JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم تقديم بروتوكول محسن عالي الإنتاجية تم تطويره باستخدام كواشف علامة كتلة ترادفية 16-plex ، مما يتيح التنميط الكمي للبروتين للعينات البيولوجية. تجزئة الأس الهيدروجيني الأساسية الشاملة وLC-MS / MS عالية الدقة تخفف من ضغط النسبة وتوفر تغطية بروتيوم عميقة.

Abstract

تستخدم علامة الكتلة الترادفية متساوية الضغط (TMT) على نطاق واسع في البروتينات بسبب قدرتها العالية على تعدد الإرسال وتغطيتها البروتينية العميقة. في الآونة الأخيرة ، تم تقديم طريقة TMT موسعة 16-plex ، مما يزيد من إنتاجية الدراسات البروتينية. في هذه المخطوطة ، نقدم بروتوكولا محسنا لتنميط البروتيوم العميق القائم على TMT 16-plex ، بما في ذلك تحضير عينة البروتين ، والهضم الأنزيمي ، وتفاعل وضع العلامات TMT ، وتجزئة الكروماتوغرافيا السائلة ثنائية الأبعاد ذات الطور العكسي (LC / LC) ، وقياس الطيف الكتلي الترادفي (MS / MS) ، ومعالجة البيانات الحسابية. يتم تسليط الضوء على خطوات مراقبة الجودة الحاسمة والتحسينات في العملية الخاصة بتحليل TMT 16-plex. توفر هذه العملية متعددة الإرسال أداة قوية لتنميط مجموعة متنوعة من العينات المعقدة مثل الخلايا والأنسجة والعينات السريرية. يمكن قياس أكثر من 10,000 بروتين وتعديلات ما بعد الترجمة مثل الفسفرة والمثيلة والأستيل والانتشار في عينات بيولوجية معقدة للغاية من ما يصل إلى 16 عينة مختلفة في تجربة واحدة ، مما يوفر أداة قوية للبحث الأساسي والسريري.

Introduction

مكنت التطورات السريعة في تكنولوجيا قياس الطيف الكتلي من تحقيق حساسية عالية وتغطية بروتينية عميقة في تطبيقات البروتينات1،2. على الرغم من هذه التطورات ، يظل مضاعفة الإرسال للعينات هو عنق الزجاجة للباحثين الذين يتعاملون مع تحليل مجموعة عينة كبيرة.

تستخدم تقنيات وضع العلامات متساوية الضغط متعددة الإرسال على نطاق واسع للقياس الكمي النسبي على مستوى البروتين لدفعات كبيرة من العينات3،4،5،6. يعد القياس الكمي المستند إلى علامات الكتلة الترادفية (TMT) خيارا شائعا لقدرته العالية على تعددالإرسال 7,8. تم إطلاق كواشف TMT في البداية كمجموعة 6-plex قادرة على تحديد ما يصل إلى 6 عينات في وقت واحد9. تم توسيع هذه التقنية بشكل أكبر لتحديد 10-11 عينة10،11. أدت الكواشف التي تم تطويرها مؤخرا من 16 بليكس TMTpro (تسمى TMT16 فيما بعد) إلى زيادة قدرة تعدد الإرسال إلى 16 عينة في تجربة واحدة12،13. تستخدم كواشف TMT16 مجموعة مراسلين قائمة على البرولين ، بينما تطبق 11-plex TMT مجموعة مراسلين مشتقة من ثنائي ميثيل بيبيريدين. يستخدم كل من TMT11 و TMT16 نفس المجموعة التفاعلية للأمين ، لكن مجموعة توازن الكتلة في TMT16 أكبر من تلك الموجودة في TMT11 ، مما يتيح الجمع بين 8 نظائر مستقرة C13 و N15 في أيونات المراسل لتحقيق 16 مراسلا (الشكل 1).

توفر الزيادة في قدرة تعدد الإرسال منصة لتصميم التجارب ذات التكرارات الكافية للتغلب على التحديات الإحصائية14. علاوة على ذلك ، تساعد القنوات الإضافية في TMT 16-plex في تقليل الكمية الإجمالية للمواد الأولية لكل قناة ، مما قد يساعد في تطوير البروتينات أحادية الخليةالناشئة 15. ستكون قدرة تعدد الإرسال العالية ذات قيمة أيضا في القياس الكمي للتعديلات اللاحقة للترجمة ، والتي تتطلب عادة كميات كبيرة من المواد الأولية16،17.

تم تبسيط سير العمل البروتيني الذي يستخدم تقنية TMT18،19،20 ، وقد تطورت بشكل كبير خلال العقد الماضي من حيث إعداد العينة ، وفصل الكروماتوغرافيا السائلة ، والحصول على البيانات الطيفية الكتلية ، والتحليل الحسابي21،22،23،24،25،26. تقدم مقالتنا السابقة نظرة عامة متعمقة على منصة TMT 10-plex27. يقدم البروتوكول الموصوف هنا طريقة مفصلة ومحسنة ل TMT16 ، بما في ذلك استخراج البروتين وهضمه ، ووضع العلامات على TMT16 ، وتجميع العينات وتحلية المياه ، ودرجة الحموضة الأساسية ، والمرحلة العكسية للأس الهيدروجيني الحمضي (RP) LC ، وMS عالي الدقة ، ومعالجة البيانات (الشكل 2). يسلط البروتوكول الضوء أيضا على خطوات مراقبة الجودة الرئيسية التي تم دمجها لإكمال تجربة البروتينات الكمية بنجاح. يمكن استخدام هذا البروتوكول بشكل روتيني لتحديد وتحديد أكثر من 10,000 بروتين ذات قابلية عالية للتكاثر ، لدراسة المسارات البيولوجية والعمليات الخلوية وتطور المرض20،28،29،30.

Protocol

تم الحصول على الأنسجة البشرية للدراسة بموافقات من برنامج التبرع بالدماغ والجسم في معهد بانر صن لأبحاث الصحة.

1. استخراج البروتين من الأنسجة ومراقبة الجودة

ملاحظة: لتقليل تأثير حصاد العينات على البروتين ، من الضروري جمع العينات في أقل وقت ممكن عند درجة حرارة منخفضة إن أمكن31. هذا مهم بشكل خاص عند تحليل تعديلات ما بعد الترجمة لأنها عادة ما تكون قابلة للتغيير ، على سبيل المثال ، تحتوي بعض أحداث الفسفرة على بضع ثوان فقط من عمر النصف32،33.

  1. استئصال ووزن عينات المناديل
    1. قم بتفريغ أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل باستخدام ميزان تحليلي وقم بتبريد الأنبوب مسبقا فوق الثلج الجاف.
    2. قم بقطع نسيج مجمد (على سبيل المثال ، أنسجة المخ البشري ، ~ 10 مجم) من منطقة محددة إلى قطع صغيرة وانقل قطع الأنسجة إلى الأنبوب المبرد مسبقا على الفور.
      ملاحظة: لتقليل عدم تجانس العينة ، من المهم استخدام أحجام متجانسة ومناطق تشريحية لجميع العينات ال 16. عادة ما تكون كمية البروتين التي يتم الحصول عليها من الأنسجة 5-10٪ من وزن الأنسجة.
    3. قم بوزن الأنبوب مع الأنسجة وضع الأنبوب على الفور على الثلج الجاف. قم بمعالجة العينات ال 15 المتبقية باستخدام نفس الإجراء. احتفظ بالعينات في الثلج الجاف مباشرة بعد التشريح ، وخزنها في درجة حرارة 80 درجة مئوية.
  2. عينات أنسجة الليز
    1. قم بإعداد مخزن تحلل طازج (50 ملي مولار هيبس ، درجة الحموضة 8.5 ، 8 م يوريا ، و 0.5٪ ديوكسي كولات الصوديوم) في يوم التجربة. يجب إضافة مثبطات الفوسفاتيز إلى مخزن التحلل المخزن المؤقت للحفاظ على حالة فسفرة البروتينات.
      ملاحظة: ضع المخزن المؤقت للتحلل في درجة حرارة الغرفة قبل استخدامه ، حيث أن 8 ملايين من اليوريا سوف تترسب على الجليد ، مما قد يؤدي إلى تمسخ البروتين غير المكتمل أثناء تحلل العينة وتقليل كفاءة هضم البروتين.
    2. أضف مخزن التحلل المؤقت (أضف 100 ميكرولتر من محلول التحلل لكل 10 مجم من الأنسجة لتحقيق تركيز بروتين نهائي من 5 إلى 10 ميكروغرام / ميكرولتر) وخرز زجاجي (~ 20٪ من حجم المحللة ، قطر 0.5 مم) لكل عينة.
    3. قم بتحلل الأنسجة في الخلاط عند 4 درجات مئوية مع ضبط السرعة 8 لمدة 30 ثانية ، والاستراح لمدة 5 ثوان ، وكرر حتى تتجانس العينات (~ 5 دورات).
  3. تحضير حصص من اللايسات.
    1. قم بإعداد حصتين على الأقل لكل عينة. يتم استخدام كمية صغيرة (~ 10 ميكرولتر) لتحليل تركيز البروتين وتقييم جودة البروتين (على سبيل المثال ، التحقق من صحة النشاف الغربي لبروتينات التحكم الإيجابي). يتم استخدام كمية أكبر (~ 50 ميكرولتر) لتحليل البروتينات.
    2. قم بتجميد الكميات على الفور على الثلج الجاف ، واحفظها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر.
  4. قياس تركيز البروتين
    ملاحظة: يمكن قياس تركيز البروتين عن طريق مقايسة BCA أو طريقة تلطيخ جل SDS القصيرة34 (الشكل 3 أ). نظرا لأن المكونات المختزلة غير البروتينية في محللة الأنسجة قد تؤثر على القياس في مقايسة BCA ، يمكن للمستخدمين التحقق من صحة تركيز البروتين من خلال طريقة تلطيخ جل SDS القصيرة. يتم عرض طريقة تلطيخ جل SDS القصيرة هنا.
    1. قم بتخفيف 16 عينة مقتبسة بمقدار 10 أضعاف وقم بإعداد معيار BSA (على سبيل المثال ، معايرة BSA بمقدار 0.15 و 0.5 و 1.5 و 3 ميكروغرام).
    2. قم بتشغيل العينات ومعيار BSA على جل SDS-PAGE بنسبة 10٪ (26 بئر) باستخدام جل التكديس حتى تهاجر جميع البروتينات حوالي 3 مم إلى الجل.
    3. قم بتلطيخ الجل باللون الأزرق Coomassie لمدة ساعة واحدة ، وقم بإزالة بقع الجل حتى تصبح الخلفية في المنطقة الفارغة واضحة.
    4. امسح الجل ضوئيا لقياس شدة نطاقات البروتين الملطخة ب Coomassie بواسطة ImageJ وقم بإنشاء منحنى قياسي BSA وفقا للقياسات.
    5. احسب تركيز البروتين المطلق بالمنحنى القياسي.
      ملاحظة: كان تركيز البروتين النهائي لكل عينة في هذه التجربة ~ 5-10 ميكروغرام / ميكرولتر. بالنسبة لتحليل البروتينات المستند إلى TMT16 ، يكفي 50 ميكروغرام من البروتين لكل عينة (إجمالي 0.8 مجم بروتين لتحليل البروتين الكامل).
  5. مراقبة جودة العينة
    ملاحظة: تعد خطوة مراقبة الجودة هذه أمرا بالغ الأهمية لتحديد العينات منخفضة الجودة قبل إجراء تحليل TMT. بالنسبة للعينات ذات التغير البروتيني المعروف ، يقترح التحقق من صحة التغيير عن طريق النشاف الغربي. يوصى أيضا بتحليل SDS-PAGE القياسي لفحص أنماط البروتين واستبعاد أي عينات ذات درجات عالية من التحلل (الشكل 3 ب).
    1. خذ ~ 10 ميكروغرام من كل عينة من الكمية الصغيرة وقم بتشغيل العينات على جل SDS-PAGE متدرج حتى تصل الصبغة الزرقاء البروموفينول إلى قاع الجل.
    2. تلطخ الجل باللون الأزرق Coomassie ، وقم بإزالة بقع الجل. افحص جودة البروتين لإزالة عينات البروتين شديدة التحلل.
      ملاحظة: يمكن تحديد العينات المتدهورة على أنها عينات تحتوي على عدد قليل جدا من نطاقات البروتين في منطقة الوزن الجزيئي العالي والنطاقات المكثفة في منطقة الوزن الجزيئي المنخفض (الشكل 3 ب).

2. هضم البروتين في المحلول ، وتقليل الببتيد والألكلة ، واختبار كفاءة الهضم ، وتحلية الببتيد

  1. هضم البروتين بواسطة Lys-C و Trypsin
    1. خذ ~ 50 ميكروغرام من البروتين من الكمية الكبيرة لكل عينة وأضف المخزن المؤقت للتحلل إلى 50 ميكرولتر.
    2. أضف 100٪ أسيتونيتريل (ACN) للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 10٪.
    3. قم بإجراء عملية هضم Lys-C عن طريق إضافة Lys-C بنسبة بروتين: Lys-C تبلغ 100: 1 (وزن / وزن) واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات.
    4. يتم تخفيف العينات لتحتوي على تركيز نهائي يبلغ 2 M Urea × 50 mM HEPES (درجة الحموضة 8.5).
    5. أضف التربسين إلى كل عينة بنسبة بروتين: التربسين 50: 1 (وزن / وزن) وقم بإجراء عملية الهضم في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات أو بين عشية وضحاها.
  2. تقليل الببتيد والألكلة
    1. أضف محلول ثنائي يثيوثريتول (1 M DTT) المحضر حديثا إلى تركيز نهائي 1 ملي واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لتقليل روابط ثاني كبريتيد.
    2. أضف محلول اليودوأسيتاميد الطازج (1 M IAA) إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ملي مولار لمدة 30 دقيقة في الظلام إلى بقايا السيستين المؤلكلات.
    3. قم بإخماد IAA غير المتفاعل عن طريق إضافة 1M DTT إلى تركيز نهائي يبلغ 30 ملي مولار واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أخرى.
  3. فحص كفاءة الهضم
    1. خذ ~ 1 ميكروغرام من كل عينة وقم بتحلية المياه باستخدام أطراف ماصة مطلية بالراتنج C18 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    2. قم بتحليل كل عينة بواسطة تشغيل LC-MS/MS متدرج قصير (انظر المزيد من التفاصيل في الخطوة 5).
    3. قم بإجراء بحث في قاعدة البيانات عن بيانات MS الأولية (انظر المزيد من التفاصيل في الخطوة 6). احسب النسبة المئوية للببتيدات المحددة مع موقع انقسام التربسين واحد على الأقل. عادة ما تكون النسبة أقل من 15٪.
    4. إذا كانت النسبة أكبر من 15٪ ، أضف التربسين الإضافي إلى العينات لتكرار عملية الهضم.
    5. بعد الهضم ، قم بتحمض العينات عن طريق إضافة TFA إلى 0.5٪ (حجم / حجم). تحقق من الرقم الهيدروجيني بواسطة شريط الأس الهيدروجيني للتأكد من أن الرقم الهيدروجيني أقل من 3.
  4. تحلية الببتيد
    1. جهاز الطرد المركزي الببتيدات المحمضة عند 21,000 × جم لمدة 10 دقائق. انقل المواد الطافية إلى أنبوب جديد.
    2. اغسل أعمدة تحلية C18 (~ 25 ميكرولتر من الراتنج) مرتين باستخدام 250 ميكرولتر من الميثانول بنسبة 100٪ عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 30 ثانية.
      ملاحظة: لتقليل فقد الببتيدات أثناء عملية التحلية ، اختر أعمدة تحلية المياه ذات سعة الربط المطابقة لكمية المدخلات.
    3. اغسل الأعمدة مرتين باستخدام 250 ميكرولتر من محلول الشطف (60٪ ACN ، 0.1٪ TFA) عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 30 ثانية.
    4. قم بموازنة الأعمدة مرتين مع 250 ميكرولتر من التوازن ومخزن الغسيل (0.1٪ TFA) عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 30 ثانية.
    5. تحميل العينات على الأعمدة المتوازنة مسبقا. دع العينات ترتبط بالأعمدة عن طريق الدوران عند 100 × جم لمدة 6 دقائق. تأكد من مرور كل الحل عبر العمود.
    6. اغسل الأعمدة ثلاث مرات بسعة 250 ميكرولتر من التوازن واغسل المخزن المؤقت عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 30 ثانية.
    7. قم بإزالة الببتيدات عن طريق إضافة 125 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف إلى كل عمود والدوران عند 100 × جم لمدة 3 دقائق. تأكد من أن العمود لا يحتوي على أي محلول متبقي.
    8. جفف الببتيدات المملوءة في مكثف فراغ وقم بتخزين الببتيدات عند -80 درجة مئوية لوضع العلامات على TMT في المستقبل.

3. وضع العلامات TMT16 على الببتيدات ، واختبار كفاءة وضع العلامات ، وتجميع العينات ، وتحلية الببتيد المسمى

  1. TMT16 وضع العلامات على الببتيدات
    1. أعد تعليق كل عينة ببتيد محلية في 50 ميكرولتر من 50 ملي مولار HEPES (درجة الحموضة 8.5) عن طريق الدوامة عدة مرات أو الذوبان بالموجات فوق الصوتية متبوعا باستخدام شريط الأس الهيدروجيني للتحقق من الأس الهيدروجيني.
      ملاحظة: قد تكون العينة حمضية إذا لم يتم تجفيفها تماما قبل وضع العلامات ، مما يؤثر سلبا على كفاءة وضع العلامات. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني بين 7 و 8.
    2. خذ ~ 1 ميكروغرام من الببتيدات غير المسماة من كل عينة كعناصر تحكم سلبية لاختبار كفاءة وضع العلامات TMT.
    3. قم بإذابة كواشف TMT16 في ACN اللامائية. قم بإجراء تفاعل وضع العلامات عن طريق إضافة الكواشف عند نسبة البروتين TMT: 1.5: 1 (وزن / وزن) واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: نسبة البروتين TMT: المستخدمة في TMT16 أعلى بنسبة 50٪ من النسبة المستخدمة في TMT11. قد يكون هذا التناقض الصغير بسبب كون الكتلة الجزيئية ل TMT16 أكبر (1.2 ضعف) من تلك الموجودة في كواشف TMT11. يتم تقدير كمية البروتين من العينات دون النظر في الخسارة أثناء تحلية المياه.
  2. اختبار كفاءة وضع العلامات
    1. خذ ~ 1 ميكروغرام من الببتيدات المصنفة من كل عينة لاختبار كفاءة وضع العلامات. ضع العينات المتبقية عند -80 درجة مئوية دون إخماد التفاعل.
    2. قم بتحلية ~ 1 ميكروغرام لكل من العينات التي تحمل علامة TMT16 وغير المصنفة بواسطة أطراف ماصة مطلية بالراتنج C18 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    3. قم بتحليل العينات بواسطة LC-MS / MS (انظر القسم 5 ، باستثناء أن التدرج هو 10 دقائق).
    4. تقدير كفاءة وضع العلامات من خلال تحليل تقليل شدة MS1 للببتيدات غير المسماة بين العينات غير المسماة والمصنفة. حدد من 6 إلى 10 ببتيدات مختلفة للتحقق من كفاءة وضع العلامات للتأكد من تسمية جميع الببتيدات.  لوضع العلامات الكاملة ، لا يتم ملاحظة الببتيدات غير المسماة.
      ملاحظة: من المهم ضمان وضع العلامات الكاملة لجميع العينات لتحديد البروتين بدقة وتقديره الكمي.
    5. إذا لم تكتمل الملصقات ، فأضف كواشف TMT إضافية لتسمية الببتيدات المتبقية وتحقق من كفاءة وضع العلامات مرة أخرى قبل التبريد. بعد تسمية العينة بالكامل ، قم بإخماد التفاعل في درجة حرارة الغرفة عن طريق إضافة هيدروكسيلامين إلى تركيز نهائي 0.5٪ واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  3. تجميع العينات وتحلية المياه
    1. تجمع نصف كل عينة تحمل علامة TMT لعمل خليط.
    2. خذ 1 ميكروغرام من الخليط وقم بتحلية أطراف الماصة المطلية بالراتنج C18، ثم قم بتحليلها بواسطة LC-MS/MS باستخدام تدرج قصير (~ 30 دقيقة).
    3. احسب التركيز النسبي باستخدام متوسط شدة كل أيون مراسل TMT16 ومقارنة التناقضات بين القنوات ال 16. لتحقيق خلط متساو لكل قناة ، أضف ما تبقى من العينات المسماة TMT إلى الخليط وفقا لمتوسط الكثافة المحسوب. كرر الضبط حتى يتم خلط جميع العينات بالتساوي. وترد البيانات التمثيلية التي توضح عملية تجميع العينات في الجدول 1.
      ملاحظة: نظرا لأن أخطاء سحب العينة قد تؤثر على دقة التركيزات وكمية البروتين، فمن المهم ضمان كمية التجميع بشكل صحيح. يجب أن تكون التباينات في الشدة بين 16 عينة أقل من 5٪.
  4. تحلية الببتيد المسمى
    ملاحظة: نظرا لأن مشتقات الخلفية في تفاعل وضع العلامات TMT16 (على سبيل المثال ، TMTpro-NHOH من تفاعل تبريد الهيدروكسيلامين ، و TMTpro-OH من هيدروكسيل TMT) كارهة للماء ، يتم استخدام حالة غسيل واسعة النطاق للعينات التي تحمل علامة TMT16 لإزالة المشتقات بشكل فعال. يتم استخدام إضافة 5٪ ACN في مخزن الغسيل العادي (0.1٪ TFA) و 10x أحجام سرير من مخزن الغسيل.
    1. قم بتحمض العينة المجمعة عن طريق إضافة 10٪ TFA إلى درجة الحموضة < 3.
    2. قم بالطرد المركزي للعينة المجمعة عند 21,000 × جم لمدة 10 دقائق وضع المادة الطافية في أنبوب جديد.
    3. جفف العينة باستخدام مكثف فراغ لإزالة ACN.
    4. قم بتكييف خرطوشة استخراج الطور الصلب مسبقا التي تحتوي على عمود ماص 50 مجم عن طريق غسل العمود ب 2 مل من الميثانول بنسبة 100٪ متبوعا ب 2 مل من محلول الشطف (60٪ ACN بالإضافة إلى 0.1٪ TFA) وأخيرا 2 مل من محلول الغسيل (0.1٪ TFA).
    5. قم بتحميل العينة على العمود. اضبط معدل التدفق على ~ 100 ميكرولتر / دقيقة لضمان المدى الكامل لارتباط الببتيد. احفظ التدفق من خلال.
    6. اغسل العمود ثلاث مرات باستخدام 1 مل مخزن مؤقت للغسيل.
    7. الببتيدات الرقيقة مع 1 مل عازلة شطف.
    8. جفف الببتيدات المملوءة في مكثف فراغ وقم بتخزين الببتيدات عند -80 درجة مئوية لمزيد من التجزئة.

4. التجزئة المسبقة لدرجة الحموضة الأساسية LC غير المتصلة بالإنترنت

  1. إعداد نظام التجزئة
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت A (فورمات الأمونيوم 10 ملي مولار ، درجة الحوضة 8.0) والمخزن المؤقت B (فورمات الأمونيوم 10 ملي مولار ، 90٪ ACN ، درجة الحموضة 8.0) لنظام LC عالي الأداء بتدفق ميكرولتر.
    2. قم بإعداد عمود HPLC يحتوي على جزيئات إيثيلين هجينة جسورية (حجم جسيمات 3.5 ميكرومتر ، 4.6 مم × 25 سم) في نظام LC عالي الأداء بتدفق ميكرولتر للتجزئة.
    3. قم بتثبيت حلقة عينة سعة 100 ميكرولتر واغسل الحلقة ب 300 ميكرولتر من الميثانول والماء والمخزن المؤقت A بالتتابع.
    4. استخدم 100 ميكرولتر من نسبة 1: 1: 1: 1 من الأيزوبروبانول: الميثانول: الأسيتونيتريل : الماء لغسل العمود. بعد ذلك ، قم بزيادة موازنة العمود لمدة 0.5 ساعة في 95٪ من المخزن المؤقت A.
  2. تحضير العينة
    1. قم بإذابة عينة TMT16 المجمعة والمحلية في 70 ميكرولتر من المخزن المؤقت A. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني للعينة هو ~ 8.0. إذا كان لا يزال حمضيا ، فاضبط الرقم الهيدروجيني على 8.0 باستخدام 28٪ هيدروكسيد الأمونيوم (NH4OH).
      ملاحظة: لتجنب فقدان العينة ، يجب أن يكون حجم العينة أقل من 70٪ من حجم الحلقة.
    2. الطرد المركزي العينة عند 21,000 × جم لمدة 10 دقائق لإزالة الرواسب.
  3. التجزئة والتسلسل
    ملاحظة: قبل تجزئة العينة الحقيقية ، يوصى بشدة بإجراء تجربة تجريبية للتأكد من أن نظام LC في حالة جيدة. يمكن إجراء ذلك بكمية صغيرة من عينتك الفعلية (~ 5٪) أو بمزيج من الببتيدات غير المسمى TMT.
    1. حقن العينة وتجزئتها بالتدرج التالي: 5٪ مخزن مؤقت B لمدة 10 دقائق ، 5-15٪ مخزن مؤقت B لمدة دقيقتين ، 15-45٪ مخزن مؤقت B لمدة 148 دقيقة و 45-95٪ مخزن مؤقت B لمدة 5 دقائق. استخدم معدل تدفق يبلغ 0.4 مل / دقيقة.
    2. اضبط مجمع الكسور لجمع الكسور كل 1 دقيقة وتسلسل 160 كسرا مرة أخرى إلى 40 كسرا في 4 دورات.
      ملاحظة: يتم إجراء التسلسل من خلال الجمع بين كسور LC المبكرة والمتوسطة والمتأخرة التي تم استخلاصها من نفس الوقت الداخلي في جزء متسلسل. الكسور المتسلسلة لها تداخل ضئيل في البعد الأول من LC وبالتالي زيادة الاستخدام الفعال لنافذة الشطف في البعد الثاني LC. بالإضافة إلى ذلك ، من خلال عدة جولات من التسلسل ، يمكن توزيع الببتيدات بالتساوي عبر جميع الكسور المتسلسلة. وقد ثبت أن هذا النهج يزيد من تغطية البروتين مقارنة بتحليل الكسور الفردية35،36.
    3. جفف جميع الكسور المتسلسلة في مكثف فراغ وقم بتخزين العينات المجففة عند -80 درجة مئوية لمزيد من تحليل LC-MS / MS.

5. تحليل PH الحمضي RPLC-MS / MS

  1. تحضير نظام PH الحمضي RPLC-MS / MS
    1. قم بتعبئة عمود فارغ (معرف 75 ميكرومتر مع فتحة طرف 15 ميكرومتر) براتنج C18 1.9 ميكرومتر بطول 10-15 سم.
    2. قم بتسخين العمود عند 65 درجة مئوية باستخدام سخان محفظة الفراشة لتقليل الضغط الخلفي.
    3. اغسل العمود جيدا باستخدام 95٪ عازلة B (3٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، 0.2٪ حمض الفورميك و 67٪ ACN). بعد ذلك ، قم بموازنة العمود بالكامل في 95٪ عازلة A (3٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد و 0.2٪ حمض الفورميك).
    4. تحقق من أداء نظام LC-MS / MS عن طريق تشغيل 100 نانوغرام من ببتيدات دماغ الفئران أو ببتيدات BSA قبل تحليل العينات التجريبية.
  2. تحليل LC-MS/MS للكسور المتسلسلة
    1. أعد تكوين الببتيدات المجففة من كسور الأس الهيدروجيني الأساسية في 5٪ FA ، وأجهزة الطرد المركزي عند 21,000 × جم لمدة 5 دقائق. انقل المادة الطافية لكل عينة إلى إدراج قارورة HPLC.
    2. قم بتحميل ~ 1 ميكروغرام من الببتيدات من كل جزء على العمود. يتم تصريف الببتيدات بمعدل تدفق 0.25 ميكرولتر / دقيقة مع تدرج 60 دقيقة من 18-45٪ مخزن مؤقت B.
      ملاحظة: للحصول على أرقام تعريف عالية، قم بتشغيل كسر واحد وضبط التدرج اللوني للكسور المتبقية استنادا إلى التشغيل الأول. يجب أن يحتوي أفضل تدرج على ببتيدات موزعة بالتساوي عبر التدرج بأكمله (الشكل 4 أ).
    3. قم بتشغيل مطياف الكتلة باستخدام المعلمات التالية لتحليل العينات المسماة TMT16: عمليات مسح MS1 (نطاق مسح MS الكامل: 450-1600 م / ز ؛ دقة Orbitrap: 60,000 ؛ هدف التحكم التلقائي في الكسب: 1 × 106 ؛ الحد الأقصى لوقت الأيونات: 50 مللي ثانية) و 20 عملية مسح MS2 تعتمد على البيانات (دقة Orbitrap: 60,000; هدف AGC: 1 × 105 ؛ الحد الأقصى لوقت الأيونات: 110 مللي ثانية ؛ طاقة الاصطدام الطبيعية HCD: 32٪ ؛ نافذة العزل: 1.0 م / ز ؛ إزاحة العزل: 0.2 م / ز ؛ الاستبعاد الديناميكي: 10 ثوان).
      ملاحظة: تم تحسين المعلمات المستخدمة هنا على نوع واحد من مطياف الكتلة (انظر جدول المواد). بالنسبة لأدوات MS المختلفة ، يجب على المستخدمين ضبط معلمات الأداة لتحقيق نتائج عالية الجودة. أحد الإعدادات هو مراقبة طاقة تصادم HCD الطبيعية ، حيث قد تختلف الطاقة المثلى عبر الأدوات وكذلك بين TMT11 و TMT16.

6. معالجة البيانات

ملاحظة: تم إجراء تحليل البيانات باستخدام مجموعة برامج JUMP37،38،39 بما في ذلك محرك بحث هجين لقاعدة البيانات (قائم على النمط والعلامة) ، وبرنامج التصفية الذي يتحكم في معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) للببتيدات / البروتينات المحددة ، وبرنامج القياس الكمي لمجموعات بيانات TMT. اعتمادا على حالة المستخدم ، يمكن إجراء تحليل البيانات باستخدام برامج تجارية أخرى أو متاحة مجانا.

  1. البحث في قاعدة البيانات
    1. قم بتحويل ملفات .raw من أداة MS إلى ملفات .mzXML ، وابحث في أطياف MS2 مقابل قاعدة بيانات شرك الهدف غير الزائدة عن الحاجة40 تم إنشاؤها من تسلسلات البروتين البشري UniProt (أو قاعدة بيانات أخرى مناسبة خاصة بالأنواع) لحساب FDR للبروتينات المحددة.
      ملاحظة: قم بإنشاء قاعدة البيانات غير الزائدة عن الحاجة عن طريق الجمع بين تسلسلات البروتين من قواعد بيانات Swiss-Prot و TrEMBL. يمكن للمرء أيضا إضافة تسلسلات بروتين مخصصة غير موجودة في قواعد البيانات المرجعية هذه ، بما في ذلك البروتينات المشقوقة بالبروتياز والبروتينات ذات الأشكال المتعددة للنوكليوتيدات المفردة والملوثات الشائعة.
    2. إجراء عمليات البحث باستخدام المعلمات التالية. تحمل الكتلة للسلائف: 10 جزء في المليون ؛ تحمل الكتلة لأيونات المنتج: 15 جزء في المليون ؛ أقصى انقسامات مفقودة: 2 ؛ مواقع التعديل الأقصى: 3 ؛ التعديلات الثابتة: 304.20715 Da لعلامات TMT16 على بقايا Lys و N termmini ، 57.02146 Da للكارباميدوميثيل على بقايا Cys ؛ التعديل الديناميكي: 15.99492 Da للأكسدة على Met.
  2. تصفية نتائج البحث
    1. قم بتصفية مباريات طيف الببتيد الناتجة (PSMs) حسب طول الببتيد (>6 أحماض أمينية) ، ودقة كتلة أيون السليفة ، ودرجات المطابقة المستندة إلى JUMP (Jscore و ΔJn). ثم يتم تجميع الببتيدات حسب طول الببتيد ، والنهايات التربتية ، والتعديلات ، ومواقع الانقسام المفقودة ، وحالة الشحن.
    2. قم بتصفية البيانات بشكل أكبر باستخدام درجات المطابقة لتحقيق FDR أقل من 1٪ إما على مستوى البروتين (تحليل البروتين الكامل) أو الببتيد (تحليل الفوسفوبروتين).
      ملاحظة: إذا كانت الببتيدات / البروتينات ذات التحكم الإيجابي مفقودة في خطوات الترشيح ، فيمكن زيادة FDR إلى مستوى معقول بحيث يمكن إنقاذ تلك الببتيدات / البروتينات.
    3. بالنسبة للببتيدات التي يتقاسمها أكثر من عضو واحد من عائلة البروتين ، قم بتجميع الأعضاء المتطابقين في مجموعة واحدة.
      ملاحظة: مع قاعدة البخل ، يتم تمثيل المجموعة بالبروتين المتماثل الذي يحتوي على أكبر عدد من الببتيدات المشتركة والبروتينات الأخرى التي تقابلها الببتيدات الفريدة.
  3. القياس الكمي للبروتين
    1. قم بقياس البروتينات باستخدام برنامج مدمج لمجموعة برامج إحصائية لتلخيص شدة أيون مراسل TMT على جميع PSMs المتطابقة.
    2. استخرج شدة أيون مراسل TMT من كل PSM مقبول وتصحيح الشدة الخام وفقا للتوزيع النظيري لكل كواشف وضع العلامات (على سبيل المثال ، يولد TMT16-126 92.6٪ و 7.2٪ و 0.2٪ من أيونات 126 و 127C و 128C m / z ، على التوالي) وتصفية PSMs منخفضة الكثافة و / أو شديدة الضوضاء على أساس العتبات المحددة من قبل المستخدم. تطبيع بيانات القياس الكمي باستخدام شدة العينات ذات المتوسط (أو المتوسط) لتصحيح تحيز التحميل.
    3. لكل بروتين محدد ، احسب الشدة المتمركزة في المتوسط عبر العينات (أي الشدة النسبية) ل PSMs المتطابقة ولخص الشدة النسبية ل PSMs عن طريق أخذ متوسط العينة. قم بتحويل الإشارات النسبية إلى إشارات مطلقة عن طريق ضرب الكثافة المتوسطة الإجمالية لثلاثة أكثر PSMs متطابقة وفرة.
    4. تداخل القياس الكمي الصحيح باستخدام نهج تصحيح أيونات y1 الذي تم الإبلاغ عنهسابقا 37 والذي يفترض أن شدة أيون y1 مرتبطة بكثافة أيون المبلغ عنه. من خلال تقدير العلاقة الخطية بين y1 وشدة أيون المراسل من عمليات المسح النظيفة ، يتم اشتقاق وتصحيح مستوى التداخل من شدة أيون y1 الملوثة في عمليات المسح الصاخبة.
      ملاحظة: بالنسبة للببتيدات التريبتية المسماة TMT ، فإن بقايا K-TMT و R عبارة عن أيونين تمثيلي y1 (376.27574 Da و 175.11895 Da ، على التوالي) في طيف MS2. إذا تم اكتشاف أيون y1 واحد فقط وكان متسقا مع الببتيد المحدد ، فإن MS2 يعتبر مسحا نظيفا. إذا تم اكتشاف كل من أيونات y1 ، اعتبار MS2 مسحا صاخبا.
    5. انقل قيم كمية البروتين إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل. استخدم طرق تحليل البيانات غير الخاضعة للإشراف مثل PCA أو تحليل التجميع لاستكشاف توزيع العينات. لتحديد البروتينات المعبر عنها تفاضليا ، استخدم طرقا إحصائية مثل اختبار t وتحليل التباين (ANOVA).

7. التحقق من صحة بيانات MS

ملاحظة: قبل إجراء التجارب البيولوجية التي تستغرق وقتا طويلا ، استخدم طريقة واحدة على الأقل للتحقق من الصحة لتقييم جودة بيانات مرض التصلب العصبي المتعدد.

  1. افحص يدويا أطياف MS / MS للبروتينات ذات الأهمية للتحقق من صحة تسلسل الببتيد وشدة أيون مراسل TMT.
  2. استخدم الأساليب القائمة على الأجسام المضادة (على سبيل المثال ، النشاف الغربي أو تحليل الكيمياء المناعية) للتحقق من التغيرات في مستويات البروتين. لتأكيد وجود الببتيدات الأصلية ، استخدم الببتيدات الاصطناعية كمعايير داخلية. يجب أن تكون أطياف MS / MS للببتيدات ووقت الاحتفاظ بها أثناء LC-MS / MS متطابقة في ظل نفس الظروف.
  3. استخدم نهجا مستهدفا للتصلب العصبي المتعدد للتحقق من تغيرات البروتين.

النتائج

تم تحسين بروتوكول TMT16 المطور حديثا ، بما في ذلك تفاعل الملصقات ، وتحلية المياه ، وظروف LC-MS ، بشكل منهجي41. علاوة على ذلك ، قمنا بمقارنة طرق 11-plex و 16-plex مباشرة باستخدامها لتحليل نفس عينات AD البشرية41. بعد تحسين المعلمات الرئيسية ل TMT16 ، تنتج كل من طرق TM...

Discussion

تم تنفيذ بروتوكول محسن للتنميط البروتيني العميق المستند إلى TMT16 بنجاح في المنشورات السابقة12،13،41. باستخدام هذا البروتوكول الحالي ، يمكن قياس أكثر من 10,000 بروتين فريد من ما يصل إلى 16 عينة مختلفة بشكل روتيني في تجربة واحدة ...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01GM114260 و R01AG047928 و R01AG053987 و RF1AG064909 و U54NS110435) و ALSAC (الجمعيات الخيرية الأمريكية اللبنانية السورية المنتسبة). تم إجراء تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد في مركز البروتينات والتمثيل الغذائي التابع لمستشفى سانت جود لأبحاث الأطفال ، والذي يدعمه جزئيا منحة دعم مركز المعاهد الوطنية للصحة للسرطان (P30CA021765). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Criterion TGX Precast Midi Protein GelBiorad5671035
10X TGS (Tris/Glycine/SDS) BufferBioRad161-0772
4–20% Criterion TGX Precast Midi Protein GelBiorad5671095
50% HydroxylamineThermo Scientific90115
6 X SDS Sample Loading BufferBoston Bioproducts IncBP-111R
Ammonium Formate (NH4COOH)Sigma70221-25G-F
Ammonium Hydroxide, 28%Sigma338818-100ml
Bullet BlenderNext AdvanceBB24-AU
Butterfly Portfolio HeaterPhoenix S&TPST-BPH-20
C18 ZiptipsHarvard Apparatus74-4607Used for desalting
Dithiothreitol (DTT)SigmaD5545
DMSOSigma41648
Formic AcidSigma94318
Fraction CollectorGilsonFC203B
Gel Code Blue Stain ReagentThermo24592
Glass BeadsNext AdvanceGB05
HEPESSigmaH3375
HPLC Grade AcetonitrileBurdick & JacksonAH015-4
HPLC Grade WaterBurdick & JacksonAH365-4
Iodoacetamide (IAA)SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
Mass SpectrometerThermo ScientificQ Exactive HF
MassPrep BSA Digestion StandardWaters186002329
MethanolBurdick & JacksonAH230-4
Nanoflow UPLCThermo ScientificUltimate 3000
Pierce BCA Protein Assay kitThermo Scientific23225
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9umDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
Self-Pack ColumnsNew ObjectivePF360-75-15-N-5
SepPak 1cc 50mgWatersWAT054960Used for desalting
Sodium DeoxycholateSigma30970
SpeedvacThermo ScientificSPD11V
TMTpro 16plex Label Reagent SetThermo ScientificA44520
Trifluoroacetic Acid (TFA)Applied Biosystems400003
TrypsinPromegaV511C
Ultra-micro Spin Column,C18Harvard apparatus74-7206Used for desalting
UreaSigmaU5378
Xbridge Column C18 columnWaters186003943Used for basic pH LC

References

  1. Levy, M. J., Washburn, M. P., Florens, L. Probing the sensitivity of the orbitrap lumos mass spectrometer using a standard reference protein in a complex background. Journal of Proteome Research. 17 (10), 3586-3592 (2018).
  2. Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
  3. Mertins, P., et al. Proteogenomics connects somatic mutations to signalling in breast cancer. Nature. 534 (7605), 55-62 (2016).
  4. Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (3), 1646-1654 (2015).
  5. Moulder, R., Bhosale, S. D., Goodlett, D. R., Lahesmaa, R. Analysis of the plasma proteome using iTRAQ and TMT-based Isobaric labeling. Mass Spectrometry Reviews. 37 (5), 583-606 (2018).
  6. Wang, H., et al. Deep multiomics profiling of brain tumors identifies signaling networks downstream of cancer driver genes. Nature Communications. 10 (1), 3718 (2019).
  7. Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 5293-5309 (2014).
  8. Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
  9. Dayon, L., et al. Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plex isobaric tags. Analytical Chemistry. 80 (8), 2921-2931 (2008).
  10. Stepanova, E., Gygi, S. P., Paulo, J. A. Filter-based protein digestion (FPD): A detergent-free and scaffold-based strategy for TMT workflows. Journal of Proteome Research. 17 (3), 1227-1234 (2018).
  11. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical Chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  12. Thompson, A., et al. TMTpro: Design, synthesis, and initial evaluation of a proline-based isobaric 16-plex tandem mass tag reagent set. Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).
  13. Li, J., et al. TMTpro reagents: a set of isobaric labeling mass tags enables simultaneous proteome-wide measurements across 16 samples. Nature Methods. 17 (4), 399-404 (2020).
  14. Arul, A. B., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).
  15. Labib, M., Kelley, S. O. Single-cell analysis targeting the proteome. Nature Reviews Chemistry. 4 (3), 143-158 (2020).
  16. Ren, R. J., Dammer, E. B., Wang, G., Seyfried, N. T., Levey, A. I. Proteomics of protein post-translational modifications implicated in neurodegeneration. Translational Neurodegeneration. 3 (1), 23 (2014).
  17. Pagel, O., Loroch, S., Sickmann, A., Zahedi, R. P. Current strategies and findings in clinically relevant post-translational modification-specific proteomics. Expert Review of Proteomics. 12 (3), 235-253 (2015).
  18. Mertins, P., et al. Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 13 (7), 1632-1661 (2018).
  19. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  20. Bai, B., et al. Deep multilayer brain proteomics identifies molecular networks in Alzheimer's disease progression. Neuron. 105 (6), 975-991 (2020).
  21. Kelstrup, C. D., et al. Rapid and deep proteomes by faster sequencing on a benchtop quadrupole ultra-high-field orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6187-6195 (2014).
  22. Meier, F., et al. Online parallel accumulation - serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (12), (2018).
  23. Schweppe, D. K., et al. Full-featured, real-time database searching platform enables fast and accurate multiplexed quantitative proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2026-2034 (2020).
  24. Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. Journal of Proteome Research. 14 (2), 829-838 (2015).
  25. Dey, K. K., et al. Deep undepleted human serum proteome profiling toward biomarker discovery for Alzheimer's disease. Clinical Proteomics. 16, 16 (2019).
  26. Bai, B., et al. Deep profiling of proteome and phosphoproteome by isobaric labeling, extensive liquid chromatography, and mass spectrometry. Methods in Enzymology. 585, 377-395 (2017).
  27. High, A. A., et al. Deep proteome profiling by isobaric labeling, extensive liquid chromatography, mass spectrometry, and software-assisted quantification. Journal of Visualized Experiments. (129), e56474 (2017).
  28. Chick, J. M., et al. Defining the consequences of genetic variation on a proteome-wide scale. Nature. 534 (7608), 500-505 (2016).
  29. Wang, Z., et al. Quantitative phosphoproteomic analysis of the molecular substrates of sleep need. Nature. 558 (7710), 435-439 (2018).
  30. Tan, H., et al. Integrative proteomics and phosphoproteomics profiling reveals dynamic signaling networks and bioenergetics pathways underlying T cell activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
  31. Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764 (2011).
  32. Kleiman, L. B., Maiwald, T., Conzelmann, H., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Rapid phospho-turnover by receptor tyrosine kinases impacts downstream signaling and drug binding. Molecular Cell. 43 (5), 723-737 (2011).
  33. Mertins, P., et al. Ischemia in tumors induces early and sustained phosphorylation changes in stress kinase pathways but does not affect global protein levels. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (7), 1690 (2014).
  34. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  35. Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10A cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
  36. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  37. Niu, M., et al. Extensive peptide fractionation and y(1) ion-based interference detection method for enabling accurate quantification by isobaric labeling and mass spectrometry. Analytical Chemistry. 89 (1), 2956-2963 (2017).
  38. Wang, X., et al. A tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (12), 3663 (2014).
  39. Li, Y., et al. JUMPg: An integrative proteogenomics pipeline identifying unannotated proteins in human brain and cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (7), 2309-2320 (2016).
  40. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  41. Wang, Z., et al. 27-plex tandem mass tag mass spectrometry for profiling brain proteome in Alzheimer's disease. Analytical Chemistry. 92 (10), 7162-7170 (2020).
  42. Ow, S. Y., et al. iTRAQ underestimation in simple and complex mixtures: "The good, the bad and the ugly". Journal of Proteome Research. 8 (11), 5347-5355 (2009).
  43. Karp, N. A., et al. Addressing accuracy and precision issues in iTRAQ quantitation. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1885-1897 (2010).
  44. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
  45. Gygi, J. P., et al. A triple knockout isobaric-labeling quality control platform with an integrated online database search. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1344-1349 (2020).
  46. Savitski, M. M., et al. Measuring and managing ratio compression for accurate iTRAQ/TMT quantification. Journal of Proteome Research. 12 (8), 3586-3598 (2013).
  47. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376 (2002).
  48. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513 (2014).
  49. Brenes, A., Hukelmann, J., Bensaddek, D., Lamond, A. I. Multibatch TMT reveals false positives, batch effects and missing values. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 1967-1980 (2019).
  50. Yu, J., Peng, J., Chi, H. Systems immunology: Integrating multi-omics data to infer regulatory networks and hidden drivers of immunity. Current Opinion in Systems Biology. 15, 19-29 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

TMT 16 plex TMT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved