Modèle aigu de lésion rénale induit par le cisplatine chez le poisson zèbre adulte

Résumé

Ce protocole décrit les procédures pour induire des lésions rénales aiguës (AKI) chez le poisson zèbre adulte utilisant le cisplatine comme agent néphroxique. Nous avons détaillé les étapes pour évaluer la reproductibilité de la technique et deux techniques pour analyser l’inflammation et la mort cellulaire dans le tissu rénal, la cytométrie d’écoulement et TUNEL, respectivement.

Résumé

Le cisplatine est couramment utilisé comme chimiothérapie. Bien qu’il ait des effets positifs chez les personnes traitées par le cancer, le cisplatine peut facilement s’accumuler dans le rein en raison de son faible poids moléculaire. Une telle accumulation provoque la mort des cellules tubulaires et peut induire le développement de lésions rénales aiguës (AKI), qui se caractérise par une diminution rapide de la fonction rénale, des lésions tissulaires et de l’infiltration des cellules immunitaires. S’il est administré à des doses spécifiques cisplatine peut être un outil utile comme un inducteur AKI dans les modèles animaux. Le poisson zèbre est apparu comme un modèle intéressant pour étudier la fonction rénale, la régénération rénale et les blessures, car les structures rénales conservent les similitudes fonctionnelles avec les mammifères. Le poisson zèbre adulte injecté avec du cisplatine montre une diminution de la survie, la mort des cellules rénales et une augmentation des marqueurs inflammatoires après 24 h après injection (hpi). Dans ce modèle, l’infiltration des cellules immunitaires et la mort cellulaire peuvent être évaluées par cytométrie d’écoulement et analyse TUNEL. Ce protocole décrit les procédures pour induire l’AKI chez le poisson zèbre adulte par injection intraperitoneal de cisplatine et démontre plus tard comment recueillir le tissu rénal pour le traitement de cytométrie de flux et l’analyse de tunel de mort cellulaire. Ces techniques seront utiles pour comprendre les effets du cisplatine en tant qu’agent néphrotoxique et contribueront à l’expansion des modèles AKI chez les poissons zèbres adultes. Ce modèle peut également être utilisé pour étudier la régénération rénale, dans la recherche de composés qui traitent ou préviennent les lésions rénales et pour étudier l’inflammation dans l’AKI. En outre, les méthodes utilisées dans ce protocole amélioreront la caractérisation des lésions tissulaires et de l’inflammation, qui sont des cibles thérapeutiques dans les comorbidités associées aux reins.

Introduction

Les reins sont responsables de plusieurs fonctions physiologiques importantes qui maintiennent l’homéostasie, telles que la filtration de sang, l’enlèvement des résidus excédentaires, et la régulation des concentrations^{d’ion 1}. Les dommages du tissu rénal peuvent mener à une condition hétérogène appelée dommages aigus de rein (AKI), qui médicalement est décrite comme diminution rapide de la fonction rénale provoquée par la destruction et la mort des cellules épithéliales tubulaires, des dommages endothéliales de cellules, et de l’infiltration de leukocyte ^2,3. L’AKI est une condition qui devrait se produire dans 8 à 16 % des admissions à^{l’hôpital 4}, avec un taux de mortalité élevé qui varie de 20 à 50 % dans l’unité de soins intensifs (USI)⁵. Cette maladie est associée à un séjour accru à l’hôpital et à une utilisation considérable des ressources^{financières 5}. Les facteurs étiologic incluent la déshydratation, le choc, les infections, la septicémie, la maladie cardio-vasculaire, et les drogues néphrotoxic^6. La néphrotoxicité est définie comme une lésion rénale induite par les drogues, causant des effets comme AKI, tubulopathies, et glomerulopathies^7. La néphrotoxicité touche les deux tiers des patients aux soins intensifs, car environ 20 % des médicaments prescrits aux soins intensifs sont considérés comme néphroxiques^8,9, ce qui comprend les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), les antibiotiques comme la vancomycine et l’aminoglycosides, et les agents chimiothérapeutiques comme le méthotrexate et le cisplatine⁷. Le cisplatine est l’un des agents chimiothérapeutiques les plus puissants et les plus courants, utilisés dans le traitement des tumeurs solides, telles que la tête et le cou, les testicules, les ovaires et^{la vessie 10.} Dans le rein, le cisplatine est intériorisé dans le tube alambiqué proximal (PCT) par le transporteur cationic organique 2 (OCT-2) et dans les concentrations élevées se lie à l’ADN déclenchant des voies de mort cellulaire^7,10,11,12. L’accumulation de ce médicament dans le rein contribue à la néphrotoxicité avec la mort et l’inflammation¹³. Cet effet secondaire préjudiciable affecte énormément la vie et le pronostic d’un tiers des patients atteints de cancer subissant un traitement au cisplatine, il est donc impératif de la recherche de nouvelles thérapies qui peuvent abaisser la néphrotoxicité sans perdre l’effet tuer sur les cellules cancéreuses¹⁰.

En raison de cet effet néphroxique, le cisplatine est couramment utilisé comme inducteur d’AKI dans les modèles animaux expérimentaux, tels que décrits vers l’avant. Chez les rongeurs, le premier modèle AKI induit par le cisplatine a été rapporté en 1971^14, mais à l’heure actuelle, de nombreux protocoles différents ont émergé en utilisant les effets dépendants de la dose et cumulatifs du cisplatine¹⁵. Ainsi, selon la posologie et le nombre d’applications, différentes catégories de gravité des lésions rénales peuvent être^{induites 16,17,18,19,20,21}. La méthode la plus fréquente consiste en une injection intraperitoneal (i.p.) d’une dose de cisplatine suivie de l’euthanasie dans les jours suivants. Dans ce protocole classique, une seule dose néphrotoxique élevée de cisplatine (10-13 mg/kg chez la souris et/ou 3-8 mg/kg chez les rats) induit des changements histologiques graves, tels que la perte de bordure de brosse et de débris cellulaires à l’intérieur du lumen tubulaire, quelques jours après l’injection de cisplatine. La sévérité des changements histologiques dépend de la dose, et des signes de régénération sont observés 7 jours après injection de cisplatine^16,17.

Bien que les modèles de rongeurs soient bien établis, nous avons décidé de profiter des caractéristiques d’un autre vertébré, en concentrant nos études sur le poisson zèbre (Danio rerio). Ce poisson a été largement utilisé pour la modélisation des maladies humaines, en raison de sa petite taille, fertilisation externe, taux de reproduction élevés, développement rapide, transparence des embryons et des larves, faible coût d’entretien, anatomie similaire aux mammifères (à quelques exceptions près), capacité élevée de régénération des tissus, comportement social, 70% de similitude génétique avec les humains et 84% avec les gènes associés aux maladies humaines²². Streisinger et coll.^23,24,^{25 ont}commencé les études avec le poisson zèbre qui a confirmé la praticabilité de l’utilisation de cet organisme modèle pour l’analyse génétique du développement des vertébrés. Dans la recherche rénale, le poisson zèbre a émergé non seulement dans les études développementales mais également comme outil génétique dans la recherche de nouveaux gènes liés aux conditions^{rénales 26}. En outre, la capacité de régénération sans formation de cicatrices et la capacité de générer des néphrons à travers leur vie, appelée néonephrogenèse, font du poisson zèbre un modèle animal clé pour la recherche^{sur la régénération 27,28}. En outre, la disponibilité de modèles expérimentaux pour différentes maladies rénales, y compris les lésions rénales aiguës et chroniques, démontrent la polyvalence de cet organisme^{expérimental 26,29}. Comme chez les mammifères, les progéniteurs rénaux du poisson zèbre sont dérivés du mésoderm intermédiaire. Ces progéniteurs rénaux génèrent les pronephros qui se développeront plus tard aux mésonephros, qui seront maintenus comme organe mûr jusqu’à^{l’âge adulte 29,30.}

Le rein adulte de poisson zèbre est situé sur la paroi dorsale du corps, entre la vessie natatoire et l’épine dorsale²⁹. D’un point de vue ventral, le poisson zèbre peut être segmenté en trois régions (figure 1A):tête (H), tronc (Tr), et queue (Ta)²⁹. Tout comme les mammifères, le poisson zèbre a les néphrons comme unités fonctionnelles du rein, qui sont divisés en segments tubules (Figure 1A):corpuscule rénal (RC), tubule alambiqué proximal (PCT), tubule droit proximal (PST), distal précoce (DE), distal tardif (DL) et la collecte du conduit (CD)²⁹. Zebrafish partage la conservation génétique et les similitudes structurelles avec les néphrons humains (Figure 1B) mais manque de certaines conformations telles que le tubule intermédiaire, également connu sous le nom de boucle de Henle (LH)^29,31. Les poissons d’eau douce comme le poisson zèbre sont normalement entourés d’un milieu à très faible osmolarité, pour cette raison, ils ont tendance à être hyperosmotiques et dépendent des branchies, de la peau aux premiers stades et du rein pour réguler l’osmolarité et l’excrétion^{de l’eau 32}. La filtration du sang de l’aorte dorsale par les pronephros commence autour de 48 h après fécondation (hpf)^33,34. Le rein du poisson zèbre n’est pas seulement un organe métabolique d’excrétion de déchets, mais fonctionne également comme un organe hématopoïétique de 4 jours après la fécondation (dpf) à l’âge adulte et il est équivalent à la moelle osseuse chez les mammifères³⁵. Au cours du développement, les cellules souches hématopoïétiques (HSC) ensemenceront le rein, s’auto-rénoveront et généreront des lignées myéloïdes, érythroïdes et lymphoïdes, maintenant des facteurs de transcription, des molécules de signalisation et des programmes génétiques fortement conservés^{avec les mammifères 36,37}. Des études ont révélé que la plupart des cellules érythroïdes, thrombocytiques, myéloïdes et lymphoïdes du système immunitaire humain sont présentes chez le poisson^{zèbre 37,38}. Les caractéristiques uniques de cet animal et les caractéristiques conservées avec le rein humain ont rendu cet organisme modèle avantageux dans la recherche de la fonction rénale, des dommages et de la régénération.

Bien que le rein du poisson zèbre soit bien étudié et que certains modèles d’AKI soient déjà disponibles dans la larve et le poisson zèbre^{adulte 28}, au moment de l’établissement de ce protocole, il n’y avait aucune preuve d’un modèle AKI non antibiotique induit chimiquement chez le poisson zèbre adulte. En outre, notre laboratoire se concentre sur l’essai des bactéries probiotiques et des composés dérivés du microbiote pour étudier la régénération et les dommages rénaux, nous avons donc concentré nos efforts dans la création d’un nouveau modèle aki induit par le cisplatine chez les poissons adultes. L’article vidéo présenté dans ce manuscrit démontre les procédures d’un nouveau modèle d’induction de l’AKI à l’aide d’une injection de 120 ug cisplatine par g d’animal (120 μg/g) (Figure 2A). Cette dose a d’abord été basée sur des études de l’AKI induites par le cisplatine dans les modèles murins qui ont fait environ 10 mg/kg (équivalent à 10 μg/g)^14,15,16,17, cependant, cette dose n’était pas suffisante pour induire des lésions rénales liées à la néphrotoxicité (données non montrées). Ainsi, nous avons augmenté la dose à ceux utilisés dans cette étude (Figure 2B). Nos travaux ont indiqué un effet dose-dépendant du cisplatine dans le taux de survie après injection avec l’induction des dommages de tissu de rein 24 hpi comme montré par la perte de la structure tubulaire, l’infiltration inflammatoire accrue, et le taux élevé de mort cellulaire. Ici, nous décrivons deux techniques pour analyser le développement de l’AKI cisplatine-induit : cytométrie de flux, pour analyser l’infiltration cellulaire, et TUNEL, pour mesurer la mort cellulaire. La cytométrie du flux est une technologie qui mesure les caractéristiques physiques (taille et granularité) et chimiques (composés fluorescents) des cellules. À l’intérieur du cytomètre, la suspension cellulaire traverse un fluide de gaine qui organise les cellules en une seule ligne, leur permettant de passer à travers un faisceau laser une cellule à la fois (Figure 3A). Un détecteur devant le faisceau lumineux mesurera le Scatter avant (FSC), qui est corrélé avec la taille des cellules, et les détecteurs sur le côté mesureront le Scatter latéral (SSC) qui est corrélé à la granularité des cellules. D’autres détecteurs mesureront la fluorescence des particules, des protéines fluorescentes, ou des cellules anticorps-étiquetées^39,40. Comme les anticorps commerciaux pour le poisson zèbre sont rares de nos jours, l’utilisation de reporters d’animaux et de biomarqueurs fluorescents permet d’améliorer cette analyse et d’identifier diverses populations^{cellulaires 41,42,43}. Un autre outil utilisé dans ce protocole était le terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick End Labeling (TUNEL) essai. L’analyse TUNEL est une méthode de détection de l’apoptose à un stade avancé qui repose sur la capacité du TdT d’identifier l’ADN fragmenté et de l’étiqueter avec des désoxynucléotides marqués avec un marqueur fluorescent qui peut plus tard être visualisé et quantifié par microscopie⁴⁴ (Figure 3B). Considérant que l’une des caractéristiques les plus frappantes de l’AKI est l’induction de l’apoptose dans les cellules rénales tubulaires³, cette technique est extrêmement avantageuse car elle peut être analysée par cytométrie de flux et/ou microscopie.

Les approches présentées dans cet article permettent l’observation du statut AKI et offrent un nouveau modèle aigu pour étudier les troubles de l’AKI qui peuvent être utiles pour la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques dans l’AKI liée au cisplatine.

Protocole

Les procédures décrites dans ce protocole ont déjà été approuvées pour être utilisées dans le modèle du poisson zèbre par le Comité d’éthique de l’utilisation des animaux de l’Institut des sciences biomédicales de l’Université de São Paulo.

1. Induction AKI par injection intraperitoneal cisplatine

1. Préparez la solution de travail cisplatine en diluant la solution de stock à 850 μg/mL dans 0,9% NaCl. Gardez à température ambiante, à l’abri de la lumière.
   MISE EN GARDE : Le fabricant recommande la manipulation du cisplatine avec l’équipement de protection individuelle (PPE) comprenant des lunettes, des gants, et le manteau de laboratoire. Rangez la solution de stock à température ambiante, à l’abri de la lumière.
2. Préparer 150 mg/L MS-222 (Tricaine) anesthésique dans l’eau du système⁴⁵. Anesthésier le poisson zèbre adulte (5-9 mois) par immersion pendant environ 1-2 min.
   REMARQUE : Les poissons efficacement anesthésiés doivent être irresponsables au toucher. Pour tester une anesthésie efficace, appuyez doucement sur la nageoire caudale pour observer la réaction.
   ATTENTION: Tricaine est un irritant pour la peau et les yeux, utiliser PPE pour manipuler.
3. À l’aide d’une cuillère en plastique, transférer le poisson sur une surface absorbante, comme des serviettes en papier, pour enlever l’excès d’eau autour du corps. Ensuite, avec la cuillère en plastique transférer le poisson dans une boîte de Pétri sur une échelle et peser le poisson. Prenez note du poids du poisson car il sera nécessaire pour le calcul de la dose.
   REMARQUE : L’absorption de l’excès d’eau des poissons empêche la surestimation du poids de l’animal, ne pas trop sécher car elle est préjudiciable au poisson.
4. Pour obtenir la dose finale de 120 μg/g de poids, diviser le μg de la dose finale (120 μg) par μg de la solution de travail cisplatine (850 μg) et convertir ce nombre en microlitres (μL) en multipliant pendant 1000, pour obtenir le volume de 120 μg de cisplatine (141,2 μL). Ensuite, multipliez ce nombre (141,2 μL) pour le poids du poisson (g) pour obtenir le volume final à injecter.
5. À l’aide d’une cuillère en plastique, transférer le poisson sur une éponge humide avec une petite coupe pour le tenir, le côté ventral vers le haut. L’éponge doit être mouillée avec de l’anesthésique dans l’eau du système.
6. Remplissez une seringue d’insuline de 31 G 1,0 mL avec le volume calculé de solution de travail de cisplatine.
7. Insérez l’aiguille dans la partie intraperitoneal de l’animal près de la nageoire pelvienne, à un angle peu profond pour éviter de percer les viscères (figure 2A). Injectez ensuite lentement la solution.
8. Après injection placer le poisson dans un réservoir pour récupérer de l’anesthésie. Surveillez le poisson à la recherche de signes de rétablissement normal(p. ex., mouvements de natation, mouvements operculaires).
   REMARQUE : L’animal doit récupérer dans les 3 à 5 minutes qui viennent. Si nécessaire, stimulez le poisson en le déplaçant avec une cuillère en plastique, une pipette en plastique Pasteur, ou en le mettant près d’un tuyau avec des bulles.
9. Pour les poissons de contrôle, effectuer la même procédure en injectant une solution de 0,9% NaCl. Utilisez le même calcul suivant la proportion de poids corporel : le volume à injecter sera de 141 μL multiplié par le poids du poisson (g).
10. Surveiller la survie des poissons au moins deux fois par jour dans les jours suivants (figure 2B).

2. Isolement rénal et traitement tissulaire pour la cytométrie du flux des cellules immunitaires

1. Pour cette procédure, utilisez des animaux transgéniques marqués fluorescents par cellules immunitaires(p. ex.,Tg (mpo:GFP)).
2. Après 24 hpi de 120 μg/g de cisplatine, euthanasier les animaux par choc hypothermique (refroidissement rapide).
   REMARQUE : Il a été démontré que le choc hypothermique est plus efficace que la méthode d’euthanasie que le surdosage de MS-222. Le choc hypothermique est moins stressant, rapide, cohérent et plus sûr pour le personnel que l’utilisation de MS-222, a^{déjà décrit 46,47}.
3. Dans un réservoir de passage extérieur préparer l’eau glacée dans un rapport de 5:1 de glace à l’eau du système, mettre le réservoir intérieur avec un écran sur la glace, attendre jusqu’à ce que l’eau atteint 2-4 °C.
   REMARQUE : Les poissons ne devraient pas être en contact direct avec la glace, car cela peut causer des brûlures thermiques et de la douleur.
4. Transférer l’animal dans l’eau glacée, attendre au moins 10 minutes jusqu’à ce qu’il y ait perte d’orientation et pas de mouvement operculaire.
5. À l’aide d’une cuillère en plastique, déposer le poisson sur du papier absorbant pour sécher l’excès d’eau.
6. Transférer le poisson dans une plaque de dissection agarose de 3 % et le prendre sous un stéréoscope avec la lumière supérieure. Avec des ciseaux, décapiter les poissons en faisant une coupe rapide juste derrière les yeux, et enlever la tête.
7. Avec des ciseaux fins faire une coupe du côté ouvert au cloaque et enlever les organes internes avec des forceps fins.
8. Utilisez des épingles à insectes pour pincer les côtés des parois du corps pour ouvrir la carcasse et exposer le rein attaché à l’épine dorsale.
9. Détachez le rein avec des forceps fins et placez l’organe dans une plaque de puits 6 avec une solution froide de 1x PBS/2% FBS. Restez sur la glace.
10. Ramasser le tissu à l’intérieur d’une pipette en plastique Pasteur et passer le tissu à travers une passoire cellulaire de 40 μm sur un tube de 50 mL, en le macérant doucement avec un piston de seringue.
11. Lavez-les deux fois avec 1 mL de 1x PBS/2% FBS et recueillez les cellules dans un tube de 50 mL.
12. Cellules centrifugeuses à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
13. Ramassez soigneusement tout le supernatant avec une micropipette de 1 mL et jetez-le. Ajouter 500 μL de 1x PBS froid pour résuspendre les cellules et les placer dans des tubes de cytométrie d’écoulement de 5 mL. Restez sur la glace.
14. Comptez les cellules dans la chambre Neubauer faisant une dilution de 1:10 dans Trypan Blue(p. ex.,prenez 10 μL de l’échantillon et mélangez avec 90 μL de Trypan Blue). Ajouter 10 μL du mélange dans une chambre Neubauer et compter les cellules au microscope.
    REMARQUE : Des résultats optimaux sont attendus avec une viabilité de 1 à 5 x^{10 6} cellules/mL > 80 %.
    ATTENTION: Trypan bleu est un agent cancérigène, utiliser PPE pour manipuler.
15. Prenez les cellules pour être lues par un cytomètre. Ensuite, analyser les résultats en sélectionnant la population d’intérêt.

3. Traitement du tissu rénal adulte de poisson zèbre pour l’essai de TUNEL

1. Pour cette procédure, utilisez des animaux de type sauvage(p. ex.,AB, Tübingen, etc.) ou un animal transgénique de couleur fluorescente différente de celle du kit TUNEL, car une fluorescence similaire peut interférer avec l’analyse de TUNEL.
2. Après 24 hpi de 120 μg/g de cisplatine, euthanasier les animaux par choc hypothermique (refroidissement rapide). Voir 2.3-2.4.
3. Disséquer le poisson tel que décrit dans 2.5-2.6; le rein doit rester attaché à l’épine dorsale pendant la procédure de fixation (expliqué ci-dessous).
4. À l’aide d’épingles à insectes, pincer les côtés des parois du corps pour ouvrir la carcasse et l’épingler sur une surface de liège pour garder le rein exposé.
   REMARQUE : Cette procédure garantit que le rein reste dans la bonne position pour une analyse ultérieure.
5. Placez ensuite la surface de liège avec le rein orienté vers le bas dans une plaque de puits de 6 sur une solution fraîchement faite de 4% de paraformaldéhyde (PFA). Gardez-le toute la nuit à 4 °C.
   ATTENTION : La PFA est cancérigène et irritante pour la peau et les surfaces muqueuses. Préparez des solutions PFA sous une hotte chimique à l’aide d’EPI, y compris l’équipement de protection oculaire.
6. Le lendemain, disséquer les reins comme dans 2,8. Placer les reins dans une boîte de Pétri de 60 mm avec 1x PBS et rincer deux fois en 1x PBS.
7. Préparez 2% d’agarose pour générer une matrice de soutien pour le tissu.
8. Jeter tous les 1x PBS restants de la boîte de Pétri et verser 2% d’agarose lentement pour couvrir l’organe entier. Ensuite, placez le rein à l’aide de forceps fins sous un stéréomicroscope pour empêcher le rein de se coucher. Laisser l’agarose se solidifier à température ambiante.
   REMARQUE : Cette procédure gardera l’orientation et la forme de l’organe par le traitement histologique puisque la forme feuille-comme de l’organe cause une tendance à plier si elle n’est pas à l’intérieur d’une matrice de soutien.
9. Après solidification agarose, utiliser un scalpel pour couper l’agarose autour du tissu, formant de petits cubes, et enlever l’excès d’agarose autour du tissu.
10. Placer les cubes d’agarose dans une cassette adaptée au traitement histologique.
    REMARQUE : Les étapes suivantes peuvent être effectuées manuellement ou dans un processeur de tissu automatique.
11. Tout d’abord, traiter le tissu dans la cassette en suivant les prochaines étapes pendant 45 min chacune à température ambiante : un bain de 50% d’éthanol, un bain de 70% d’éthanol, deux bains consécutifs de 95% d’éthanol, et trois bains consécutifs de 100% d’éthanol. Ensuite, traiter le tissu dans deux bains consécutifs de Xylène et trois bains consécutifs de paraffine; ce dernier dure 1 heure chacun à 60 °C.
    ATTENTION : Apporter des changements sous un capot chimique, les vapeurs d’éthanol et de xylène sont irritantes et toxiques.
12. Pour préparer les blocs de paraffine, faire fondre les lentilles de paraffine à 60 °C.
13. Ouvrez la cassette en plastique avec le tissu à l’intérieur et gardez-la sur une plaque chaude. Moules en métal d’échauffement pour la paraffine.
14. Avec des pinces placent le tissu au-dessus d’un moule en métal de sorte que la longueur de rein soit parallèle à la base de moule. Ajouter la paraffine, réaffecter le tissu si nécessaire.
15. Couvrir le moule avec la base de la cassette et ajouter la paraffine jusqu’à ce que la grille soit couverte. Laisser solidifier à température ambiante, puis placer à -20 °C pour un processus de solidification plus rapide.
16. Relâchez le bloc de paraffine du moule métallique environ 20-30 min plus tard.
17. À l’aide d’une microtome, sectionnez le tissu incorporé dans la paraffine jusqu’à 5 μm d’épaisseur. Utilisez des glissières en verre silanisées ou chargées positivement pour recueillir les tissus.

4. Essai tunel

REMARQUE : Le protocole suivant utilise une trousse in situ de détection de la mort cellulaire (tableau des matériaux).

1. Lame de tissu de déwax les plaçant dans deux bains consécutifs de xylène pendant 5 min. Puis réhydrater le tissu à travers une série classée d’éthanol: 100%-95%-70%-50%, pendant 5 min chacun.
2. Placez les glissières dans l’eau froide du robinet pour rincer l’éthanol. Gardez les glissières dans de l’eau distillée.
3. Préparez une chambre d’incubateur sombre. Ajouter des serviettes en papier humide sur le fond pour garder l’humidité pendant les étapes d’incubation.
   REMARQUE : En l’absence d’une chambre d’incubateur est possible d’utiliser une boîte de Petri avec du papier humide dans le fond et deux cure-dents pour placer la diapositive.
4. Préparer une nouvelle solution de travail Proteinase K: 10 μg/mL en 10 mM Tris/HCl, pH 7,4-8.
   REMARQUE : Proteinase K est utilisé comme agent de perméabilisation, tel que recommandé par le fabricant.
5. Placez les diapositives dans la chambre sombre de l’incubateur et ajoutez la solution de travail Proteinase K jusqu’à ce que les échantillons couvrent. Incuber pendant 30 min à 37 °C.
6. Pendant que les échantillons couvent, préparez le mélange de réaction TUNEL: Ajouter 50 μL de solution enzymatique à 450 μL label solution. Protégez-vous de la lumière.
   REMARQUE : Le volume à préparer peut être ajusté dans la même proportion de 1:10. Le volume est calculé à 50 μL du mélange pour chaque section; cela peut changer en fonction de la taille des échantillons.
7. Ramasser la chambre noire et laver les toboggans deux fois avec 1x PBS.
8. Ensuite, séchez la région autour de l’échantillon à l’aide de papier absorbant et ajoutez 50 μL de mélange de réaction TUNEL sur chaque toboggan tissulaire, répartir la solution de sorte que tout l’échantillon soit couvert. Incuber à 37 °C pendant 2 h. Protégez-vous de la lumière.
9. Après l’incubation, rincer la lame trois fois avec 1x PBS et sécher la région autour de l’échantillon à l’aide de serviettes en papier.
10. Ajouter 50 μL de DAPI 1:1000 aux échantillons, pour la contre-coloration nucléaire, et incuber pendant 5 min à température ambiante. Protégez-vous de la lumière.
11. Rincer à nouveau trois fois avec 1x PBS et sécher la région autour de l’échantillon.
12. Montez la glissière avec un milieu hydrophilique anti-fondu, placez un coverslip et scellez avec du vernis à ongles. Rangez les glissières horizontalement, protégées de la lumière à 4 °C.
    REMARQUE : Les propriétés anti-fondu du milieu de montage sont de préserver la fluorescence des échantillons, mais il est possible d’utiliser n’importe quel milieu hydrophilique disponible. L’étape finale d’étanchéité avec le vernis à ongles est cruciale pour éviter la déshydratation.
13. Visualisez les échantillons au microscope à fluorescence. Pour ce type de pigment fluorescent, utilisez une longueur d’onde d’excitation de l’aire de répartition de 520 à 560 nm (vert) et une détection de l’aire de répartition de 570 à 620 nm (rouge).

Résultats

Le rein du poisson zèbre est un organe pigmenté plat situé sur la paroi dorsale et son unité fonctionnelle de base, le néphron, est conservée avec des mammifères (Figure 1). La particularité d’avoir un seul rein avec une grande capacité de régénération fait de cet organisme modèle un excellent choix pour les lésions rénales modèle. Les protocoles présentés dans ce travail sont conçus pour induire l’AKI par l’injection intrapéto-perpétérale (i.p.) de cisplatine chez le poissonzèbreadulte ( figure 2 ) et pour être analysés plus tard par deux techniques détaillées auparavant : la cytométrie du débit (figure 3A) et le TUNEL (figure 3B). Un débit de l’ensemble du processus est représenté à la figure 4. Les doses de cisplatine ont été appliquées initialement sur la base de celles décrites dans les modèles^{murin 15,16,17}, dans lequel la norme utilisée est de 10-13 mg de cisplatine par kg d’animal (mg/kg). Cependant, le poisson zèbre s’est montré plus résistant au cisplatine que la souris (données non montrées), et la dose finale a été augmentée. Lorsque nous avons évalué le taux de survie des animaux, les expériences ont montré un effet dépendant de la dose de cisplatine (Figure 5A). Pour cette raison, nous recommandons de suivre les instructions exactement comme expliqué dans ce protocole et de surveiller le taux de survie des animaux en permanence comme une mesure de reproductibilité, avant de recueillir tout matériel. Après l’injection de 120 μg/g de cisplatine(figure 5A, lignerouge), une diminution de la survie d’environ 30 % des animaux a été observée dans les 24 premières heures et la survie a diminué graduellement jusqu’à atteindre environ 20 % des animaux vivants le jour 5 après l’injection, puis stabilisée ( figure5A). La toxicité du cisplatine n’a pas été affectée par le sexe des animaux, puisque les mâles et les femelles ont des courbes de survie similaires (figure 5B).

L’analyse de la cinétique de l’AKI cisplatine-induite a montré l’inflammation accrue et la mort cellulaire dans le rein 24 hpi. Une des façons les plus rapides et quantitatives d’évaluer l’inflammation est la cytométrie du débit, mais étant donné le manque d’anticorps contre les antigènes du poisson zèbre disponibles dans le commerce pour cette technique, est nécessaire d’utiliser une ligne transgénique avec un marqueur immunitaire. Aujourd’hui, de nombreuses lignées de poissons zèbres étiquetant les cellules immunitaires sontaccessibles ( tableau 1). Ces lignes peuvent être utilisées singly ou en combinaison, étant donné assez de répertoire^{pour l’analyse 48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60}. Cela simplifie énormément la technique puisqu’il n’est pas nécessaire d’une étape d’incubation d’anticorps, au contraire, après l’isolement des cellules par séparation mécanique, la lecture directe sur le cytomètre est possible.

Comme mentionné précédemment, le rein du poisson zèbre n’est pas seulement un organe de filtration du sang avec des fonctions homéostatiques, mais aussi le site anatomique de l’hématopoïèse chez les adultes, équivalent à la moelle osseuse chez les^{mammifères 33,34,35}. De cette façon, lorsque nous l’analysons par cytométrie de débit est possible de différencier les populations cellulaires^{comparables au sang humain 61,62} (Figure 6A), cela nous permet d’identifier les populations cellulaires d’abord par la taille et la granularité et d’exclure les débris. Dans ce cas, nous avons utilisé une lignée transgénique appelée Tg(mpo:GFP)^{52 qui} exprime une protéine fluorescente verte (GFP) avec l’enzyme myeloperoxidase, qui est présente dans les neutrophiles. Sachant cela, notre stratégie de porte était basée sur la séparation initiale de la population du granulocyte (Figure 6B). Par la suite, les cellules doublet ont été exclues, car elles peuvent modifier considérablement l’analyse et conduire à des conclusions inexactes. Un doublet est un événement unique qui se compose de 2 particules indépendantes et peut être exclu en sélectionnant une hauteur de dispersion avant (FSC-H) par rapport à une parcelle de densité de zone de dispersion avant (FSC-A) (Figure 6C). Après cette étape, les cellules qui ont exprimé le marqueur fluorescent ont été identifiées et sélectionnées( Figure 6D). Enfin, les statistiques démographiques ont été extraites de l’analyse et tracées en pourcentage de cellules (Figure 6E).

Une des caractéristiques les plus importantes de la néphrotoxicité de cisplatine est la mort tubulaire^{de cellules 10,}et pour visualiser facilement ceci nous avons employé l’essai de TUNEL pour la détection d’apoptose. Cette méthode recommande d’utiliser des cellules et des tissus de type sauvage qui n’ont pas de marqueurs fluorescents, puisque la fluorescence parallèle interférerait avec l’analyse, dans le cas du poisson zèbre est recommandé d’utiliser des lignées de type sauvage, telles que AB, Tübingen, TAB, ou une ligne transgénique avec une protéine fluorescente qui n’interfère pas avec la couleur de fluorescence TUNEL. La technique TUNEL permet l’analyse par cytométrie d’écoulement ou microscopie. La microscopie a l’avantage de conserver la structure tissulaire, ce qui permet de voir quelles cellules meurent. Sous le microscope fluorescent, les noyaux lumineux des cellules apoptotiques peuvent être facilement différenciés de l’arrière-plan. Les animaux injectés avec du cisplatine (figure 7B) ont plus de cellules mortes que le contrôle (Figure 7A) à 24 hpi. La quantification finale a été faite avec l’option de compteur cellulaire de FIJI Software et a montré statistiquement plus de cellules mortes dans les reins traités au cisplatine que dans les témoins (Figure 7C)

Le protocole décrit dans ce manuscrit a montré comment utiliser le cisplatine comme inducteur de l’AKI chez le poisson zèbre adulte, qui est dose-répondant, rapide et fiable. Sur la base des données obtenues à partir des taux de survie et de la mesure des signes de néphrotoxicité du cisplatine, y compris l’inflammation (détectée par cytométrie du débit) et la mort cellulaire (détectée par l’analyse TUNEL), nous proposons ce modèle pour l’étude de la néphrotoxicité du cisplatine ainsi que pour les futurs traitements des maladies liées à l’AKI.

Figure 1 :Structure et comparaison du poisson zèbre et des reins humains. R. (1) Vue latérale d’un poisson zèbre adulte avec le rein représenté en brun foncé situé dans la paroi dorsale du poisson, entre la vessie natatoire (sb) et l’épine dorsale. (2) Vue ventrale du rein montrant des néphrons (jaunes) reliés au conduit de collecte (bleu). Les différentes régions du rein sont signalées : tête (H), tronc (Tr) et queue (Ta). (3) Schéma représentant les néphrons du poisson zèbre et leurs segments étiquetés et colorés pour correspondre aux régions génétiquement conservées avec le néphron humain. B. (1) Vue sagittale d’un rein humain. (2) Schéma représentant un néphron humain avec des segments étiquetés et colorés. RC: corpuscule rénal; PCT : tubule alambiqué proximal ; TVH : tubule droit proximal; TL : membre mince ; LH: Boucle de Henle; TAL : membre ascendant épais ; DE: distal tôt; DL: distal tard; DCT : tubule alambiqué distal ; CD : collecte du conduit. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2: Conception expérimentale pour l’AKI induite par le cisplatine. R. Vue latérale et ventrale du poisson zèbre adulte pointant la position de l’aiguille pendant la procédure d’injection. L’aiguille pénètre à un angle de 20-30° du ventre et est insérée lentement parallèlement à la paroi ventrale en évitant de percer les viscères. B. Conception expérimentale de l’AKI induit par le cisplatine : (1) Injection de cisplatine 120 μg/g par animal au jour zéro. (2) Avant d’essayer l’étape 3, la surveillance de survie des poissons après injection est recommandée du premier au jour dix. (3) Dissections rénales un jour après l’injection de cisplatine pour d’autres techniques de traitement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 :Mécanismes de cytométrie du débit et techniques TUNEL. R. Vue d’ensemble du cytomètre d’écoulement : une suspension des cellules est hydrodynamiquement focalisée sur une seule ligne par un fluide de gaine, causant des cellules de passer une par une devant un faisceau laser. Les détecteurs à l’avant et sur le côté mesurent la dispersion vers l’avant (FSC), la dispersion latérale (SSC) et la fluorescence des cellules. B. Principe de l’analyse TUNEL. La transferase de désoxynucléotidyl terminale (TdT) médie l’ajout d’un dUTP fluorescent-marqué aux extrémités de 3'-OH d’un ADN fragmenté. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4: Flowchart des techniques représentées. R. Un organiculaire montrant les étapes à suivre lors du choix d’analyser le tissu rénal par cytométrie d’écoulement (orange) ou TUNEL (bleu), lors de l’induction de l’AKI par injection de cisplatine (gris). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 :Surveillance de survie des poissons injectés au cisplatine. R. Taux de survie de différentes doses d’injections de cisplatine (25 - 50 - 112,5 - 120 μg/g). Test de classement (Mantel-Cox), ** p < 0,01. B. Taux de survie des mâles par rapport aux femelles injectées avec 120 μg/g de cisplatine. Test de classement en rondins (Mantel-Cox), *** p < 0,001. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 :Stratégie de porte pour la ligne transgénique de poisson zèbre. R. Parcelle de densité des cellules rénales adultes du poisson zèbre, les populations sont séparées par la taille (FSC-A) et la granularité (SSC-A). Différentes populations sont sélectionnées par des ovales/cercles colorés. Rose: Erythroid; Noir: Lymphoïde; Jaune : Précurseurs; Rouge: Granulocytes. B. Parcelle de densité de la zone de dispersion latérale (SSC-A) et de la zone de dispersion vers l’avant (FSC-A) pour la sélection de la population de granulocytes dans le rein. C. C. Parcelle de densité de dispersion vers l’avant élevée (FSC-H) et zone de dispersion vers l’avant (FSC-A) pour la sélection de la population de singlets à l’intérieur de la porte des granulocytes. D. D. Parcelle de densité de la zone de dispersion avant (FSC-A) et FITC-A:MPO pour la sélection des cellules positives mpo:GFP (neutrophiles) dans le rein. Une population positive est considérée vers 10^{3 sur, de} l’intensité de fluorescence. E. E. Graphique du pourcentage de mpo:GFP cellules positives (neutrophiles) chez les animaux de contrôle vs Cisplatine, 24 hpi . T-test nonappriré. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7: Analyse TUNEL de poissons injectés au cisplatine. R. Microphotographies du rein adulte fixe 24 h après injection de 120 μg/g de cisplatine. Les commandes sont injectées avec 0,9% de NaCl. Les cellules positives TUNEL (cellules apoptotiques) sont tachées de rouge (flèches blanches). Dapi (bleu) est utilisé comme contre-tache nucléaire. Barre d’échelle : grossissement de 50 μm. 20x. B. Graphique montrant la quantification du nombre de cellules mortes dans le rein par champ 20x. T-test non appriré, * p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Ligne transgénique	Type de cellule étiqueté	références
Tg (spi1:EGFP)pA301	Cellules myéloïdes	Ward et coll. 200348
Tg (zpu1:GFP)	Cellules myéloïdes	Hsu et coll. 200449
Tg(mhc2dab:GFP)sd6	Monocytes	Wittamer et coll. 201150
Tg (lysC:DsRED2)	Neutrophiles	Hall et coll. 200751
Tg (mpo:GFP)	Neutrophiles	Mathias et coll. 200652
Tg (mpeg1:mCherry)	Macrophages	Ellett et coll. 201153
Tg (mpeg1:Dendra2)	Macrophages	Harvie et coll. 201354
Tg (lck:GFP)	Cellules T	Langenau et coll. 200455
TgBAC (ikaros:EGFP)	Cellules T	Bajoghli et coll. 200956
Tg (rag1:GFP)	Cellules T	Jessen et coll. 199957
Tg (rag2:GFP)	Cellules T	Jessen et coll. 200158
Tg (CD79:GFP)	Cellules B	Liu et coll. 201759
Tg (CD45:DsRed)	Leucocytes	Bertrand et coll. 200860

Tableau 1 : Lignes transgéniques zebrafish pour cellules immunitaires. Table resumant les noms des lignes de journaliste de poisson zèbre avec le type respectif de cellule immunisée étiquetée et les articles de référence où ils ont été construits. Une combinaison de ces lignées de poissons zèbres peut offrir de nouvelles possibilités de sélection cellulaire par cytométrie d’écoulement.

Discussion

La prévalence des maladies rénales a continué d’augmenter dans le monde entier, devenant un problème de santé publique mondial qui touche des millions de^{personnes âgées de 63 ans.} Trouver un moyen de traiter les personnes atteintes de rein est d’une importance primordiale ainsi que de mieux comprendre leur étiologie et leur progression. Plusieurs études ont utilisé des modèles animaux pour comprendre les dommages rénaux. Le rein du poisson zèbre (figure 1) a été étudié pendant des années dans la biologie du développement et la recherche sur les blessures en raison de ses capacités d’autorégénération et la similitude^{génétique 29,64}. Ici, nous présentons un nouveau modèle AKI chez le poisson zèbre adulte en utilisant les propriétés du cisplatine comme agent néphroxique, détaillant les étapes pour accomplir une réaction rapide et aiguë avec des dommages visibles dès 24 hpi (Figure 2). De plus, nous expliquons ici deux techniques qui aideront à l’évaluation des lésions tissulaires après l’injection de cisplatine, la cytométrie du débit et le TUNEL (figure 3).

Les modèles actuels d’AKI chez le poisson zèbre adulte incluent l’injection i.p. de gentamicine qui induit des dommages étendus dans la destruction de néphron et de tubule, les événements de neonephrogenesis commencent à partir du jour 5, et la régénération est accomplie par 21 jours après injection^65. D’autre part, un modèle de lésion rénale aiguë associée à la septicémie (S-AKI) a été établi par l’infection par Edwardsiella tarda, puisque considérablement augmenté l’expression des marqueurs AKI, tels que l’insuline comme la protéine de facteur de croissance contraignante-7 (IGFBP7), inhibiteur tissulaire des métalloprotéines 2 (TIMP-2), et la molécule de lésion rénale-1 (KIM-1), chez les larves et le poisson zèbre adulte⁶⁶. Le poisson zèbre est connu pour être un animal à haut débit pour la recherche d’agents thérapeutiques, ce qui inclut l’utilisation de probiotiques et de métabolites dérivés du microbiote pour étudier la fonction rénale et la^{régénération 67}. Cependant, les modèles disponibles pourraient affecter directement les résultats de ces traitements. Ainsi, nous avons établi une méthode différente pour induire l’AKI chez le poissonzèbreadulte ( figure 4 ), en utilisant le cisplatine comme agent néphroxique connu qui n’aurait pas d’effets directs connus sur le microbiote du poisson, tout comme le modèle de gentamicine pour être un antibiotique, ou l’infection par E. tarda, pour être un modèle de septicémie. Cependant, en même temps que nous développions notre protocole de cisplatine, un autre groupe a également exploré les effets néphroxiques du cisplatine chez le poisson zèbre adulte, simplifiant la dose à 10-20-30 μg par animal^68. Bien qu’ils aient également montré l’effet dose-dépendant de cisplatine dans la survie, nous recommandons la prudence en utilisant une seule quantité de cisplatine pour tous les poissons, car le poisson zèbre du même âge peut avoir des tailles et un poids très différents et ceci pourrait induire des variations dans^{les résultats 69,70.} Nous pensons qu’il est important d’ajuster la dose au poids correspondant de l’animal, comme cela se fait chez la souris et cette étude.

Dans nos expériences avec le poisson zèbre adulte, le cisplatine a montré un effet dose-réponse. Cela a été visualisé en surveillant le taux de survie des animaux après l’injection de cisplatine (figure 5). Nous avons utilisé la survie comme un moyen d’estimer l’intensité de la dose de cisplatine et non comme une mesure de néphrotoxicité, car aucun autre signe physique n’est visible pendant le temps de surveillance. Ceci peut être comparable aux rongeurs, dans lesquels la sévérité des dommages de rein peut être modulée par le dosage et la fréquence de l’injection de cisplatine^15,réalisant des doses mortelles avec des concentrations plus élevées de cisplatine^71. Mort est également vu dans les jours suivants dans le modèle larvaire de cisplatine⁷². Puisque notre but était d’induire une blessure aiguë en quelques jours, nous avons choisi la dose de 120 μg/g de cisplatine comme il est possible d’observer des dommages de rein 24 h après l’injection, cependant, ceci peut être ajusté selon les objectifs de l’étude.

Chez l’homme, l’AKI est médicalement diagnostiqué par le taux diminué de filtration glomerular (GFR), la créatinine élevée de sérum, et l’azote d’urée^{de sang 3.} Chez le poisson zèbre, le répertoire des modèles AKI comprend certains modèles génétiquement conditionnels^73,74 et certains modèles liés à la^{drogue 65,72}, mais comme certains paramètres fonctionnels de l’AKI ne peuvent pas être mesurés sur le poisson zèbre en raison de difficultés techniques(p. ex., collecte de sang), la plupart des recherches adoptent des techniques morphologiques et visuelles pour observer les caractéristiques de l’AKI^1,75 comme notre étude.

Chez les rongeurs, le cisplatine pénètre dans les cellules épithéliales dans les tubules proximaux et distals, à l’intérieur de la cellule subit une activation métabolique et devient très réactif agissant sur les organites cellulaires et induisant des changements dans la structure cellulaire. Ces changements peuvent induire l’apoptose et l’autophagie et même la nécrose, à des doses très élevées. En réponse à ces dommages, beaucoup de cytokines sont libérées et des leucocytes sont recrutés menant à l’inflammation et affectant la fonctionnalité de^{l’organe 15.} Ceci souligne l’importance d’évaluer quel type de cellules peut être trouvé dans le rein blessé, en tant que résidents ou cellules immunitaires infiltrées. Ici, nous avons montré comment évaluer cela par cytométrie de flux, en utilisant les lignes transgéniques de reporter immunitaire disponibles de nos jours (Tableau 1). Cisplatine a augmenté le pourcentage de neutrophiles(mpo:GFP cellules positives) dans le rein 24 h après l’injection (Figure 6). Dans le cas du poisson zèbre, le rein est le créneau des HSC qui donnent lieu à différents types de cellules sanguines. Néanmoins, de nombreux granulocytes et macrophages circulent normalement dans le sang. Dans notre exemple, nous avons utilisé la ligne transgénique mpo:GFP qui expriment GFP sous le promoteur de myeloperoxidase de neutrophiles⁵². Les études originales de la ligne transgénique mpo:GFP ont démontré l’expression du myeloperoxidase dans différents états de maturation de neutrophile⁷⁶ mais notre stratégie de barrière s’est concentrée sur la fraction de granulocyte qui comprend les cellules mûres provenant^{du sang 52,}de cette façon notre analyse incluent les cellules infiltrées et non les cellules résidentes. Ceci est important à considérer lors de l’isolement de la population cellulaire désirée.

Comme expliqué ci-dessus, l’apoptose est le marqueur le plus classique de l’AKI lié au cisplatine. Ici, nous avons démontré un protocole simple pour la localisation des cellules mortes par l’essai tunel. L’injection de cisplatine a augmenté le nombre de cellules apoptotiques de 24 hpi( Figure 7). Ceci peut être facilement quantifié en comptant directement les cellules mortes du tissu. Néanmoins, pour l’identification de la mort spécifique à la cellule, l’utilisation d’anticorps contre la cellule désirée(p. ex., cellules tubulaires) ou l’utilisation d’une ligne de reporter transgénique peuvent être utilisées en même temps que cette technique. Comparé au modèle gentamicin-induit d’AKI, le cisplatine semble être un modèle plus grave, puisque l’apoptose de gentamicin était plus haute le troisième jour après injection^65.

En dépit d’avoir une série d’effets secondaires, le cisplatine est toujours employé couramment dans la thérapie de cancer, en raison de son efficacité contre divers types de cancers, y compris des carcinomes, des tumeurs de cellules germinales, des lymphomes, et des sarcomes^77. La néphrotoxicité se produit dans un tiers des patients dans le traitement avec le cisplatine^10,ainsi la recherche des stratégies qui peuvent diminuer cet effet et augmenter la renoprotection est impérative. Nous croyons que les méthodes et les techniques présentées dans ce manuscrit aideront à élucider les mécanismes des lésions rénales et à trouver des cibles thérapeutiques qui peuvent être essentielles pour améliorer la qualité de vie des personnes qui souffrent de complications rénales, principalement ceux liés à l’utilisation du cisplatine.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS			Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water
31 G 1.0 cc insulin syringe	BD Plastipak	990256	Needle: BD Precision Glide 300110
3.5 L Fish tank	Tecniplast		Part of the aquactic system
6 well plate	Corning	351146
10 mM Tris/HCl			Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000)
50 ml Falcon tube	Corning	352070
2-3% Agarose	Invitrogen	16500-500	Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve.
2% FBS	Gibco	12657-09	Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS
4% Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 °C
50% Ethanol			Made by diluting 100% ethanol in distilled water
70% Ethanol			Made by diluting 100% ethanol in distilled water
90% Ethanol			Made by diluting 100% ethanol in distilled water
100% Ethanol	Synth	00A1115.01.BJ
100% Xylene	Synth	00X1001.11.BJ
Cell strainer 40 µm	Corning	431750
Cisplatin	Blau Farmacêutica	16020227	C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature.
Cork board sheet			Obtained from local stationary store
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Stock solution 20 mg/ml dissolved in water
Fine forceps	Fine Science Tools	11254-20
Flow cytometry tubes	Corning	352052
Glass slide	Thermo-Fisher	4445
Histology cassette	Ciencor	2921
Immuno stain chamber	Ciencor	EP-51-05022
Incubator	NAPCO	5400	Set to 37 °C
Insect pins	Papillon		Model micro15x20
In Situ Cell Death Detection Kit	Roche Diagnostics	12156792910
Metal mold	Leica Biosystems	3803081
Micropipette 200-1000 µL	Eppendorf		Use 1 mL tips
MS-222 (Tricaine)	Fluka Analytical	A5040-25G
NaCl 0.9%	Synth	C1060.01.AG	Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water
Nail polish			Prefer transparent
Neubauer chamber	Precicolor HGB
Pasteur plastic pipet	United Scientific Supplies	P31201
Paraplast	Sigma-Aldrich	P3558
Petri dish	J.ProLab	0307-1/6	60 and 100 mm
Plastic spoon			Obtained from local store
Proteinase K	New England BioLabs	P8102	Diluite from stock 20 mg/ml
Scissors	Fine Science Tools	14060-09
Scalpel blade	Solidor
Sponge			Obtained from local store
Trypan Blue	Cromoline	10621/07
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
Vectashield Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Cytometer	BD Biosciences	FACSCanto II
Fluorescence Stereoscope	Zeiss	Axio Zoom.V16
Fluorescence Microscope	Zeiss	AxioVert.A1
Microtome	Leica	Jung Supercut
Scale	Ohaus Corporation	AR2140