Xenopus胚胎细胞的粘膜异体器官:生成、培养和高分辨率实时成像

摘要

我们描述了一个简单的方案，从从 Xenopus laevis 胚胎分离的深层皮球细胞中开发粘膜上皮器官。多能祖细胞再生上皮杯细胞前体，并允许实时跟踪器官表面细胞过渡的开始和进展。

摘要

粘膜上皮通过粘液生产和硅基介质间隙去除异物颗粒，从而提供了第一线。粘膜上皮的许多临床相关缺陷在体内深处发生时被推断。在这里，我们介绍了一个可处理的3D模型，用于从 Xenopus laevis 胚胎中微外科分离的多能祖体产生的粘膜上皮。粘膜上皮器官覆盖着来自深层异体细胞的新生成的上皮，随后用不同图案的多分细胞、分泌细胞和粘液产生的杯状细胞装饰，这些细胞在24小时内与原生表皮无法区分。在器官的面体表面出现的动态细胞从中层到上皮的完整序列可以通过高分辨率实时成像来跟踪。这些体外培养、自组织粘膜上皮器官在研究具有高效生成、明确培养条件、控制数量和大小以及在分化上皮再生期间直接获得活体成像的粘膜上皮生物学方面具有明显优势。

引言

粘膜上皮的损伤、感染和疾病与粘液的生产和清除受损有关，这些粘液经常出现在肺疾病中，如慢性阻塞性肺病、哮喘、囊性纤维化、支气管结裂和原发性硅酸肌病 1、2、3、4。例如，最近器官技术的进步，基底细胞衍生的肺器官称为气道层，它重述了粘膜上皮的再生，成为具有治疗潜力^1、5、6的^{有希望的模型}。然而，其使用目前是有限的，部分原因是缺乏明确的培养条件和器官生产效率低下。人类气道和青蛙表皮的粘膜上皮在组织形态、细胞组成及其功能^{7、8、9、10、11、12方面非常相似}。在这两种生物体中，粘膜上皮通过分泌粘液和抗菌物质提供一线防御，并通过硅丝的同步作用清除有害的颗粒和病原体。

在这里，我们描述了一个简单的协议，使用Xenopus laevis胚胎^13，14的多能祖体生成粘膜^上皮器官。此前，我们^报告14，在没有外源生长因子和细胞外基质的情况下，从早期胃膜分离的深细胞从早期胃膜中自发聚集成聚合体，在其表面再生上皮，并在24小时内通过交算多生生细胞和其他附属细胞成熟成粘膜上皮。除了快速发展，该协议提供了一个独特的机会，直接访问多能深层外皮细胞过渡到上皮杯状细胞祖细胞祖细胞，重新夺回被破坏的上皮^14的再生步骤，这是不能从完整的胚胎和外皮（也称为动物帽）15，16，17。通过控制Xenopus胚胎的起始材料，所生产的器官的数量和大小可以高效扩展。浮动培养物中的有机物可以很容易地在所需的阶段进行分类和转移，以便进行进一步分析，包括高分辨率成像、机械测试、药物治疗和遗传^表征14。这种自发的、组织力学驱动的胚胎细胞表面上皮再生，可产生粘膜上皮器官，为研究粘膜上皮生物学提供了一个新的三维（3D）模型。

研究方案

基础科学研究所（IBS 18-01）和韩国科学技术高级研究所（KA2017-22）的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准了动物使用和实验协议。

1. 胚胎

1. 使用标准程序获得X.laevis胚胎:手动从受刺激的雌蛙身上采集卵子，并进行^{体外受精18，19。}
2. 在pH 8¹⁹的pH 8 19下，用温和的搅拌在2%半胱氨酸中去混合受精胚胎，在1/3倍修饰巴特的盐水（MBS;见下面的1XMBS的配方）。
3. 活成像的可选步骤:荧光标记特定蛋白质并观察其在器官中的动力学，继续执行第5节。
4. （可选）为了监测器官内表面皮外皮细胞的污染，在第9 14阶段用NHS-罗达明标记胚胎的^表皮表面。在1毫克/mL NHS-罗达明中孵育胚胎，在1/3x MBS（pH 9.0）中孵育30分钟，用温和的坚果。将胚胎移植到装满1/3倍MBS的培养皿中，洗涤胚胎三次，15分钟。
5. 在首选温度（14~26 °C）下以1/3倍MBS培养胚胎，直到检测到第10阶段的第一个迹象（即，在植物视图的胚胎周围出现深色色素细胞）。

2. 微手术工具、解决方案和培养容器的准备

1. 准备所需的工具，包括一对手术级钳和头发工具（头发循环和发刀）的显微^外科20。
2. 为胚胎准备以下培养培养条件:1/3倍MBS， 其中 1X MBS 由 NaCl （88 mM）、KCl （1 mM）、NaHCO₃ （2.4 mM）、MgSO₄ （0.82 mM）、Ca（NO_3）2 （0.33 mM）、CaCl₂ （0.41 mM） 和 HEPES （10 mM） 组成。使用 10 M NaOH 将 pH 调整为 7.4。
   注:可选:添加酚红色滴以指示 pH。
3. 为胚胎组织和器官准备以下培养基:Danilchik的艾米^{（DFA）21，} 辅以新鲜1%的抗生素和抗霉菌溶液。使用 NaCl （53 mM）、Na₂CO₃ （5 mM）、葡萄糖酸钾 （4.5 mM）、葡萄糖酸钠 （32 mM）、CaCl₂ （1 mM） 和 MgSO₄ （1 mM） 准备 DFA。使用颗粒的 Bicine 将 pH 调整为 8.3。过滤 DFA（0.2 μm 瓶顶过滤器），等分，并将其储存在 -20 °C。
4. 准备无钙和无镁的DFA，使用上面的配方和省略CaCl_2和 MgSO 4，将深层细胞从外_皮分离。在20°C时储存。
5. 为胚胎细胞聚集准备非粘性PCR管。
   1. 为了诱导分离胚胎细胞的自发聚集，在4°C或室温下将圆底PCR管涂覆在200μL的1%BSA（100 mL蒸馏水中的1克BSA中1克）或2小时，制备非粘性PCR管。每个管子将用于组装一个器官。
   2. 使用 DFA 冲洗 BSA 涂层的 PCR 管三次，以去除任何残留的 BSA。
   3. 用 200 μL 的 DFA 填充 PCR 管。

3. 深皮细胞的分离

1. 选择和收集胚胎，因为他们到达早期阶段10使用头发工具下的立体镜。
2. 使用一次性转移移液器，将选定的胚胎移植到充满 DFA 的培养皿中。
3. 在不破坏胚胎动物侧的动物方面的情况下，用锋利的钳子去除胚胎的葡萄线膜。
   注:注意注意避免将胚胎暴露在空气中。将气泡引入溶液或将胚胎带到表面会导致胚胎破裂。
4. 要分离动物帽，请将胚胎的动物侧向上放置。
5. 目视估计要切除的动物帽的程度，用发刀沿着动物帽边缘进行第一个切口。向外拉发刀做切口。
6. 重复步骤 3.5 以创建一条小切口链，以切除动物帽。
7. 使用发刀修剪动物帽的厚层边缘，以防止包括中皮前体。
   注:为防止孤立的动物帽愈合和聚集，请于 10 分钟内继续执行下一步。通常，我们一次分离5~10个动物帽，以组装多种器官。
8. 要将深层异体细胞与动物帽分离，请将切除的动物帽转移到含有无钙和镁的 DFA 的 Petri 盘中，并配有一次性转移移液器。在传输过程中，注意不要引入任何气泡。
9. 为了保留足够的空间，使用头发工具，将动物帽定位到动物侧朝上，并与其他外植动物保持宽阔的距离。
10. 等待 5~10 分钟，然后在立体镜下监控外植。一旦从深色表面层的边缘发现松动的深层细胞，开始使用立体镜下的发刀将浅层从浅色深层异体细胞中抬离。
11. 用发刀小心地分离（剥落）肤浅的层，从边缘开始。
12. 以最小吸气（10μu201215 μL）收集深层异体细胞，以限制下一步转移到聚合介质的无钙和镁DFA的量。
    注:分离的表面细胞可以从介质中去除，以防止污染剩余的深层外皮细胞。

4. 粘膜上皮器官的生成

1. 将收集的深层异子细胞转移到含有 200 μL DFA 的非粘性 PCR 管中。轻轻移液介质（2\u20123 次），以分散 PCR 管中转移的细胞。
   注:指定为聚合后小时数 （hpa） 的计时从此步骤开始。所得器官的大小由添加到PCR管的深层异体细胞数量控制。可以使用一个或多个动物帽的深层异子细胞，具体取决于所需的器官大小。
2. 关闭 PCR 管。保持PCR管直立，在底部诱导自发聚集。
3. 在立体示波器下监视聚合过程。细胞通常在一小时内聚集在PCR管的底部，并在2~3小时内组装成球形聚集体，具体取决于大小。
4. 在粘膜上皮器官的发育过程中进行活体成像或药物测试，使用装有放大尖端的 200 μL 移液器（用消毒剪刀切割）以 2 hpa 收集集料，以避免在收集过程中对集料造成损害。
5. 为了让集料在培养中发育成粘膜上皮器官，以5hpa从PCR管收集球形集料，并转移到充满DFA的培养皿中。
6. 将聚合放在远离其他聚集的位置，以防止它们被引出。在室温下24小时内培养没有任何附加因素，成熟的粘膜上皮器官可以观察到旋转与殴打西莉亚覆盖分化上皮表面的行动

5. （可选） 发育中的器官的高分辨率实时成像

1. 为微注射准备 mRNA。
   1. 为了可视化在器官形成的初始阶段发生的上皮化，为上皮特异性分区闭塞蛋白-1（ZO-1）准备mRNA，并通过放大pCS2-ZO1-RFP和psCS2-mem-GFP质粒（兰斯·戴维森的礼物）来概述细胞膜。
   2. 提取质粒DNA并线性化，然后使用SP6/T7体外转录试剂盒转录带盖的mRNA。
   3. 将转录的 mRNA 等一，并将其储存在 -80 °C。
2. 微将mRNA植入受精胚胎
   1. 将受精胚胎放在 3% 菲科尔 1x MBS 中。
   2. 使用微装载机尖端将 3~4 μL 的 mRNA 加载到拉玻璃针中（内径为 10μ u201230 μm 的长细锥形针尖）。
   3. 将针头连接到微注射器，并调整时间和压力，以提供恒定体积的 mRNA 进行微注射。
   4. 将 mRNA 注射到动物杆的面下。在微注射时，可以看到由皮层膨胀引起的明显的浅色圆形斑块。
   5. 将注射的胚胎转移到1/3X MBS，并培养它们到9.5阶段。
   6. 在荧光立体镜下收集荧光标记的胚胎（GFP（488/510）和RFP（532/588）的激发/发射设置）。
   7. 继续执行步骤 1.3。
3. 组装和培养有机体（第3节和第4节），直到所需的发育阶段。
4. 执行实时成像。
   1. 使用硅润滑脂将盖玻璃粘合到定制磨碎的丙烯酸腔中，准备玻璃底成像室。
      注:请紧密密封腔室，以防止培养介质泄漏。
   2. 用 DFA 填充成像室。
   3. 使用钳子从容器中选取一个六角透射电子显微镜 （TEM） 网格 （75 网格），并在网格边缘涂抹少量润滑脂。
      注:网格的大小应小于聚合的直径，以便聚合位于网格上。
   4. 轻轻按下，将 TEM 网格固定到成像室的底部。
   5. 将聚合转移到成像室，并将它们定位在网格中。
      注:避免将集料定位在润滑脂旁边。在整个实验中，聚合体应位于 TEM 网格上，而不接触腔室底部以防止物理压缩。
   6. 用 DFA 填充成像室，用盖玻璃和润滑脂密封成像室。
      注:室应密封，无气泡，以防止成像过程中出现任何湍流或移动。
   7. 要跟踪粘膜上皮器官形成的进展，使用共体显微镜收集聚合（从2hpa）的延时z堆栈图像。
      注:我们通常每 15 分钟收集 ±120 μm 厚的 z 堆栈，使用 20 倍的目标遵循动态细胞行为，但这些规范应针对实验目标进行优化。

6. （可选） 通过固定和免疫污染成像发育器官

1. 将有机体转移到装满固定溶液的玻璃瓶中，在所需的发育阶段修复器官。
   注:添加一个固定溶液的量，是样品的 +gt;20 倍，以确保完全固定。除非另有说明，否则对螺母执行以下过程。一般来说，在PBS中，有机体与4%的甲醛（PFA）是固定的。然而，可能需要不同的固定物来检测特定的蛋白质。例如，我们在PBS中使用4%的PFA和0.25%的谷胱甘肽来检测F-actin和乙酰化的多肽。为了检测内青素（ITLN）和ZO-1，有机体用冰冷的电抗溶液（4:1甲醇:二甲基硫化物）固定在-20°C过夜。 登特的固定器官在洗涤前应连续脱水（步骤6.3）。抗体孵育和洗涤的持续时间可以针对特定需求进行优化。
2. 在室温 （RT） 或 4 °C 下过夜，将风向固定 15 分钟。
3. 用 PBST（PBS 与 0.1% Triton X-100）洗 3 次，在 RT 下洗 15 分钟。
4. 在RT中，用10%山羊血清阻断10%山羊血清的不特异性结合，使用1小时。
5. 在4°C下在PBSGT中用原抗体（1:200）孵育过夜。
6. 在 RT 用 PBST 清洗 3 次 15 分钟。
7. 在4°C下用二次抗体（1:200）在PBSGT中孵育过夜。
8. 在 RT 用 PBST 清洗 3 次 15 分钟。
9. 将固定和免疫污染的器官转移到成像室，然后进行共声成像。

结果

这种标准化的协议产生一个粘膜上皮器官从多能祖体从早期胃特鲁拉阶段X.laevis胚胎在24小时培养^14。收集深层异体细胞自组装，在非粘性PCR管中形成聚集体，并进行表面上皮化和杯状细胞分化。聚合体的新上皮表面提供类似于体内的原生上皮，用于内部细胞间分体（例如多西西细胞和其他附属细胞），并发展成粘膜上皮器官（图1A，B）。在聚合后24小时内，自组织上皮器官再生一个成熟的表皮，与一只小鱼的表皮无法区分。器官包括完全分化的上皮（角蛋白），粘液分泌杯状细胞（ITLN），多细胞（乙酰化管蛋白），和小分泌细胞（花生凝蛋白，PNA）（图1C）。

除了确认不同细胞类型与免疫污染的发展，器官发育的动力学可以遵循活成像（图2A）。为了研究在器官形成的早期阶段出现的上皮化（图1B），我们通过表达荧光标记的紧密结蛋白（ZO-1-RFP）和膜本地化蛋白（mem-GFP）来标记胚胎。通过双标记，可以在上皮化期间标记和定量分析ZO-1-正紧结形成的连续步骤（图2）。例如，对于上皮化不同阶段的细胞（图 2B，绿色）（在 0 分钟），一些细胞粘附区域具有 ZO-1 的散射（图2B，绿色箭头）。相比之下，其他区域已经完全组装，连续的ZO-1表达式（图2B，黄色箭头）。随着时间的推移，puncta 会连接并连接到形成连续的紧密结（图 2B，绿色箭头）和连续紧密结，即使在细胞分裂期间也保持其形态（图2B，黄色箭头）。当紧密的结成熟时，细胞沿着器官的平面动态地移出表面（图2C，D）。此外，通过跟踪细胞在区分器官表面（图2B，颜色编码细胞）的空头，可以进行多尺度分析，从单个pucta到连续的紧密结，细胞-细胞边界，以及器官内的细胞群的子集。

图1:粘膜上皮器官的生成。
（A） 显示从X.laevis胚胎中组装深层异体 集料的协议 示意图。（B） 源自多能深层外皮细胞（横截面视图）的粘膜上皮器官形成模型的示意图。表面定位的细胞进入上皮细胞，分化成杯细胞。区分硅化细胞、分泌细胞和离子细胞径向交联进入表面，并再生成熟的表皮。（C） 在24 hpa（上面板）和小极表皮（下面板）的器官中，为 ITLN（产生粘液的杯状细胞）、乙酰化多肽（胆小细胞）、PNA（小分泌细胞）和角蛋白（上皮细胞）的粘膜上皮免疫的最大 z 投影。比例线 = 30 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:发育器官的活图。
（A） 活体体成像室的示意图（不缩放）。（B） 从从深异体细胞聚合中收集的共体堆栈的延时序列，从 2.5 hpa 中表达 ZO-1-RFP 和 mem-GFP。比例线 = 20 μm。单元格是伪色的，用于随着时间的推移进行跟踪。绿色细胞具有不同的细胞附着力状态，包括一个逐渐发展ZO-1正粘附（绿色箭头）和一个保持连续的ZO-1正粘附（黄色箭头）。（C， D）ZO-1-RFP 表达深异体细胞聚集的延时共合图像显示径向交汇细胞移动到表面（C，黄星）并在聚合体（D、蓝星）内移动。比例线 = 10 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

由X.laevis胚胎深层外皮细胞产生的粘膜上皮器官是研究体外多能祖细胞的上皮化和分化的有力工具。与广泛采用的动物帽测定¹⁶用于体外器官^发生13和粘膜上皮15，17，22的发展，利用完整的外皮，在该协议中呈现的深层异体衍生器官提供了一个独特的机会，监测表面上皮^14的组织力学驱动的再生阶段。在大约2hpa，新生成的ZO-1阳性上皮细胞（图2）开始出现在器官的脂肪表面，并增加其数量，以覆盖整个器官组织凝固或减少符合^性14。产生粘液的杯具细胞的上皮和后续血统规格的再生在一天内自发地在化学定义的培养培养中进行。这些快速发展的粘膜上皮器官提供了一个平台，用于在上皮再生的渐进步骤中实时、高分辨率地检查动态细胞行为。它们还能够调查在粘膜上皮发育、平衡和相关疾病^{2、9、23期间出现的基本问题}。特别是^{，在向器官14}中识别的上皮杯状细胞前体过渡过程中，深层祖细胞的机械敏感性可能有助于将与异常基底分化相关的呼吸系统疾病联系起来，其中粘液分泌的杯状细胞过度或生产不足^23。

虽然该协议提供了一个简单的方法来生成这些器官，有几个关键步骤，在实验中取得成功。为了防止在从动物帽分离深层外皮细胞过程中对表面上皮细胞进行污染，应监测置于立体镜下无钙和镁 DFA 中的动物帽，并检测开始分离动物帽中深色表面层的正确时间。如果组织在无钙和无镁的 DFA 中保存太久，整个组织将分离，区分深层细胞和表面细胞，则深度外皮聚集体是不可能的。为了确认深层外皮聚集物中缺乏表面细胞，我们建议在显微手术前用NHS-罗达明（步骤1.4^14）荧光标记胚胎的脂肪表面;这将允许容易识别表面细胞，如果它们存在于由此产生的器官中。由于上皮再生是由组织力学¹⁴调节的，因此必须避免自组织器官产生意外的力量。特别是，我们建议在实时成像过程中避免与成像室的玻璃底部接触，将集料放置在 TEM 网格的边缘，因为这样可以自由接触实时聚合的成像窗口（步骤 5.1.2.）。这种体外培养的、自行组织的粘膜上皮3D模型将作为一个可操作的工具，回答上皮再生过程中出现的基本问题和杯具细胞的谱谱规范。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dual-stage Glass Micropipette Puller	Narishige	PC-100
Picoliter microinjector	Warner Instruments	PLI-100A
Confocal Laser Microscope
Stereoscope
Tools
Forcep	Dumont	Dumont #5
Hair knife		Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)
Hair loop		Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)
hCG injection
human chorionic gonadotropin	Sigma	cg10-10vl
MBS solution
10M Sodium hydroxide	Sigma	72068
Calcium chloride	Sigma	C3881
Calcium nitrate	Sigma	C1396
HEPES	Sigma	H4034
Magnesium sulfate	Sigma	230391
Phenol-red	Sigma	P0290
Potassium chloride	Sigma	7447-40-7
Sodium bicarbonate	Sigma	S6014
Sodium chloride	Sigma	S9625
Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g	Sigma	655104
dejellying solution
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma	C7880
Sodium hydroxide 10M	Sigma	72068
Ficoll solution
Ficoll	Sigma	F4375
DFA solution
Sodium chloride	Sigma	S9625
0.22mm Filter	Millipore	S2GPT05RE
Antibiotic Antimycotic Solution	Sigma	A5955
Bicine	Sigma	B3876
Calcium chloride	Sigma	C3881
Magnesium sulfate	Sigma	230391
Potassium gluconate	Sigma	G4500
Sodium carbonate	Sigma	222321
Sodium gluconate	Sigma	G9005
mRNA in vitro transcription
SP6/T7 in vitro transcription kit	Invitrogen	AM1340
mRNA microinjection
Borosilicate glass capillary tubes	Harvard Apparatus	GC100-10
Eppendorf microloader pipette tips	ThermoFisher	A25547
Mineral oil	Sigma	M5904
PCR tube coating
BSA	Thermofisher	26140079
PCR tubes	SSI	SSI-3245-00
Imaging
Custom-milled acrylic chamber
Coverglass 24mmX50mm	Duran	B01_001650
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh)	SPI	275HGN-XA
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh)	SPI	2775GN-XA
Silicone grease	Shinetsu	HIVAC-G
Fixation
20ml screw top-cap vial	Wheaton	WH.986580
2ml screw top-cap vial
Benzyl alcohol	Sigma	305197
Benzyl benzoate	Sigma	B6630
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sgima	D4540
Glutaraldehyde 10% EM GRADE	Electron Microscopy Sciences	16120
Goat serum	Jackson	005-000-121
Methanol	Sigma	322415
Paraforlamdehyde	Sigma	P6148
Phosphate-buffered saline (PBS)	LPS Solution	CBP007B
Triton X-100	Sigma	T8787
Primary antibody (1:200)
acetylated tubulin	Sigma	clone 6-11B-1
Itln1	Proteintech	11770-1-AP
Keratin	Developmental Studies Hybridoma Bank	1h5
ZO1	Invitrogen	402200
Vectors
pCS2-mem-GFP		Gift from Dr. Lance Davidson
pCS2-ZO1-RFP		Gift from Dr. Lance Davidson