العضويات الظهارية المخاطية من الخلايا الجنينية زينوبوس: التوليد والثقافة والتصوير الحي عالي الدقة

Summary

نحن نصف بروتوكول بسيط لتطوير الظهارية المخاطية من الخلايا الأضمرمة العميقة المعزولة من الأجنة xenopus laevis. السلف متعددة القدرات تجديد السلائف خلية القروب الظهارية والسماح بالتتبع الحي لبدء وتطور انتقالات الخلية على سطح organoids.

Abstract

يوفر ظهارة مخاطية خط الدفاع الأول عن طريق إزالة الجسيمات الأجنبية من خلال عمل إنتاج المخاط وإزالة بوساطة أهديا. العديد من العيوب ذات الصلة سريريا في ظهارة المخاطية هي الاستدلال لأنها تحدث في عمق الجسم. هنا، نقدم نموذج 3D قابل للغشاء المخاطي ظهارة ولدت من السلفارع متعددة القدرات التي كانت معزولة microsurgically من الأجنة xenopus laevis. وتغطي الظهارية المخاطية مع الظهارة التي تم إنشاؤها حديثا من خلايا البشرة العميقة وزينت في وقت لاحق مع خلايا متعددة الciliat منقوشة متميزة, الخلايا الإفرازية, والخلايا القبل المنتجة للمخاط التي لا يمكن تمييزها من البشرة الأصلية في غضون 24 ساعة. يمكن تتبع التسلسلات الكاملة لانتقالات الخلايا الديناميكية من الظهارية الظهارية إلى الظهارة التي تظهر على السطح العضلي من العضيات بواسطة التصوير الحي عالي الدقة. هذه في المختبر مثقف، عصامي التنظيم المخاطية تقدم مزايا متميزة في دراسة بيولوجيا ظهارة المخاطية مع كفاءة عالية في توليد، ظروف الثقافة المحددة، والسيطرة على عدد وحجم، والوصول المباشر للتصوير الحي أثناء تجديد ظهارة متمايزة.

Introduction

ترتبط الإصابة والعدوى ومرض ظهارة المخاطية بضعف إنتاج وإزالة المخاط الذي غالبا ما توجد في الاضطرابات الرئوية مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن والربو والتليف الكيسي والتهاب القصبات الهوائية وخلل التوازن الهدبي الأولي^1،2،3،4. وهناك تقدم في الآونة الأخيرة في التكنولوجيا العضوية، على سبيل المثال، الخلية القاعدية المشتقة من اعضوية الرئة دعا القصبة الهوائية التي تتلخص في تجديد ظهارة mucociliary تنشأ كنموذج واعد مع إمكانات علاجية^1،5،6. غير أن استخدامه محدود حالياً، ويرجع ذلك جزئياً إلى الافتقار إلى ظروف الثقافة المحددة وانخفاض الكفاءة في الإنتاج العضوي. الظهارة المخاطية في مجرى الهواء البشري والضفدع البشرة متشابهة بشكل ملحوظ في تكوين الأنسجة، وتكوين الخلايا، ووظيفتها^{7،8،9،10،11،12.} في كلا الكائنين، يوفر الظهارة المخاطية الدفاع الخط الأول عن طريق إفراز المخاط والمواد المضادة للميكروبات ومسح الجسيمات الضارة ومسببات الأمراض من خلال العمل المتزامن من أهداب.

هنا، ونحن وصف بروتوكول بسيط لتوليد organoids الظهارية المخاطية باستخدام النسل متعددة القدرات من الأجنة xenopus laevis ^13،14. سابقا، أبلغنا¹⁴ أنه في غياب عوامل النمو الخارجية والمصفوفة خارج الخلية، والخلايا العميقة المعزولة المجهرية من مرحلة gastrula في وقت مبكر التجميع التلقائي في المجاميع، وتجديد الظهارة على سطحها، وتنضج في ظهارة المخاطية عن طريق intercalated multiciliated وخلايا أخرى ملحقة داخل 24 ح. بالإضافة إلى التطور السريع، وهذا البروتوكول يوفر فرصة متميزة للوصول مباشرة إلى انتقالات الخلايا الكلية العميقة متعددة القدرات إلى ذريات خلية القروبة الظهارية التي تتجدد خطوات تجديد^{ظهارة 14} المعطلة التي لا تتوفر من الأجنة سليمة و ectoderm (المعروف أيضا باسم قبعة الحيوان)^15،16،17. عدد وحجم organoids المنتجة قابلة للتطوير مع كفاءة عالية من خلال السيطرة على المواد بدءا من أجنة Xenopus. يمكن فرز العضيات في الثقافة العائمة بسهولة ونقلها في المرحلة المطلوبة لإجراء المزيد من التحليلات ، بما في ذلك التصوير عالي الدقة ، والاختبار الميكانيكي ، والعلاج من المخدرات ، والتوصيف الجيني^14. هذا التجديد التلقائي الذي يحركه ميكانيكا الأنسجة للظهارة على سطح مجاميع الخلايا الجنينية ينتج عنه ظهارة ظهارية مُخاطية ويوفر نموذجًا ثلاثي الأبعاد جديدًا (ثلاثي الأبعاد) لدراسة بيولوجيا الظهارة المخاطية.

Protocol

تمت الموافقة على استخدام الحيوانات والبروتوكولات التجريبية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) التابعة لمعهد العلوم الأساسية (IBS 18-01) والمعهد الكوري المتقدم للعلوم والتكنولوجيا (KA2017-22).

1- الأجنة

1. الحصول على الأجنة x. laevis باستخدام إجراء قياسي: جمع البيض يدويا من الضفادع الإناث حفز وأداء الإخصاب في المختبر^18,19.
2. دي هلام الأجنة المخصبة مع التحريض لطيف لحوالي 5 دقائق في 2٪ السيستين في 1/3x تعديل بارث المالحة (MBS; انظر وصفة ل1X MBS أدناه) في pH 8¹⁹.
3. خطوة اختيارية للتصوير الحي: لتسمية بروتينات محددة بفلورسنت بشكل مفلور ومراقبة ديناميكياتها في الجهاز العضوي، انتقل إلى القسم 5.
4. (اختياري) لرصد تلوث الخلايا الدهنية السطحية داخل العضوية، وتسمية سطح بيضو من الأجنة مع NHS-rhodamine في المرحلة 9¹⁴. احتضان الأجنة في 1 ملغ / مل NHS-Rhodamine في 1/3x MBS (pH 9.0) لمدة 30 دقيقة مع المكسرات لطيف. اغسل الأجنة ثلاث مرات عن طريق الانتقال إلى طبق بيتري مملوء بـ 1/3x MBS لمدة 15 دقيقة.
5. زراعة الجنين في 1/3x ميغابايت في درجة الحرارة المفضلة (14-26 درجة مئوية) حتى يتم الكشف عن العلامات الأولى للمرحلة 10 (أي، ظهور الخلايا المصطبغة الداكنة حول البلاستوبر في المنظر النباتي).

2. إعداد أدوات الجراحة المجهرية والحلول والأوعية الثقافية

1. إعداد الأدوات اللازمة بما في ذلك زوج من ملقط الصف الجراحية وأدوات الشعر (حلقة الشعر وسكين الشعر) لجراحة²⁰microsurgery .
2. إعداد وسائل الإعلام الثقافة التالية للأجنة: 1/3X MBS، حيث يتم 1X MBS مع NaCl (88 mM)، KCl (1 mM)، NaHCO₃ (2.4 mM)، MgSO₄ (0.82 mM)، Ca(NO₃)₂ (0.33 mM)، CaCl₂ (0.41 mM)، وHPES (10m). ضبط درجة اله إلى 7.4 مع 10 M NaOH.
   ملاحظة: اختياري: إضافة قطرات من أحمر الفينول للإشارة إلى درجة الحموضة.
3. إعداد وسائل الإعلام الثقافة التالية للأنسجة الجنينية و organoids: Danilchik لـ Amy (DFA)²¹ تكملها مضادات حيوية جديدة بنسبة 1٪ ومحلول مضاد للوميكوتيك. إعداد DFA مع NaCl (53 مل م)،_{Na 2}CO₃ (5 مل م)، غلوكونات البوتاسيوم (4.5 مللي م)، غلوكونات الصوديوم (32 م م)، CaCl₂ (1 mM)، و MgSO₄ (1 mM). ضبط درجة اله إلى 8.3 مع Bicine الحبيبية. تصفية DFA (0.2 ميكرومتر مرشح زجاجة أعلى)، aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية.
4. إعداد الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من DFA لفصل الخلايا العميقة من الاقدره باستخدام وصفة أعلاه وحذف CaCl₂ و MgSO₄. Aliquot وتخزينها في 20 درجة مئوية.
5. إعداد أنابيب PCR غير لاصقة لتجميع الخلايا الجنينية.
   1. للحث على التجميع التلقائي للخلايا الجنينية المعزولة، قم بإعداد أنابيب PCR غير لاصقة عن طريق طلاء أنابيب PCR ذات القاع الدائري مع 200 ميكرولتر من 1٪ BSA (1 غرام من BSA في 100 مل من الماء المقطر) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية أو لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. سيتم استخدام كل أنبوب لتجميع جهاز واحد.
   2. شطف أنابيب PCR المغلفة BSA مع DFA ثلاث مرات لإزالة أي BSA المتبقية.
   3. ملء أنابيب PCR مع 200 ميكرولتر من DFA.

3. عزل الخلايا العميقة في الجسم

1. اختر واجمع الأجنة عند وصولها إلى المرحلة المبكرة 10 باستخدام أدوات الشعر تحت منظار مجسم.
2. باستخدام ماصة نقل يمكن التخلص منها، نقل الأجنة المختارة إلى طبق بيتري مملوءة DFA.
3. إزالة غشاء vitelline من الأجنة باستخدام ملقط حادة من الجانب النباتي دون تعطيل الجانب الحيواني من الجنين.
   ملاحظة: كن حذراً لتجنب تعريض الأجنة للهواء. إدخال فقاعات الهواء في المحلل أو جلب الأجنة إلى السطح سوف يسبب انفجار الجنين.
4. لعزل الغطاء الحيواني، ضع الجانب الحيواني للجنين.
5. تقدير بصريا مدى غطاء الحيوان ليتم استئصالها وجعل الشق الأول على طول حافة الغطاء الحيواني بسكين الشعر. سحب سكين الشعر إلى الخارج لجعل قطع.
6. كرر الخطوة 3.5 لإنشاء سلسلة من التخفيضات الصغيرة لمعالجة غطاء الحيوان.
7. تقليم حافة سميكة الطبقات من غطاء الحيوان باستخدام سكين الشعر لمنع إدراج السلائف mesoderm.
   ملاحظة: لمنع الشفاء وتجميع قبعات الحيوانات المعزولة، انتقل إلى الخطوة التالية في غضون 10 دقائق. عادة، نحن نعزل 5-10 قبعات حيوانية في وقت لتجميع عدة أجهزة.
8. لفصل الخلايا الكوديرم العميق من غطاء الحيوان، نقل قبعات الحيوانات المفككة إلى طبق بيتري مليئة بالكالسيوم والمغنيسيوم خالية من DFA مع ماصة نقل يمكن التخلص منها. يجب الحرص على عدم إدخال أي فقاعات الهواء أثناء النقل.
9. للحفاظ على مساحة كافية للخطوات التالية ، وذلك باستخدام أدوات الشعر ، ضع قبعات الحيوان لمواجهة الجانب الحيواني والحفاظ على مسافة سخية من explants الأخرى.
10. انتظر 5-10 دقيقة ثم مراقبة explants تحت منظار مجسم. مرة واحدة تم العثور على الخلايا العميقة خففت من حافة طبقة سطحية داكنة المصطبغة، والبدء في رفع الطبقة السطحية بعيدا عن خلايا ectoderm العميقة ذات الألوان الفاتحة باستخدام سكين الشعر تحت المنظار المجسم.
11. فصل بعناية (تقشير قبالة) طبقة سطحية مع سكين الشعر، بدءا من الحافة.
12. جمع الخلايا العميقة الأكتودر مع الحد الأدنى من الطموح (10\u201215 ميكرولتر) للحد من كمية من الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من DFA التي يتم نقلها إلى وسائل الإعلام التجميع في الخطوة التالية.
    ملاحظة: يمكن إزالة الخلايا السطحية المنفصلة من الوسائط لمنع تلويث الخلايا الاكودية العميقة المتبقية.

4- توليد غشاء عضويات ظهاري مُن المخاطي

1. تم جمع خلايا ectoderm العميقة إلى أنبوب PCR غير لاصق يحتوي على 200 ميكرولتر من DFA. بلطف ماصة وسائل الإعلام (2\u20123 مرات) لتفريق الخلايا المنقولة في أنبوب PCR.
   ملاحظة: التوقيت المعين كـ ساعات التجميع (hpa) يبدأ في هذه الخطوة. يتم التحكم في حجم الأعضاء الناتجة عن عدد الخلايا الدهنية العميقة المضافة إلى أنبوب PCR. يمكن استخدام خلايا ectoderm العميقة من واحد أو أكثر من قبعات الحيوان، اعتمادا على الحجم المطلوب من organoid.
2. أغلق أنبوب PCR. الحفاظ على أنابيب PCR تستقيم للحث على التجميع التلقائي في الجزء السفلي.
3. مراقبة عملية التجميع تحت منظار مجسم. تتجمع الخلايا عادةً في الجزء السفلي من أنبوب PCR في غضون ساعة وتتجمع في مجاميع كروية في غضون 2-3 ساعة، حسب الحجم.
4. لإجراء التصوير الحي أو اختبار المخدرات أثناء تطوير العضيات الظهارية المخاطية ، قم بجمع المجاميع في 2 hpa باستخدام ماصة 200 ميكرولتر مزودة بنصائح مكبرة (قطع مع مقص معقمة) لتجنب التسبب في تلف المجاميع أثناء جمعها.
5. للسماح للمجاميع لتطوير في العضوية الظهارية المخاطية في الثقافة، وجمع المجاميع كروية من أنبوب PCR في 5 حصانا ونقلها إلى طبق بيتري مملوءة DFA.
6. ضع المجاميع بعيدا عن الآخرين لمنعهم من الذوبان. ضمن 24 ساعة من الثقافة في درجة حرارة الغرفة دون أي عوامل مضافة، يمكن ملاحظة الأعضاء الظهارية المخاطية الناضجة لتكون بالتناوب مع عمل من الأهداب الضرب تغطي سطح الظهارة المتمايزة

5. (اختياري) عالية الدقة حية التصوير من organoids النامية

1. إعداد مرنا للضريبة الدقيقة.
   1. لتصور الظهارة التي تحدث في المرحلة الأولى من تشكيل organoid، وإعداد مرنا لpscluds zonula الظهارية محددة -1 (زو-1) وتحديد أغشية الخلايا عن طريق تضخيم pCS2-ZO1-RFP وpCS2-mem-GFP plasmids (هدية من لانس ديفيدسون).
   2. استخراج وتكريب الحمض النووي البلازميد، ومن ثم نسخ مرنا توج باستخدام حزمة SP6/T7 في مجموعة النسخ في المختبر.
   3. Aliquot MRNA المنسوخة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
2. microinject الميرنا في جنين مخصّح
   1. ضع الأجنة المخصبة في 3٪ فيول في 1x MBS.
   2. تحميل 3-4 ميكرولتر من مرنا باستخدام طرف اللودر الصغير في إبرة زجاجية المسحوبة (طرف إبرة طويلة وغرامة مدبب بقطر داخلي 10\u201230 ميكرومتر).
   3. إرفاق الإبرة إلى الحقن المجهري وضبط الوقت والضغط لتقديم حجم ثابت من مرنا للضنجن المجهري.
   4. حقن مرنا فقط تحت سطح apical من القطب الحيواني. رقعة دائرية شاحبة اللون مميزة ناتجة عن توسع القشرة تكون مرئية في وقت الحقن المجهري.
   5. نقل الأجنة المحقونة إلى 1/3X MBS واستزراعها إلى المرحلة 9.5.
   6. جمع الأجنة المسماة بالفلور في إطار منظار استجمامي الفلوري (إعدادات الإثارة/الانبعاثات لـ GFP (488/510) و RFP (532/588)).
   7. تابع الخطوة 1.3.
3. تجميع وثقافة الجهاز (الأقسام 3 و 4) حتى المرحلة المرجوة من التنمية.
4. تنفيذ التصوير الحي.
   1. إعداد غرفة التصوير الزجاجي القاع عن طريق الإلتصاق الزجاج غطاء إلى غرفة الاكريليك مخصصة الطحن باستخدام الشحوم السيليكون.
      ملاحظة: بإحكام ختم الغرفة لمنع تسرب وسائل الإعلام الثقافة.
   2. املأ غرفة التصوير بـ DFA.
   3. اختيار واحد الإرسال السداسي المجهري الإلكترون (TEM) الشبكة (75 شبكة) من حاوية باستخدام ملقط وتطبيق كمية صغيرة من الشحوم على حافة الشبكة.
      ملاحظة: يجب أن يكون حجم شبكة أصغر من قطر الإجمالي بحيث يتم تجميع على الشبكة.
   4. اضغط لأسفل برفق لتأمين شبكة TEM إلى أسفل غرفة التصوير.
   5. نقل المجاميع إلى غرفة التصوير ووضعها داخل الشبكة.
      ملاحظة: تجنب وضع المجاميع بجوار الشحوم. طوال التجربة، يجب أن يجلس المجاميع على شبكة TEM دون الاتصال بالجزء السفلي من الغرفة لمنع الضغط المادي.
   6. ملء غرفة التصوير مع DFA وختم عليه مع غطاء الزجاج والشحوم.
      ملاحظة: يجب أن تكون الغرفة محكمة الإغلاق بدون فقاعات هوائية لمنع أي اضطراب أو حركة أثناء التصوير.
   7. لمتابعة تطور تشكيل الظهارية المخاطية، وجمع الوقت الفاصلة z-كومة الصور من المجاميع (من 2 حصانا) باستخدام المجهر confocal.
      ملاحظة: عادة ما نجمع ~ 120 ميكرومتر-سميكة ز-مكدسات كل 15 دقيقة باستخدام هدف 20X لمتابعة السلوكيات الحيوية الخلية، ولكن ينبغي أن تكون الأمثل هذه المواصفات لهدف التجارب.

6. (اختياري) التصوير تطوير organoids عن طريق التثبيت والمناعة

1. إصلاح الأجهزة في المرحلة المطلوبة من التنمية عن طريق نقلها إلى قارورة الزجاج مليئة حل المثبت.
   ملاحظة: إضافة وحدة تخزين من حل التثبيت الذي > 20 مرات من العينات لضمان التثبيت الكامل. تنفيذ العمليات التالية على nutator ما لم يذكر خلاف ذلك. بشكل عام، يتم إصلاح organoids مع 4٪ شبه شكلي (PFA) في برنامج تلفزيوني. ومع ذلك، قد تكون هناك حاجة إلى تثبيتات مختلفة للكشف عن بروتينات محددة. على سبيل المثال، استخدمنا 4٪ PFA مع 0.25٪ غلوتارالديهيد في برنامج تلفزيوني للكشف عن F-actin و توبولين الأسيتيلين. للكشف عن intelectin (ITLN) و ZO-1، يتم إصلاح الأجهزة بمحلول دنت البارد للجليد (4:1 الميثانول: ثنائي الفينيل سلفوكسيد) لليلة واحدة عند -20 درجة مئوية. يجب أن تكون العضية الثابتة من Dent المجففة بشكل متسلسل قبل الغسيل (الخطوة 6.3). يمكن تحسين مدة حضانة الجسم المضاد وغسله لاحتياجات محددة.
2. قم بإصلاح الأجهزة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
3. غسل 3 مرات مع PBST (PBS مع 0.1٪ تريتون X-100) لمدة 15 دقيقة في RT.
4. كتلة الربط غير محدد مع مصل الماعز 10٪ في PBST (PBSGT) لمدة 1 ساعة في RT.
5. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية (1:200) في PBSGT بين عشية وضحاها في 4 °C.
6. غسل 3 مرات مع PBST لمدة 15 دقيقة في RT.
7. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية (1:200) في PBSGT بين عشية وضحاها في 4 °C.
8. غسل 3 مرات مع PBST لمدة 15 دقيقة في RT.
9. نقل organoids الثابتة والممنعة إلى غرفة التصوير والمضي قدما مع التصوير confocal.

النتائج

هذا البروتوكول الموحد يولد عضوية ظهارية مخاطية من السلفة متعددة القدرات معزولة عن المرحلة الأولى gastrula X. الأجنة في غضون 24 ساعة من زراعة¹⁴. جمعت الخلايا المجهرية العميقة الذاتي تجميع لتشكيل تجميع في أنبوب PCR غير لاصقة والخضوع للظهار السطحي وتمايز الخلية القبل. السطح الظهارية حديثا من المجاميع يوفر الركيزة مماثلة للظهارة الأصلية الموجودة في الجسم الحي للخلايا الداخلية intercalating (على سبيل المثال، خلايا متعددة الciliated وغيرها من الملحقات) ويتطور لتشكيل العضيات الظهارية المخاطية(الشكل 1A, B). في غضون 24 ساعة بعد التجميع، والأعضاء الظهارية المخاطية المنظمة ذاتيا تجديد البشرة الناضجة التي لا يمكن أن تُميّز عن البشرة من الشرغوف. وتشمل الأجهزة ظهارة متمايزة تماما (الكيراتين)، وخلايا القبل المخاطية المفرزة (ITLN)، وخلايا متعددة الciliat (أسيتيلات توبيلين)، وخلايا إفرازية صغيرة (الفول السوداني agglutininin، السلطة الوطنية الفلسطينية)(الشكل 1C).

بالإضافة إلى تأكيد تطور أنواع الخلايا المختلفة مع مناعة، يمكن أن يتبع ديناميات التنمية العضوية من خلال التصوير الحي(الشكل 2A). لفحص الظهارة التي تظهر في مرحلة مبكرة من تشكيل الجهاز(الشكل 1B)،ونحن وصفت الأجنة عن طريق التعبير عن البروتينات الطورسنت الموسومة التقاء ضيق (ZO-1-RFP) والغشاء المترجمة البروتينات (mem-GFP). مع وضع العلامات المزدوجة، يمكن وضع علامة على الخطوات التسلسلية من ZO-1-إيجابية تشكيل تقاطع ضيق وتحليلها كميا أثناء الظهارة (الشكل 2). على سبيل المثال، بالنسبة للخلايا(الشكل 2B، أخضر اللون) في مراحل مختلفة من الظهارة (في 0 دقيقة) ، وقد تناثرت بعض المناطق من التصاق الخلية الخلية من اللوكتا من ZO -1(الشكل 2B، السهام الخضراء). في المقابل، مناطق أخرى قد تجميعها بالكامل، متجاورة ZO-1 التعبير(الشكل 2B،الأسهم الصفراء). مع مرور الوقت، وتجمهر puncta والاتصال لتشكيل تقاطعات ضيقة متجاورة(الشكل 2B، الأسهم الخضراء)، ومتجاورة وصلات ضيقة الحفاظ على مورفولوجيا حتى أثناء انقسام الخلية(الشكل 2B، الأسهم الصفراء). كما تنضج تقاطعات ضيقة، والخلايا تتحرك بشكل حيوي داخل وخارج السطح على طول الطائرات apical من organoids (الشكل 2C، D). وعلاوة على ذلك، من خلال تتبع الخلايا spatiotemporally على سطح organoids التمييز(الشكل 2B، الخلايا المرمزة بالألوان)، تحليل متعدد النطاقات ممكن، بدءا من puncta الفردية إلى وصلات ضيقة متجاورة، حدود الخلية الخلية، وفئات فرعية من مجموعات الخلايا داخل organoids.

الشكل 1: توليد الأعضاء الظهارية المخاطية.
(A) مخطط يبين بروتوكول لتجميع المجاميع الأكتودر العميق من الأجنة م. laevis. (ب) تخطيطي لنموذج من تشكيل الظهارية المخاطية الظهارية التي تنشأ من الخلايا الكوديدر العميقة متعددة القدرات (عرض المقطعية). تمر الخلايا المتمركزة السطحية إلى خلايا ظهارية وتتمايز إلى خلايا عابثة. تمييز الخلايا ciliated, الخلايا الإفرازية, و ionocytes تتشابك شعاعي في السطح وتجديد البشرة ناضجة. (C) أقصى عرض ض من الظهارة المخاطية المثبطة للمناعة لـ ITLN (خلايا القبل المنتجة للمخاطات)، أنبوبة الأسيتتيل (الخلايا ciliated)، السلطة الوطنية الفلسطينية (خلايا إفرازية صغيرة)، والكيراتين (الخلايا الظهارية) في العضويات عند 24 حصانا (لوحة علوية) وبشرة الشرغوف (لوحة أقل). شريط مقياس = 30 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التصوير الحي لتطوير الأعضاء.
(أ) تخطيطي لغرفة التصوير لعضوية حية (وليس على نطاق واسع). (ب)تسلسل الفاصل الزمني من مداخن confocal التي تم جمعها من مجاميع الخلايا الاكستودروم العميقة التي تعبر عن ZO-1-RFP وmm-GFP من 2.5 حصانا. شريط مقياس = 20 ميكرومتر. الخلايا هي الزائفة الملونة لتتبع مع مرور الوقت. خلية خضراء اللون لها حالات التصاق الخلايا المختلفة، بما في ذلك واحد تدريجيا تطوير ZO-1 التصاق إيجابي (السهام الخضراء) واحد الحفاظ على التصاق متجاورة زو-1 الإيجابية (الأسهم الصفراء) مع مرور الوقت. (C, D) تظهر الصور confocal الفاصلة بين الوقت من ZO-1-RFP التعبير عن مجاميع الخلايا الاكودية العميقة الخلايا المتداخلة شعاعي تتحرك إلى السطح (C، نجمة صفراء) وتتحرك داخل المجاميع (D، نجمة زرقاء). أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

الظهارة الظهارية المخاطية ولدت من الخلايا الدهنية العميقة من الجنين x. laevis هي أداة قوية لدراسة الظهارة والتمايز من السلفات متعددة القدرات في المختبر. على النقيض من اعتمادها على نطاق واسع الحيوان¹⁶ قبعة المقايسة المستخدمة في الجهاز في المختبر¹³ وتطوير الظهارية المخاطية^15,17,22 التي تستخدم ectoderm سليمة, العضويات العميقة المشتقة من الأكتودر المقدمة في هذا البروتوكول توفر فرصة متميزة لرصد مراحل تجديد الأنسجة التي تحركها الميكانيكا من الظهارة السطحية¹⁴. في حوالي 2 حصانا، ولدت حديثا ZO-1 الخلايا الظهارية الإيجابية(الشكل 2)تبدأ في الظهور على سطح apical من organoids وزيادة عدد سكانها لتغطية الجهاز بأكمله كما يوطد الأنسجة أو يقلل من الامتثال¹⁴. تجديد الظهارة ومواصفات النسب اللاحقة للخلايا القبل المنتجة للمخاط تسير تلقائيا في وسائل الإعلام الثقافة المحددة كيميائيا في غضون يوم واحد. هذه العضوية الظهارية المخاطية النامية بسرعة توفر منصة لدراسة سلوكيات الخلايا الديناميكية في الوقت الحقيقي ، في دقة عالية ، خلال الخطوات التقدمية للتجديد الظهاري. كما أنها تمكن من التحقيق في الأسئلة الأساسية التي تنشأ خلال تطوير ظهارة المخاطية ، وداء التوازن ، والأمراض المرتبطة بها^2،9،23. على وجه الخصوص، قد الحساسية الميكانيكية للخلايا السلف العميقة خلال الانتقال إلى سلائف خلية القبل الظهارية المحددة في organoids¹⁴ يمكن أن تعمل على ربط أمراض الجهاز التنفسي المرتبطة بالتمايز القاعدي غير الطبيعي حيث تكون خلايا القبل المخاطية السرية فوق أو تحت الإنتاج²³.

في حين أن هذا البروتوكول يوفر نهجا بسيطا لتوليد هذه organoids ، وهناك عدة خطوات حاسمة للنجاح في التجارب. لمنع تلوث الخلايا الظهارية السطحية أثناء عزل الخلايا الظهارية العميقة من غطاء الحيوان ، يجب على المرء مراقبة الغطاء الحيواني الموضوع في DFA خالية من الكالسيوم والمغنيسيوم تحت منظار مجسم والكشف عن الوقت المناسب لبدء فصل الطبقة السطحية الداكنة المصطبغة من غطاء الحيوان. إذا تم الاحتفاظ الأنسجة في الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من DFA لفترة طويلة جدا، فإن الأنسجة بأكملها تتفكك والتمييز بين الخلايا العميقة والسطحية ثم سيكون من المستحيل للمجاميع الأكتودر العميق. لتأكيد عدم وجود خلايا سطحية في مجاميع الأوكسيد العميقة ، نوصي بوضع علامة فلورية على السطح الزفي للجنين مع NHS-rhodamine (الخطوة 1.4¹⁴⁾قبل الجراحة الدقيقة ؛ وهذا من شأنه أن يسمح لتحديد سهلة من الخلايا السطحية إذا كانت موجودة في organoids الناتجة. منذ يتم تنظيم التجديد الظهاري من قبل ميكانيكا الأنسجة¹⁴، فمن الضروري تجنب توليد القوة غير المقصودة للتنظيم الذاتي organoids. على وجه الخصوص، نقترح تجنب الاتصال مع القاع الزجاجي لغرفة التصوير أثناء التصوير الحي عن طريق وضع المجاميع على حواف شبكات TEM لأن هذا يسمح بالاتصال المجاني مع نافذة التصوير للمجاميع الحية (الخطوة 5.1.2.). هذا في المختبر-مثقف، نموذج 3D منظم ذاتيا لظهارة mucociliary ستكون بمثابة أداة قابلة للاسترجاع للإجابة على الأسئلة الأساسية التي تنشأ أثناء تجديد ظهارة ومواصفات النسب من الخلايا القبل.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dual-stage Glass Micropipette Puller	Narishige	PC-100
Picoliter microinjector	Warner Instruments	PLI-100A
Confocal Laser Microscope
Stereoscope
Tools
Forcep	Dumont	Dumont #5
Hair knife		Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)
Hair loop		Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)
hCG injection
human chorionic gonadotropin	Sigma	cg10-10vl
MBS solution
10M Sodium hydroxide	Sigma	72068
Calcium chloride	Sigma	C3881
Calcium nitrate	Sigma	C1396
HEPES	Sigma	H4034
Magnesium sulfate	Sigma	230391
Phenol-red	Sigma	P0290
Potassium chloride	Sigma	7447-40-7
Sodium bicarbonate	Sigma	S6014
Sodium chloride	Sigma	S9625
Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g	Sigma	655104
dejellying solution
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma	C7880
Sodium hydroxide 10M	Sigma	72068
Ficoll solution
Ficoll	Sigma	F4375
DFA solution
Sodium chloride	Sigma	S9625
0.22mm Filter	Millipore	S2GPT05RE
Antibiotic Antimycotic Solution	Sigma	A5955
Bicine	Sigma	B3876
Calcium chloride	Sigma	C3881
Magnesium sulfate	Sigma	230391
Potassium gluconate	Sigma	G4500
Sodium carbonate	Sigma	222321
Sodium gluconate	Sigma	G9005
mRNA in vitro transcription
SP6/T7 in vitro transcription kit	Invitrogen	AM1340
mRNA microinjection
Borosilicate glass capillary tubes	Harvard Apparatus	GC100-10
Eppendorf microloader pipette tips	ThermoFisher	A25547
Mineral oil	Sigma	M5904
PCR tube coating
BSA	Thermofisher	26140079
PCR tubes	SSI	SSI-3245-00
Imaging
Custom-milled acrylic chamber
Coverglass 24mmX50mm	Duran	B01_001650
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh)	SPI	275HGN-XA
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh)	SPI	2775GN-XA
Silicone grease	Shinetsu	HIVAC-G
Fixation
20ml screw top-cap vial	Wheaton	WH.986580
2ml screw top-cap vial
Benzyl alcohol	Sigma	305197
Benzyl benzoate	Sigma	B6630
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sgima	D4540
Glutaraldehyde 10% EM GRADE	Electron Microscopy Sciences	16120
Goat serum	Jackson	005-000-121
Methanol	Sigma	322415
Paraforlamdehyde	Sigma	P6148
Phosphate-buffered saline (PBS)	LPS Solution	CBP007B
Triton X-100	Sigma	T8787
Primary antibody (1:200)
acetylated tubulin	Sigma	clone 6-11B-1
Itln1	Proteintech	11770-1-AP
Keratin	Developmental Studies Hybridoma Bank	1h5
ZO1	Invitrogen	402200
Vectors
pCS2-mem-GFP		Gift from Dr. Lance Davidson
pCS2-ZO1-RFP		Gift from Dr. Lance Davidson