Method Article
* These authors contributed equally
يصف هذا البروتوكول الإجراءات للحث على إصابة الكلى الحادة (AKI) في سمك الحمار الوحشي البالغ باستخدام سيسبلاتين كعامل كلي. قمنا بتفصيل الخطوات لتقييم قابلية إعادة إنتاج التقنية وتقنياتين لتحليل الالتهاب وموت الخلايا في الأنسجة الكلوية ، وقياس التدفق الخلوي و TUNEL ، على التوالي.
يستخدم سيسبلاتين عادة ككيماوي. على الرغم من أن له آثار إيجابية في الأفراد الذين عولجوا من السرطان، سيسبلاتين يمكن أن تتراكم بسهولة في الكلى بسبب انخفاض وزنه الجزيئي. هذا التراكم يسبب موت الخلايا الأنبوبية ويمكن أن تحفز على تطوير إصابة الكلى الحادة (AKI) ، والتي تتميز بانخفاض سريع في وظائف الكلى ، وتلف الأنسجة ، وتسلل الخلايا المناعية. إذا تدار في جرعات محددة سيسبلاتين يمكن أن يكون أداة مفيدة كمحفز AKI في النماذج الحيوانية. وقد ظهرت حمار وحشي كنموذج مثير للاهتمام لدراسة وظائف الكلى, تجديد الكلى, والإصابة, كما هياكل الكلى الحفاظ على أوجه التشابه الوظيفي مع الثدييات. حمار وحشي الكبار حقن مع سيسبلاتين يظهر انخفاض البقاء على قيد الحياة, موت خلايا الكلى, وزيادة علامات الالتهاب بعد 24 ح بعد الحقن (hpi). في هذا النموذج، يمكن تقييم تسلل الخلايا المناعية وموت الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي وتقيس TUNEL. يصف هذا البروتوكول الإجراءات للحث على AKI في حمار وحشي الكبار عن طريق حقن سيسبلاتين داخل الصفاق ويوضح في وقت لاحق كيفية جمع الأنسجة الكلوية لمعالجة قياس التدفق الخلوي واختساب TUNEL موت الخلية. وستكون هذه التقنيات مفيدة لفهم آثار سيسبلاتين كعامل كلي البروتينات وستسهم في توسيع نماذج AKI في حمار وحشي الكبار. ويمكن أيضا أن يستخدم هذا النموذج لدراسة تجديد الكلى, في البحث عن المركبات التي تعالج أو منع تلف الكلى ودراسة التهاب في AKI. وعلاوة على ذلك، فإن الأساليب المستخدمة في هذا البروتوكول تحسين توصيف تلف الأنسجة والالتهاب، والتي هي أهداف علاجية في الأمراض المصاحبة للكلى.
الكلى هي المسؤولة عن العديد من الوظائف الفسيولوجية الهامة التي تحافظ على التوازن، مثل ترشيح الدم، وإزالة المخلفات الزائدة، وتنظيم تركيزات الأيونات1. تلف الأنسجة الكلوية يمكن أن يؤدي إلى حالة غير متجانسة تسمى إصابة الكلى الحادة (AKI) ، والتي توصف سريريا بأنها انخفاض سريع في وظيفة الكلى الناجمة عن تدمير وموت الخلايا الظهارية الأنبوبية ، إصابة الخلايا البطانية ، وتسلل الكريات البيض 2،3. AKI هو شرط من المتوقع أن يحدث في 8-16٪ من دخول المستشفيات4،مع ارتفاع معدل الوفيات التي تتراوح بين 20 إلى 50٪ في وحدة العناية المركزة (ICU)5. ويرتبط هذا المرض مع زيادة الإقامة في المستشفى واستخدام كبير للموارد المالية5. وتشمل العوامل الايولوجية الجفاف، والصدمة، والالتهابات، والإنتان، وأمراض القلب والأوعية الدموية، والأدوية كلي البروتينات6. يعرف السمية الكلوية بأنها إصابة كلوية ناجمة عن المخدرات ، مما يسبب آثارا مثل AKI ، اعتلالات الأنابيب ، و اعتلالات الكبيبات7. تؤثر السمية الكلوية على ثلثي مرضى وحدة العناية المركزة ، حيث أن ما يقرب من 20٪ من الأدوية الموصوفة في وحدة العناية المركزة تعتبر8،9، وهذا يشمل الأدوية المضادة للالتهابات غير الستيرويدية (مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية) والمضادات الحيوية مثل فانكومايسين وأمينوغليكوزيد ، وعوامل العلاج الكيميائي مثل الميثوتريكسات و سيسبلاتين7. سيسبلاتين هو واحد من أقوى الأدوية والعلاج الكيميائي شيوعا، وتستخدم في علاج الأورام الصلبة، مثل الرأس والرقبة، الخصية، المبيض، والمثانة10. في الكلى ، يتم استيعاب cisplatin في الأنبوب الملتوي القريب (PCT) من خلال الناقل القيصري العضوي 2 (OCT-2) وفي تركيزات عالية يرتبط بالحمض النووي الذي يؤدي إلى مسارات موت الخلية7،10،11،12. تراكم هذا الدواء في الكلى يساهم في السمية الكلوية مع الموت والالتهاب13. هذا الآثار الجانبية الضارة يؤثر بشكل كبير على حياة وتشخيص ثلث مرضى السرطان الذين يخضعون لعلاج سيسبلاتين ، لذلك لا بد من البحث عن علاجات جديدة يمكن أن تقلل من السمية الكلوية دون فقدان تأثير القتل على الخلايا السرطانية10.
وبسبب هذا التأثير الكلوي ، يستخدم سيسبلاتين عادة كمحث AKI في النماذج الحيوانية التجريبية ، كما هو موضح إلى الأمام. في القوارض، تم الإبلاغ عن أول نموذج AKI الناجمة عن سيسبلاتين في عام 197114 ولكن في الوقت الحاضر، ظهرت العديد من البروتوكولات المختلفة باستخدام الآثار التراكمية التي تعتمد على الجرعة من سيسبلاتين15. وبالتالي، اعتمادا على الجرعة وعدد من التطبيقات، يمكن أن تكون درجات مختلفة من شدة إصابة الكلىالناجمة 16،17،18،19،20،21. وتتكون الطريقة الأكثر شيوعا من حقن داخل الصفاق (أي p.) جرعة واحدة من سيسبلاتين تليها القتل الرحيم في الأيام التالية. في هذا البروتوكول الكلاسيكي، جرعة واحدة عالية من السيتبلاتين (10-13 ملغم/كغ في الفئران و/أو 3-8 ملغم/كغ في الفئران) تحفز تغييرات هيستولوجية حادة، مثل فقدان حدود الفرشاة وحطام الخلية داخل التجويف الأنبوبي، بعد أيام قليلة من حقن سيسبلاتين. شدة التغيرات النسيجية تعتمد على الجرعة ، ويلاحظ وجود علامات على التجديد بعد 7 أيام من حقن سيسبلاتين16،17.
على الرغم من أن نماذج القوارض راسخة ، قررنا الاستفادة من خصائص فقاريات أخرى ، مع تركيز دراساتنا على سمك الحمار الوحشي(دانيو ريو). وقد استخدمت هذه الأسماك على نطاق واسع لنمذجة الأمراض البشرية، وذلك بسبب صغر حجمها، والإخصاب الخارجي، وارتفاع معدلات الإنجاب، والتطور السريع، وشفافية الأجنة واليرقات، وانخفاض تكلفة الصيانة، وتشريح مماثلة للثدييات (مع بعض الاستثناءات)، وارتفاع قدرة تجديد الأنسجة، والسلوك الاجتماعي، 70٪ من التشابه الجيني مع البشر و 84٪ مع الجينات المرتبطة بالأمراض البشرية22. Streisinger وآخرون23،24،25 بدأت الدراسات مع حمار وحشي التي أكدت عمليا على استخدام هذا الكائن الحي نموذج للتحليل الجيني للتنمية الفقاريات. في أبحاث الكلى ، ظهرت سمكة الحمار الوحشي ليس فقط في الدراسات التنموية ولكن أيضا كأداة وراثية في البحث عن جينات جديدة مرتبطة بحالات الكلى26. وعلاوة على ذلك، فإن قدرة التجديد دون تشكيل ندبة والقدرة على توليد الكلية من خلال حياتهم، ودعا نيونيفروجينيسيس، وجعل حمار وحشي نموذجا حيوانيا رئيسيا للبحث التجديد27،28. وعلاوة على ذلك، فإن توافر نماذج تجريبية لأمراض الكلى المختلفة، بما في ذلك إصابات الكلى الحادة والمزمنة، يدل على براعة هذا الكائن التجريبي26،29. كما هو الحال في الثدييات ، يتم اشتقاق السلف الكلوي لسمك الحمار الوحشي من الوسيط المتوسط. تولد هذه السلف الكلوية المعرضة التي سوف تتطور في وقت لاحق إلى mesonephros، والتي سيتم الحفاظ عليها كجهاز ناضجة حتى سن البلوغ29،30.
وتقع الكلى حمار وحشي الكبار على الجدار الظهري للجسم، بين المثانة السباحة والعمود الفقري29. من وجهة نظر بطنية، يمكن تقسيم حمار وحشي إلى ثلاث مناطق(الشكل 1A):الرأس (H)، الجذع (Tr)، والذيل (تا)29. نفس الثدييات، حمار وحشي لديه الكلية كوحدات وظيفية من الكلى، والتي تنقسم إلى شرائح أنبوبية(الشكل 1A):الكلي (RC)، أنبوب ملتوية قريبة (PCT)، أنبوب مستقيم قريب (PST)، القاصد في وقت مبكر (DE)، في وقت متأخر من القاص (DL) وجمع القناة (CD)29. حمار وحشي تشترك في الحفظ الجيني وأوجه التشابه الهيكلي مع الكليرونات البشرية (الشكل 1B) ولكن يفتقر إلى بعض الجزيئات مثل أنبوبي وسيطة، والمعروف أيضا باسم حلقة هنل (LH)29،31. عادة ما تكون أسماك المياه العذبة مثل حمار وحشي محاطة بوسط منخفض جدا ، وبسبب هذا ، فإنها تميل إلى أن تكون مفرطة السمية وتعتمد على الخياشيم والجلد في المراحل المبكرة ، والكلى لتنظيم التناضح وإفراز الماء32. يبدأ ترشيح الدم من الشريان الأورطي الظهري بواسطة الفروس حوالي 48 ساعة بعد الإخصاب (hpf)33،34. الكلى من حمار وحشي ليس فقط جهاز إفراز النفايات الأيضية ولكن أيضا يعمل كعضو دموي من 4 أيام بعد الإخصاب (dpf) إلى مرحلة البلوغ وهو ما يعادل نخاع العظام في الثدييات35. أثناء التنمية، والخلايا الجذعية الدموية (HSCs) بذور الكلى، وتجديد الذات، وتوليد النخاعي، الغدة الدرقية، وأنساب الخلايا اللمفاوية، والحفاظ على عوامل النسخ، والجزيئات الإشارات، والبرامج الوراثية المحفوظة للغاية مع الثدييات36،37. وقد كشفت الدراسات أن معظم الغدة الدرقية، خثار، النخاع، والخلايا اللمفاوية في الجهاز المناعي البشري موجودة في حمار وحشي37،38. الخصائص الفريدة لهذا الحيوان والميزات المحفوظة مع الكلى البشرية جعلت هذا الكائن الحي النموذجي مفيدا في البحث عن وظائف الكلى والإصابات والتجديد.
على الرغم من أن الكلى من حمار وحشي درس جيدا وبعض نماذج من AKI متوفرة بالفعل في اليرقات وسمك الحمار الوحشي الكبار28، في وقت إنشاء هذا البروتوكول لم يكن هناك أي دليل على نموذج AKI غير المستحث كيميائيا غير المضاد الحيوي في حمار وحشي الكبار. وإلى جانب ذلك، يركز مختبرنا على اختبار البكتيريا بروبيوتيك والمركبات المشتقة من الكائنات الحية المجهرية لدراسة التجديد وتلف الكلى، وبالتالي ركزنا جهودنا في خلق نموذج جديد AKI الناجم عن سيسبلاتين في الأسماك الكبار. توضح مقالة الفيديو المعروضة في هذه المخطوطة إجراءات نموذج جديد لتحريض AKI باستخدام حقنة أي p. من 120 ميكروغرام سيسبلاتين لكل غرام من الحيوان (120 ميكروغرام /غرام) (الشكل 2A). واستندت هذه الجرعة في البداية على دراسات AKI الناجمة عن سيسبلاتين في نماذج مورين التي ذهبت حوالي 10 ملغ / كغ (أي ما يعادل 10 ميكروغرام / غرام)14,15,16,17, ومع ذلك, هذه الجرعة لم تكن كافية للحث على تلف الكلى المتعلقة بالسمية الكلوية (البيانات غير مبينة). وهكذا، قمنا بزيادة الجرعة لتلك المستخدمة في هذهالدراسة (الشكل 2B). كشف عملنا عن تأثير يعتمد على الجرعة من سيسبلاتين في معدل البقاء على قيد الحياة بعد الحقن مع تحريض تلف أنسجة الكلى 24 hpi كما هو مبين من خلال فقدان الهيكل الأنبوبي ، وزيادة التسلل الالتهابي ، وارتفاع معدل موت الخلايا. هنا، ونحن نصف اثنين من التقنيات لتحليل تطوير AKI الناجم عن سيسبلاتين: تدفق قياس الخلايا، لتحليل تسلل الخلايا، و TUNEL، لقياس موت الخلية. قياس التدفق الخلوي هو تقنية تقيس الخصائص الفيزيائية (الحجم والحبيبة) والكيميائية (المركبات الفلورية) للخلايا. داخل السيتومتر، يمر تعليق الخلية عبر سائل غمد ينظم الخلايا في خط واحد، مما يسمح لها بالمرور عبر شعاع ليزر خلية واحدة في كل مرة(الشكل 3A). سيقوم كاشف أمام شعاع الضوء بقياس مبعثر الأمام (FSC) ، الذي يرتبط بحجم الخلية ، وأجهزة الكشف إلى الجانب ستقيس مبعثر الجانب (SSC) الذي يرتبط بحبيبة الخلايا. وسوف أجهزة الكشف الأخرى قياس مضان من الجسيمات، والبروتينات الفلورية، أو الخلايا التي تحمل اسم الأجسام المضادة39،40. كما الأجسام المضادة التجارية لسمك الحمار الوحشي نادرة في الوقت الحاضر، واستخدام المراسلين الحيوان والمؤشرات الحيوية الفلورية يسمح لتحسين هذا التحليل وتحديد مجموعات الخلايا المتنوعة41،42،43. أداة أخرى مستخدمة في هذا البروتوكول كان نقل deoxynucleotidyl الطرفية (TdT) dUTP إنهاء وضع العلامات (TUNEL) المقايسة. إن اختبار TUNEL هو طريقة اكتشاف موت الخلايا المبرمج في مرحلة متأخرة تعتمد على قدرة TdT على تحديد الحمض النووي المجزأ وتسميته بإزالة الأكسجين الموسوم بعلامة فلورية يمكن تصورها وقياسها كميا بواسطة المجهر44 (الشكل 3B). وبالنظر إلى أن واحدة من أكثر السمات لفتا للاكي هو تحريض موت الخلايا المبرمج في خلايا الكلى أنبوبي3, هذه التقنية مفيد للغاية لأنه يمكن تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي و / أو المجهر.
النهج المعروضة في هذه المقالة يسمح بمراقبة حالة AKI وتقديم نموذج حاد جديد لدراسة اضطرابات AKI التي يمكن أن تكون مفيدة للبحث عن أهداف علاجية جديدة في AKI المرتبطة سيسبلاتين.
وقد وافقت لجنة أخلاقيات استخدام الحيوان التابعة لمعهد العلوم الطبية الحيوية في جامعة ساو باولو في السابق على الإجراءات الموصوفة في هذا البروتوكول لاستخدامها في نموذج سمك الحمار الوحشي.
1. AKI التعريفي عن طريق الحقن داخل الصفاق Cisplatin
2. عزل الكلى ومعالجة الأنسجة لتدفق الخلايا المناعية
3. تجهيز الكبار زيبرافيش أنسجة الكلى ل TUNEL المقايسة
4. اختبار TUNEL
ملاحظة: يستخدم البروتوكول التالي مجموعة أدوات الكشف عن موت الخلايا في الموقع (جدول المواد).
كلية حمار وحشي هو جهاز مصطبغة مسطحة تقع على الجدار الظهري ووحدتها الوظيفية الأساسية، وكلية، يتم الحفاظ مع الثدييات (الشكل 1). خصوصية وجود كلية واحدة فقط مع قدرة عالية على التجديد يجعل هذا الكائن الحي نموذج خيار ممتاز لإصابة الكلى نموذج. تم تصميم البروتوكولات المقدمة في هذا العمل لحث AKI عن طريق الحقن داخل الصفاق (أي p.) من سيسبلاتين في حمار وحشي الكبار(الشكل 2)و ليتم تحليلها في وقت لاحق من قبل اثنين من التقنيات مفصلة قبل: تدفق قياس الخلايا (الشكل 3A) و TUNEL (الشكل 3B). يتم تصوير مخطط انسيابي للعملية بأكملها في الشكل 4. تم تطبيق جرعات سيسبلاتين في البداية على تلك الموصوفة في نماذج الماوس15،16،17، حيث المعيار المستخدم هو 10-13 ملغ من سيسبلاتين لكل كيلوغرام من الحيوان (ملغ / كجم). ومع ذلك ، أظهرت سمكة الحمار الوحشي أن تكون أكثر مقاومة للسيسبلاتين من الماوس (البيانات غير المعروضة) ، وزادت الجرعة النهائية. عندما قمنا بتقييم معدل بقاء الحيوانات على قيد الحياة، أظهرت التجارب تأثير تعتمد على الجرعة من سيسبلاتين(الشكل 5A). ولهذا السبب، نوصي باتباع التعليمات تماما كما هو موضح في هذا البروتوكول ومراقبة معدل بقاء الحيوانات باستمرار كمقياس للاستنساخ، قبل جمع أي مواد. بعد حقن i.p. من 120 ميكروغرام / غرام سيسبلاتين (الشكل 5A، الخط الأحمر) ، لوحظ انخفاض في بقاء حوالي 30٪ من الحيوانات في أول 24 ساعة وانخفض البقاء تدريجيا حتى وصل إلى حوالي 20٪ من الحيوانات الحية في اليوم 5 بعد الحقن ، ثم استقر(الشكل 5A). لم تتأثر سمية سيسبلاتين بجنس الحيوانات ، لأن الذكور والإناث لديهم منحنيات بقاء مماثلة(الشكل 5B).
أظهر تحليل حركية AKI الناجم عن سيسبلاتين زيادة الالتهاب وموت الخلايا في الكلى 24 hpi. واحدة من أسرع الطرق والكمية لتقييم الالتهاب هو تدفق قياس الخلايا ولكن نظرا لعدم وجود أجسام مضادة ضد مستضدات حمار وحشي المتاحة تجاريا لهذه التقنية، من الضروري استخدام خط المعدلة وراثيا مع علامة المناعة. في الوقت الحاضر، يمكن الوصول إلى العديد من خطوط حمار وحشي وضع العلامات على الخلايا المناعية (الجدول 1). يمكن استخدام هذه الخطوط بشكل طري أو في تركيبة ، نظرا لذخيرة كافية للتحليل48،49،50،51،52،53،54،55،56،57،58،59،60. هذا يبسط بشكل كبير تقنية منذ ليس من الضروري أي خطوة حضانة الأجسام المضادة، على العكس من ذلك، بعد عزل الخلايا عن طريق الفصل الميكانيكي، والقراءة المباشرة على السيتومتر ممكن.
كما ذكرنا من قبل ، فإن كلية حمار وحشي ليست فقط جهاز ترشيح الدم مع وظائف الهوستاتيكي ولكن أيضا الموقع التشريحي للهيماتوبيس في البالغين ، أي ما يعادل نخاع العظم في الثدييات33،34،35. بهذه الطريقة عندما نحللها عن طريق قياس التدفق الخلوي من الممكن التفريق بين مجموعات الخلايا المماثلة للدم البشري61،62 (الشكل 6A) ، وهذا يسمح لنا بتحديد مجموعات الخلايا في البداية من حيث الحجم والحبيبة واستبعاد الحطام. في هذه الحالة، استخدمنا خط المعدلة وراثيا يسمى Tg(mpo:GFP)52 الذي يعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) جنبا إلى جنب مع إنزيم myeloperoxidase، الذي هو موجود في العدلات. مع العلم بذلك، كانت استراتيجيتنا البوابة على أساس الفصل الأولي للسكان الحبيبية(الشكل 6B). بعد ذلك ، تم استبعاد خلايا مزدوجة ، لأنها يمكن أن تغير بشكل كبير التحليل وتؤدي إلى استنتاجات غير دقيقة. ومزدوج هو حدث واحد يتكون من 2 جزيئات مستقلة ويمكن استبعادها عن طريق اختيار ارتفاع مبعثر إلى الأمام (FSC-H) مقابل منطقة مبعثر إلى الأمام (FSC-A) مؤامرة الكثافة (الشكل 6C). بعد هذه الخطوة، تم تحديد الخلايا التي عبرت عن علامة الفلورسنت واختيارها(الشكل 6D). وأخيرا، استخرجت الإحصاءات السكانية من التحليل ورسمت كنسبة مئوية من الخلايا(الشكل 6 ه).
واحدة من أبرز خصائص السمية الكلوية سيسبلاتين هو موت الخلايا الأنبوبية10، وتصور هذا بسهولة استخدمنا المقايسة TUNEL للكشف عن موت الخلايا المبرمج. توصي هذه الطريقة باستخدام الخلايا والأنسجة البرية التي تفتقر إلى علامات الفلورسنت ، لأن الفلورسينس الموازي سيتداخل مع التحليل ، في حالة سمك الحمار الوحشي ينصح باستخدام خطوط من النوع البري ، مثل AB أو Tübingen أو TAB أو خط معدل وراثيا مع بروتين فلوري لا يتعارض مع لون تفلور TUNEL. تقنية TUNEL يسمح التحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي أو المجهر. الفحص المجهري لديه ميزة الحفاظ على بنية الأنسجة، مما يسمح لمعرفة الخلايا التي تموت. تحت المجهر الفلوري ، يمكن تمييز النواة الساطعة للخلايا المبرمج بسهولة عن الخلفية. الحيوانات حقن مع سيسبلاتين (الشكل 7B) لديها خلايا ميتة أكثر من السيطرة (الشكل 7A) في 24 hpi. تم إجراء القياس الكمي النهائي مع خيار عداد الخلية من برنامج فيجي وأظهرت إحصائيا أكثر الخلايا الميتة في الكلى التي تعالج سيسبلاتين مما كانت عليه في الضوابط (الشكل 7C)
أظهر البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة كيفية استخدام سيسبلاتين كمحفز ل AKI في سمك الحمار الوحشي البالغ ، وهو مستجيب للجرعة وسريع وموثوق به. استنادا إلى البيانات التي تم الحصول عليها من معدلات البقاء على قيد الحياة وقياس علامات السمية الكلوية للسيسبلاتين بما في ذلك الالتهاب (التي تم اكتشافها عن طريق قياس التدفق الخلوي) وموت الخلايا (التي تم اكتشافها بواسطة فحص TUNEL) ، نقترح هذا النموذج لدراسة السمية الكلوية سيسبلاتين وكذلك للعلاجات المستقبلية في الأمراض المرتبطة ب AKI.
الشكل 1: هيكل ومقارنة الحمار الوحشي والكلى البشرية. أ. (1) منظر الجانبية حمار وحشي الكبار مع الكلى ممثلة في البني الداكن الموجود في الجدار الظهري للأسماك، بين المثانة السباحة (sb) والعمود الفقري. (2) عرض البطين للكلية تظهر الكلية (الأصفر) متصلة القناة جمع (الأزرق). يتم وضع علامة على مناطق مختلفة من الكلى: الرأس (H) والجذع (Tr) والذيل (Ta). (3) التخطيطي الذي يمثل نييفرونات سمك الحمار الوحشي وشرائحها المسماة والملونة لمطابقة المناطق المحفوظة وراثيا مع الكليفرون البشري. ب. (1) منظر برجي لكلية بشرية. (2) التخطيطي الذي يصور كليفرون الإنسان مع شرائح المسمى والملونة. RC: الكلية; معاهدة التعاون بشأن البراءات: أنبوب ملتوية قريبة; توقيت المحيط الهادي: أنبوب مستقيم قريب; TL: طرف رفيع; LH: حلقة من هنل; TAL: سميكة تصاعدي الطرف; DE: القاصي في وقت مبكر; DL: تأخر القاصد; DCT: أنبوبي ملتوية الثنية; CD: جمع القناة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:التصميم التجريبي ل AKI الناجم عن سيسبلاتين. أ. عرض الجانبية والبطينية من حمار وحشي الكبار مشيرا إلى موقف الإبرة أثناء إجراء الحقن. تخترق الإبرة بزاوية 20-30 درجة من البطن ويتم إدخالها ببطء بالتوازي مع الجدار البطني وتجنب ثقب الأحشاء. باء - ال 20 في المائ التصميم التجريبي للكيمياء الكيمياء الناجمة عن سيسبلاتين: (1) حقن سيسبلاتين 120 ميكروغرام/غرام لكل في اليوم صفر. (2) قبل محاولة الخطوة 3، ينصح بمراقبة بقاء الأسماك بعد الحقن من اليوم الأول حتى اليوم العاشر. (3) تشريح الكلى بعد يوم واحد من حقن سيسبلاتين لمزيد من تقنيات المعالجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: آليات تدفق الخلايا وتقنيات TUNEL. أ. نظرة عامة على مقياس التدفق الخلوي: يركز تعليق الخلايا بشكل هيدروديناميكي على خط واحد بواسطة سائل غمد ، مما يؤدي إلى مرور الخلايا واحدا تلو الآخر أمام شعاع الليزر. تقيس أجهزة الكشف الأمامية والجانبية التشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC) وفلورة الخلايا. باء - ال 20 في المائ مبدأ المقايسة TUNEL. محطة deoxynucleotidyl transferase (TdT) يتوسط إضافة dUTP الفلورسنت ملحوظ إلى 3'-OH ينتهي من الحمض النووي مجزأة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:مخطط انسيابي للتقنيات الممثلة. أ. مخطط انسيابي يوضح الخطوات الواجب اتباعها عند اختيار تحليل أنسجة الكلى من خلال قياس التدفق الخلوي (البرتقالي) أو TUNEL (الأزرق)، عند تحفيز AKI عن طريق حقن سيسبلاتين (رمادي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: رصد البقاء على قيد الحياة من الأسماك حقن سيسبلاتين. أ. معدل البقاء على قيد الحياة من جرعات مختلفة من حقن سيسبلاتين (25 - 50 - 112.5 - 120 ميكروغرام / غرام). سجل رتبة (مانتل كوكس) اختبار ، ** ع < 0.01. باء - ال 20 في المائ معدل البقاء على قيد الحياة من الذكور مقابل الإناث حقن مع 120 ميكروغرام / غرام سيسبلاتين. سجل رتبة (مانتل كوكس) اختبار ، *** ع < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: بوابة استراتيجية لخط حمار وحشي المعدلة وراثيا. أ. كثافة قطعة من خلايا الكلى الكبار حمار وحشي، يتم فصل السكان حسب الحجم (FSC-A) والحبيبة (SSC-A). يتم اختيار مجموعات سكانية مختلفة من قبل البيضاوي الملونة / الدوائر. الوردي: إريثرويد; أسود: اللمفاوي; الأصفر: السلائف؛ الأحمر: الخلايا الحبيبية. باء - ال 20 في المائ مؤامرة كثافة منطقة مبعثر الجانب (SSC-A) ومنطقة مبعثر إلى الأمام (FSC-A) لاختيار السكان الحبيبية في الكلى. جيم - الدوائر التي لا يمكن أن مؤامرة كثافة من الأمام مبعثر عالية (FSC-H) وإلى الأمام منطقة مبعثر (FSC-A) لاختيار السكان singlets داخل بوابة الحبيبية. د- مؤامرة كثافة منطقة مبعثر إلى الأمام (FSC-A) و FITC-A:MPO لاختيار الخلايا الإيجابية mpo:GFP (العدلات) في الكلى. ويعتبر السكان إيجابية حوالي 103 على، من كثافة الفلورية. هاء - ال هاء الرسم البياني للنسبة المئوية للخلايا الإيجابية mpo:GFP (العدلات) في السيطرة مقابل سيسبلاتين، 24 hpi. غير مدفوعة ر-اختبار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: اختبار TUNEL من الأسماك حقن سيسبلاتين. أ. صور دقيقة من الكلى الكبار ثابتة 24 ساعة بعد 120 ميكروغرام / غ حقن سيسبلاتين. يتم حقن الضوابط مع 0.9٪ NaCl. TUNEL الخلايا الموجبة (الخلايا المبرمج) ملطخة باللون الأحمر (الأسهم البيضاء). يستخدم DAPI (الأزرق) كطين مضاد نووي. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. باء - ال 20 في المائ الرسم البياني الذي يبين القياس الكمي لعدد الخلايا الميتة في الكلى حسب الحقل 20x. غير مدفوع ر-اختبار، * ص < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
خط معدل وراثيا | نوع الخلية المسمى | مراجع |
TG(spi1:EGFP)pA301 | خلايا النخاع | وارد وآخرون 200348 |
TG(zpu1:GFP) | خلايا النخاع | هسو وآخرون 200449 |
Tg(mhc2dab:GFP)sd6 | مونوسيت | ويتامر وآخرون 201150 |
TG(lysC:DsRED2) | العدلات | قاعة وآخرون 200751 |
TG(mpo:GFP) | العدلات | ماتياس وآخرون 200652 |
Tg(mpeg1:mCherry) | الضامة | إليت وآخرون 201153 |
Tg(mpeg1:Dendra2) | الضامة | هارفي وآخرون 201354 |
TG(lck:GFP) | الخلايا التائية | لانغينو وآخرون 200455 |
TgBAC (إيكاروس:EGFP) | الخلايا التائية | باجوغلي وآخرون 200956 |
TG(rag1:GFP) | الخلايا التائية | جيسن وآخرون 199957 |
TG(rag2:GFP) | الخلايا التائية | جيسن وآخرون 200158 |
TG (CD79: GFP) | خلايا B | ليو وآخرون 201759 |
Tg(CD45:DsRed) | الكريات البيض | برتراند وآخرون 200860 |
الجدول 1: خطوط زيبرافيش المعدلة وراثيا للخلايا المناعية. الجدول استئناف أسماء خطوط مراسل حمار وحشي مع نوع كل من الخلايا المناعية المسمى والمقالات المرجعية حيث تم بناؤها. مزيج من هذه الخطوط حمار وحشي يمكن أن توفر إمكانيات جديدة لاختيار الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي.
استمر انتشار أمراض الكلى في الازدياد في جميع أنحاء العالم، ليصبح مشكلة صحية عامة عالمية تؤثر على الملايين من الناس63. إيجاد وسيلة لعلاج المصابين الكلى الأفراد ذات أهمية قصوى، فضلا عن فهم المزيد عن المسببات والتقدم. وقد تم استخدام العديد من الدراسات نماذج حيوانية لفهم الضرر الكلوي. وقد درس الكلى حمار وحشي (الشكل 1) لسنوات في علم الأحياء التنموية والبحوث الإصابة بسبب قدراتها الذاتية تجديد والتشابه الجيني29,64. هنا، نقدم نموذج AKI جديد في حمار وحشي الكبار باستخدام خصائص سيسبلاتين كعامل nephrotoxic، بالتفصيل خطوات لتحقيق رد فعل سريع وحاد مع الضرر مرئية في أقرب وقت 24 hpi (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، هنا نشرح اثنين من التقنيات التي من شأنها أن تساعد على تقييم تلف الأنسجة بعد حقن سيسبلاتين، وتدفق قياس الخلايا و TUNEL (الشكل 3).
نماذج AKI الحالية في حمار وحشي الكبار تشمل حقن i.p. من جنتاميسين الذي يسبب أضرارا واسعة النطاق في تدمير الكلية والتبول، وأحداث تولد النيونفروجين تبدأ من اليوم 5، ويتم الانتهاء من التجديد من قبل 21 يوما بعد الحقن65. من ناحية أخرى ، تم إنشاء نموذج لإصابة الكلى الحادة المرتبطة بالإنتان (S-AKI) من خلال العدوى مع Edwardsiella tarda، نظرا لزيادة التعبير عن علامات AKI بشكل كبير ، مثل بروتين ربط عامل النمو الشبيه بالإنسولين -7 (IGFBP7) ، ومثبط الأنسجة من metalloproteinases 2 (TIMP-2) ، وجزيء إصابة الكلى -1 (KIM-1) ، في اليرقات وسمك الحمار الوحشي البالغ66. ومن المعروف أن حمار وحشي لكونه عالي الإنتاجية للبحث عن العوامل العلاجية وهذا يشمل استخدام البروبيوتيك والأيض المشتقة من الميكروبيوتا لدراسة وظائف الكلى وتجديد67. ومع ذلك، يمكن أن تؤثر النماذج المتاحة بشكل مباشر على نتيجة هذه العلاجات. وهكذا، أنشأنا طريقة مختلفة للحث على AKI في حمار وحشي الكبار (الشكل 4)،وذلك باستخدام سيسبلاتين كعامل معروف كلي البروتين التي لن يكون لها آثار معروفة مباشرة على ميكروبيوتا الأسماك، كما هو الحال مع نموذج جنتاميسين لكونه مضاد حيوي، أو العدوى مع E. tarda، لكونها نموذج الإنتان. ومع ذلك ، في نفس الوقت الذي كنا نطور بروتوكول سيسبلاتين لدينا ، استكشفت مجموعة أخرى أيضا الآثار الكلية للسيسبلاتين في سمك الحمار الوحشي البالغ ، وتبسيط الجرعة إلى 10-20-30 ميكروغرام لكل68. على الرغم من أنها أظهرت أيضا تأثير سيسبلاتين تعتمد على الجرعة في البقاء على قيد الحياة، ونحن نوصي الحذر في استخدام كمية واحدة من سيسبلاتين لجميع الأسماك، كما حمار وحشي من نفس العمر يمكن أن يكون لها أحجام مختلفة جدا والوزن وهذا يمكن أن تحفز الاختلافات في النتائج69،70. نعتقد أنه من المهم ضبط الجرعة على الوزن المقابل للحيوان ، كما هو الحال في الفئران وهذه الدراسة.
في تجاربنا مع حمار وحشي الكبار، أظهرت سيسبلاتين تأثير الجرعة والاستجابة. وقد تصور هذا من خلال رصد معدل بقاء الحيوانات بعد حقن سيسبلاتين (الشكل 5). استخدمنا البقاء على قيد الحياة كوسيلة لتقدير شدة جرعة سيسبلاتين وليس كمقياس للسمية الكلوية ، حيث لا توجد علامة مادية أخرى مرئية خلال وقت الرصد. هذا يمكن أن تكون قابلة للمقارنة مع القوارض، والتي يمكن تعديل شدة إصابة الكلى من قبل جرعة وتواتر حقن سيسبلاتين15،وتحقيق جرعات قاتلة مع تركيزات أعلى من سيسبلاتين71. وينظر أيضا الميت في الأيام التالية في نموذج اليرقات من سيسبلاتين72. منذ كان هدفنا للحث على إصابة حادة في غضون أيام قليلة، اخترنا جرعة 120 ميكروغرام /غرام من سيسبلاتين كما هو ممكن لمراقبة تلف الكلى 24 ساعة بعد الحقن، ومع ذلك، يمكن تعديل هذا اعتمادا على أهداف الدراسة.
في البشر، يتم تشخيص سريريا AKI عن طريق انخفاض معدل الترشيح الكبيبات (GFR)، وارتفاع الكرياتينين المصل، والنيتروجين اليوريا في الدم3. في حمار وحشي، ذخيرة نماذج AKI يتضمن بعض النماذج الجينيةالمشروطة 73،74 وبعض النماذج ذات الصلة بالمخدرات65،72، ولكن كما لا يمكن قياس بعض المعلمات الوظيفية AKI على حمار وحشي بسبب صعوبات تقنية(على سبيل المثال، جمع الدم)، تعتمد معظم الأبحاث تقنيات مورفولوجية وبصرية لمراقبة ملامح AKI1،75 مثل دراستنا.
في القوارض ، يدخل cisplatin الخلايا الظهارية في الأنابيب القريبة وال البعيدة ، داخل الخلية يخضع لتنشيط التمثيل الغذائي ويصبح تفاعليا للغاية يتصرف على العضيات الخلوية ويحفز على تغييرات في بنية الخلية. هذه التغييرات يمكن أن تحفز موت الخلايا المبرمج وautphagy وحتى نخر، بجرعات عالية جدا. ردا على هذا الضرر ، يتم إطلاق العديد من السيتوكينات ويتم تجنيد الكريات البيض مما يؤدي إلى التهاب ويؤثر على وظائف الجهاز15. وهذا يسلط الضوء على أهمية تقييم نوع الخلايا التي يمكن العثور عليها في الكلى المصابة، كمقيمين أو خلايا مناعية مخترقة. هنا أظهرنا كيفية تقييم هذا عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وذلك باستخدام خطوط مراسل المناعة المعدلة وراثيا المتاحة في الوقت الحاضر(الجدول 1). سيسبلاتين زيادة النسبة المئوية للنوات(mpo:GFP الخلايا الإيجابية) في الكلى 24 ح بعد الحقن (الشكل 6). في حالة حمار وحشي، والكلى هي مكانة من HSCs التي تؤدي إلى أنواع خلايا الدم المختلفة. ومع ذلك ، فإن العديد من المحببات والكواعم عادة ما تنتشر في الدم. في مثالنا، استخدمنا خط mpo:GFP المعدل وراثيا الذي يعبر عن GFP تحت مروج myeloperoxidase من العدلات52. أظهرت الدراسات الأصلية للخط المعدل وراثيا mpo:GFP التعبير عن myeloperoxidase في حالات مختلفة من نضوج العدلات76 ولكن استراتيجيتنا البوابة ركزت على كسر المحببة التي تضم الخلايا الناضجة القادمة من الدم52، وبهذه الطريقة تحليلنا تشمل الخلايا المتسللة وليس الخلايا المقيمة. هذا مهم للنظر عند عزل السكان الخلية المطلوبة.
كما هو موضح أعلاه ، فإن موت الخلايا المبرمج هو العلامة الأكثر كلاسيكية ل AKI المرتبط ب cisplatin. هنا، أظهرنا بروتوكول بسيط لتوطين الخلايا الميتة من خلال اختبار TUNEL. حقن سيسبلاتين زيادة عدد الخلايا المبرمج 24 hpi (الشكل 7). ويمكن قياس ذلك بسهولة عن طريق عد الخلايا الميتة مباشرة من الأنسجة. ومع ذلك، لتحديد الموت الخلية محددة استخدام الأجسام المضادة ضد الخلية المطلوبة(على سبيل المثال، خلايا أنبوبية)، أو استخدام خط مراسل المعدلة وراثيا يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع هذه التقنية. بالمقارنة مع نموذج يسببه جنتاميسين من AKI, سيسبلاتين ويبدو أن نموذجا أكثر شدة, منذ كان أعلى جنتاميسين موت الخلايا المبرمج في اليوم الثالث بعد الحقن65.
على الرغم من وجود مجموعة متنوعة من الآثار الجانبية, سيسبلاتين لا يزال يستخدم على نطاق واسع في علاج السرطان, بسبب فعاليته ضد أنواع مختلفة من السرطان, بما في ذلك سرطان, أورام الخلايا الجرثومية, الأورام اللمفاوية, وsarcomas77. يحدث السمية الكلوية في ثلث المرضى في العلاج مع سيسبلاتين10، وبالتالي فإن البحث عن الاستراتيجيات التي يمكن أن تقلل من هذا التأثير وزيادة إعادة التشتيت أمر حتمي. نحن نعتقد أن الأساليب والتقنيات الواردة في هذه المخطوطة ستساعد على توضيح آليات إصابة الكلى وإيجاد أهداف علاجية يمكن أن تكون ضرورية لتحسين نوعية حياة الأفراد الذين يعانون من مضاعفات كلوية ، في الغالب تلك المتعلقة باستخدام سيسبلاتين.
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
وقد دعم هذا البحث صندوق أمبارو à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP (2015/21644-9؛ 2017/05264-7)؛ 2017/05687-5؛ 2018/20722-4)، كونسيلهو ناسيونال دي ديسينفولفيمنتو سينتيفيكو إي تينولوغيكو (CNPq) وكوارديناساو دي أبيرفيسوامنتو دي بيسال دي نيفل سوبيريور (CAPES)، الرمز المالي 001. نشكر المتعاونين لدينا في مختبر ماريا ريتا دوس سانتوس إي باسوس بوينو ومرفق زيبرافيش التابع لقسم علم الوراثة وعلم الأحياء التطوري، في معهد العلوم البيولوجية في جامعة ساو باولو. نشكر كريستيان نافا دي سوزا بريدا وتيريزا راكيل دي أوليفيرا رامالهو على التعليقات والاقتراحات المتعلقة بالمخطوطة. نحن نقدر ونشكر مارسيو فيلار مارتينز، من فريق الوسائط المتعددة في معهد العلوم الطبية الحيوية، على تسجيل هذا الفيديو وطبعته وإنتاجه.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1x PBS | Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water | ||
31 G 1.0 cc insulin syringe | BD Plastipak | 990256 | Needle: BD Precision Glide 300110 |
3.5 L Fish tank | Tecniplast | Part of the aquactic system | |
6 well plate | Corning | 351146 | |
10 mM Tris/HCl | Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000) | ||
50 ml Falcon tube | Corning | 352070 | |
2-3% Agarose | Invitrogen | 16500-500 | Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve. |
2% FBS | Gibco | 12657-09 | Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS |
4% Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 °C |
50% Ethanol | Made by diluting 100% ethanol in distilled water | ||
70% Ethanol | Made by diluting 100% ethanol in distilled water | ||
90% Ethanol | Made by diluting 100% ethanol in distilled water | ||
100% Ethanol | Synth | 00A1115.01.BJ | |
100% Xylene | Synth | 00X1001.11.BJ | |
Cell strainer 40 µm | Corning | 431750 | |
Cisplatin | Blau Farmacêutica | 16020227 | C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature. |
Cork board sheet | Obtained from local stationary store | ||
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Stock solution 20 mg/ml dissolved in water |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Flow cytometry tubes | Corning | 352052 | |
Glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
Histology cassette | Ciencor | 2921 | |
Immuno stain chamber | Ciencor | EP-51-05022 | |
Incubator | NAPCO | 5400 | Set to 37 °C |
Insect pins | Papillon | Model micro15x20 | |
In Situ Cell Death Detection Kit | Roche Diagnostics | 12156792910 | |
Metal mold | Leica Biosystems | 3803081 | |
Micropipette 200-1000 µL | Eppendorf | Use 1 mL tips | |
MS-222 (Tricaine) | Fluka Analytical | A5040-25G | |
NaCl 0.9% | Synth | C1060.01.AG | Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water |
Nail polish | Prefer transparent | ||
Neubauer chamber | Precicolor HGB | ||
Pasteur plastic pipet | United Scientific Supplies | P31201 | |
Paraplast | Sigma-Aldrich | P3558 | |
Petri dish | J.ProLab | 0307-1/6 | 60 and 100 mm |
Plastic spoon | Obtained from local store | ||
Proteinase K | New England BioLabs | P8102 | Diluite from stock 20 mg/ml |
Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Scalpel blade | Solidor | ||
Sponge | Obtained from local store | ||
Trypan Blue | Cromoline | 10621/07 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Cytometer | BD Biosciences | FACSCanto II | |
Fluorescence Stereoscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
Fluorescence Microscope | Zeiss | AxioVert.A1 | |
Microtome | Leica | Jung Supercut | |
Scale | Ohaus Corporation | AR2140 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved