software	Zeiss		software comes with camera purchase