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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Vorgestellt wird ein optimiertes Hochdurchsatzprotokoll, das mit 16-Plex-Tandem-Massentag-Reagenzien entwickelt wurde und eine quantitative Proteomprofilierung biologischer Proben ermöglicht. Die umfangreiche basische pH-Fraktionierung und die hochauflösende LC-MS/MS mildern die Kompression des Verhältnisses und sorgen für eine tiefe Proteomabdeckung.

Zusammenfassung

Die isobare Tandem-Mass-Tag-Markierung (TMT) wird in der Proteomik aufgrund ihrer hohen Multiplexing-Kapazität und ihrer tiefen Proteomabdeckung häufig eingesetzt. Vor kurzem wurde eine erweiterte 16-Plex-TMT-Methode eingeführt, die den Durchsatz von Proteomstudien weiter erhöht. In diesem Manuskript stellen wir ein optimiertes Protokoll für die 16-Plex-TMT-basierte Tiefenproteom-Profilierung vor, einschließlich Proteinprobenvorbereitung, enzymatischem Verdau, TMT-Markierungsreaktion, zweidimensionaler Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (LC/LC)-Fraktionierung, Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) und computergestützter Datenverarbeitung. Die entscheidenden Schritte der Qualitätskontrolle und Verbesserungen im Prozess, die für die 16-Plex-TMT-Analyse spezifisch sind, werden hervorgehoben. Dieses Multiplexverfahren bietet ein leistungsstarkes Werkzeug für die Profilierung einer Vielzahl komplexer Proben wie Zellen, Gewebe und klinischer Proben. Mehr als 10.000 Proteine und posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung, Methylierung, Acetylierung und Ubiquitinierung in hochkomplexen biologischen Proben aus bis zu 16 verschiedenen Proben können in einem einzigen Experiment quantifiziert werden, was ein wirksames Werkzeug für die Grundlagen- und klinische Forschung darstellt.

Einleitung

Schnelle Entwicklungen in der Massenspektrometrie haben es ermöglicht, eine hohe Empfindlichkeit und eine tiefe Proteomabdeckung in Proteomik-Anwendungen zu erreichen 1,2. Trotz dieser Entwicklungen bleibt das Stichprobenmultiplexing der Engpass für Forschende, die sich mit der Analyse einer großen Stichprobenkohorte befassen.

Multiplex-isobare Markierungstechniken werden in großem Umfang für die proteomweite relative Quantifizierung großer Probenchargen eingesetzt 3,4,5,6. Die auf Tandem-Massen-Tags (TMT) basierende Quantifizierung ist aufgrund ihrer hohen Multiplexing-Fähigkeit eine beliebte Wahl 7,8. TMT-Reagenzien wurden ursprünglich als 6-Plex-Kit auf den Markt gebracht, mit dem bis zu 6 Proben gleichzeitig quantifiziert werden können9. Diese Technologie wurde weiter ausgebaut, um 10-11 Proben zu quantifizieren10,11. Kürzlich entwickelte 16-Plex-TMTpro-Reagenzien (im Folgenden als TMT16 bezeichnet) haben die Multiplexing-Kapazität weiter auf 16 Proben in einem einzigen Experiment erhöht12,13. Die TMT16-Reagenzien verwenden eine Prolin-basierte Reportergruppe, während 11-Plex-TMT eine Dimethylpiperidin-abgeleitete Reportergruppe verwendet. Sowohl TMT11 als auch TMT16 verwenden die gleiche aminreaktive Gruppe, aber die Massenbilanzgruppe von TMT16 ist größer als die von TMT11, so dass die Kombination von 8 stabilen C13- und N15-Isotopen in den Reporterionen 16 Reporter erreicht (Abbildung 1).

Die zunehmende Multiplexing-Fähigkeit bietet eine Plattform für die Planung von Experimenten mit ausreichenden Replikaten, um statistische Herausforderungen zu bewältigen14. Darüber hinaus tragen die zusätzlichen Kanäle in der 16-Plex-TMT dazu bei, die Gesamtmenge an Ausgangsmaterial pro Kanal zu reduzieren, was bei der Entwicklung der neu entstehenden Einzelzellproteomik hilfreich sein kann15. Die hohe Multiplexkapazität wird auch bei der Quantifizierung posttranslationaler Modifikationen nützlich sein, die typischerweise große Mengen an Ausgangsmaterial erfordert16,17.

Proteomische Arbeitsabläufe mit TMT-Technologie wurden rationalisiert 18,19,20 und haben sich in den letzten zehn Jahren in Bezug auf Probenvorbereitung, Flüssigkeitschromatographie-Trennung, massenspektrometrische Datenerfassung und computergestützte Analyse erheblich weiterentwickelt 21,22,23,24,25,26. Unser vorheriger Artikel bietet einen detaillierten Überblick über die 10-Plex-TMT-Plattform27. Das hier beschriebene Protokoll stellt eine detaillierte, optimierte Methode für TMT16 vor, einschließlich Proteinextraktion und -verdau, TMT16-Markierung, Probenpooling und -entsalzung, basischer pH und saurer pH-Umkehrphasen-LC (RP), hochauflösender MS und Datenverarbeitung (Abbildung 2). Das Protokoll hebt auch die wichtigsten Schritte der Qualitätskontrolle hervor, die für den erfolgreichen Abschluss eines quantitativen Proteomik-Experiments erforderlich sind. Dieses Protokoll kann routinemäßig verwendet werden, um mehr als 10.000 Proteine mit hoher Reproduzierbarkeit zu identifizieren und zu quantifizieren, um biologische Signalwege, zelluläre Prozesse und das Fortschreiten der Krankheit zu untersuchen 20,28,29,30.

Protokoll

Menschliches Gewebe für die Studie wurde mit Genehmigungen des Gehirn- und Körperspendeprogramms des Banner Sun Health Research Institute gewonnen.

1. Proteinextraktion aus Gewebe und Qualitätskontrolle

HINWEIS: Um die Auswirkungen der Probenentnahme auf das Proteom zu reduzieren, ist es entscheidend, die Proben möglichst in kürzester Zeit bei niedrigen Temperaturen zu entnehmen31. Dies ist besonders wichtig bei der Analyse posttranslationaler Modifikationen, da sie typischerweise labil sind, z. B. haben einige Phosphorylierungsereignisse nur wenige Sekunden Halbwertszeit32,33.

  1. Verbrauchsteuern und Wiegen von Gewebeproben
    1. Tarieren Sie ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Analysenwaage und kühlen Sie das Röhrchen über Trockeneis vor.
    2. Schneiden Sie ein gefrorenes Gewebe (z.B. menschliches Hirngewebe, ~10 mg) aus einer definierten Region in kleine Stücke und geben Sie die Gewebestücke sofort in das vorgekühlte Röhrchen.
      HINWEIS: Um die Heterogenität der Proben zu reduzieren, ist es wichtig, für alle 16 Proben homogene Größen und anatomische Regionen zu verwenden. Die Menge an Protein, die aus dem Gewebe gewonnen wird, beträgt typischerweise 5-10% des Gewebegewichts.
    3. Wiegen Sie das Röhrchen zusammen mit dem Taschentuch und legen Sie das Röhrchen sofort auf Trockeneis. Verarbeiten Sie die restlichen 15 Proben mit dem gleichen Verfahren. Bewahren Sie die Proben unmittelbar nach der Dissektion in Trockeneis auf und lagern Sie sie bei ˗80 °C.
  2. Lyse von Gewebeproben
    1. Bereiten Sie am Tag des Experiments frischen Lysepuffer (50 mM HEPES, pH 8,5, 8 M Harnstoff und 0,5 % Natriumdesoxycholat) vor. Phosphatase-Inhibitoren sollten in den Lysepuffer gegeben werden, um den Phosphorylierungszustand von Proteinen zu erhalten.
      HINWEIS: Setzen Sie den Lysepuffer vor der Verwendung bei Raumtemperatur ein, da 8 M Harnstoff auf Eis ausfällt, was zu einer unvollständigen Denaturierung des Proteins während der Probenlyse führen und die Effizienz der Proteinverdauung verringern kann.
    2. Geben Sie den Lysepuffer (fügen Sie 100 μl Lysepuffer pro 10 mg Gewebe hinzu, um eine endgültige Proteinkonzentration von 5 bis 10 μg/μl zu erreichen) und Glasperlen (~20 % des Lysatvolumens, 0,5 mm Durchmesser) zu jeder Probe.
    3. Das Gewebe wird in einem Mixer bei 4 °C mit einer Geschwindigkeitsstufe von 8 für 30 s lysiert, 5 s ruhen gelassen und der Vorgang wiederholt, bis die Proben homogenisiert sind (~ 5 Zyklen).
  3. Bereiten Sie Aliquots der Lysate vor.
    1. Für jede Probe sind mindestens zwei Aliquots zu erstellen. Ein kleines Aliquot (~10 μL) wird für die Analyse der Proteinkonzentration und die Bewertung der Proteinqualität verwendet (z. B. Western-Blotting-Validierung von Positivkontrollproteinen). Ein größeres Aliquot (~50 μL) wird für die Proteomanalyse verwendet.
    2. Die Aliquote sofort auf Trockeneis einfrieren und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C lagern.
  4. Messung der Proteinkonzentration
    HINWEIS: Die Proteinkonzentration kann mit dem BCA-Assay oder der kurzen SDS-Gelfärbemethode34 gemessen werden (Abbildung 3A). Da die nicht-proteinreduzierenden Komponenten im Gewebelysat die Messung im BCA-Assay beeinflussen können, können Anwender die Proteinkonzentration mit der kurzen SDS-Gelfärbemethode validieren. Die kurze SDS-Gelfärbemethode wird hier vorgestellt.
    1. Verdünnen Sie 16 aliquotierte Proben um das 10-fache und bereiten Sie den BSA-Standard vor (z. B. BSA-Titrationen von 0,15, 0,5, 1,5 und 3 μg).
    2. Führen Sie die Proben und den BSA-Standard auf einem 10%igen SDS-PAGE-Gel (26 Well) mit einem Stapelgel durch, bis alle Proteine ca. 3 mm in das Gel wandern.
    3. Färben Sie das Gel 1 h lang mit Coomassie blue und entfärben Sie das Gel, bis der Hintergrund im leeren Bereich klar ist.
    4. Scannen Sie das Gel, um die Intensitäten von Coomassie-gefärbten Proteinbanden mit ImageJ zu messen, und erstellen Sie eine BSA-Standardkurve entsprechend den Messungen.
    5. Berechnen Sie die absolute Proteinkonzentration anhand der Standardkurve.
      HINWEIS: Die endgültige Proteinkonzentration für jede Probe in diesem Experiment betrug ~5-10 μg/μl. Für die TMT16-basierte Proteomik-Analyse sind 50 μg Protein pro Probe (insgesamt 0,8 mg Protein für die Gesamtproteomanalyse) ausreichend.
  5. Qualitätskontrolle von Proben
    HINWEIS: Dieser Schritt der Qualitätskontrolle ist entscheidend, um Proben von geringer Qualität zu identifizieren, bevor die TMT-Analyse durchgeführt wird. Bei Proben mit bekannter Proteinveränderung wird empfohlen, die Veränderung durch Western Blot zu validieren. Die Standard-SDS-PAGE-Analyse wird ebenfalls empfohlen, um Proteinmuster zu untersuchen und Proben mit hohem Abbaugrad auszuschließen (Abbildung 3B).
    1. Entnehmen Sie ~10 μg jeder Probe aus dem kleinen Aliquot und lassen Sie die Proben auf einem Gradienten-SDS-PAGE-Gel laufen, bis der Bromphenolblau-Farbstoff den Boden des Gels erreicht.
    2. Färben Sie das Gel mit Coomassie blue und entfärben Sie das Gel. Überprüfen Sie die Proteinqualität, um stark abgebaute Proteinproben zu entfernen.
      HINWEIS: Degradierte Proben können als Proben identifiziert werden, die sehr wenige Proteinbanden im Bereich mit hohem Molekulargewicht und verstärkte Banden im Bereich mit niedrigem Molekulargewicht aufweisen (Abbildung 3B).

2. Proteinaufschluss in Lösung, Peptidreduktion und Alkylierung, Aufschlusseffizienztest und Peptidentsalzung

  1. Proteinverdauung durch Lys-C und Trypsin
    1. Nehmen Sie ~50 μg Protein aus dem großen Aliquot jeder Probe und fügen Sie Lysepuffer zu 50 μL hinzu.
    2. Fügen Sie 100 % Acetonitril (ACN) hinzu, um eine Endkonzentration von 10 % zu erreichen.
    3. Führen Sie den Lys-C-Aufschluss durch, indem Sie Lys-C in einem Protein:Lys-C-Verhältnis von 100:1 (w/w) hinzufügen und 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubieren.
    4. Die Proben werden auf eine Endkonzentration von 2 M Harnstoff mit 50 mM HEPES (pH 8,5) verdünnt.
    5. Trypsin in jeder Probe in einem Protein:Trypsin-Verhältnis von 50:1 (w/w) geben und den Aufschluss bei Raumtemperatur für 3 h oder über Nacht durchführen.
  2. Peptidreduktion und Alkylierung
    1. Frisch zubereitete Dithiothreitol-Lösung (1 M DTT) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, um die Disulfidbindungen zu reduzieren.
    2. Frisch zubereitete Jodacetamid (1 M IAA)-Lösung bis zu einer abschließenden Konzentration von 10 mM für 30 Minuten im Dunkeln zu Alkylat-Cystein-Rückständen hinzufügen.
    3. Die nicht umgesetzte IAA wird durch Zugabe von 1 Mio. DTT zu einer endgültigen Konzentration von 30 mM abgesetzt und weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
  3. Untersuchen Sie die Verdauungseffizienz
    1. Entnehmen Sie ~1 μg von jeder Probe und entsalzen Sie sie mit C18-harzbeschichteten Pipettenspitzen gemäß dem Protokoll des Herstellers.
    2. Analysieren Sie jede Probe durch einen kurzen Gradienten-LC-MS/MS-Lauf (weitere Details finden Sie in Schritt 5).
    3. Führen Sie eine Datenbanksuche nach MS-Rohdaten durch (weitere Details finden Sie in Schritt 6). Berechnen Sie den Prozentsatz der identifizierten Peptide mit mindestens einer Trypsin-Spaltstelle. Der Prozentsatz liegt in der Regel unter 15 %.
    4. Wenn der Prozentsatz größer als 15 % ist, fügen Sie den Proben zusätzliches Trypsin hinzu, um den Aufschluss zu wiederholen.
    5. Nach dem Aufschluss säuern Sie die Proben durch Zugabe von TFA auf 0,5 % (v/v) an. Überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Streifen, um sicherzustellen, dass der pH-Wert unter 3 liegt.
  4. Peptid-Entsalzung
    1. Zentrifugieren Sie die angesäuerten Peptide bei 21.000 x g für 10 min. Übertragen Sie die Überstände in ein neues Röhrchen.
    2. C18-Entsalzungssäulen (~25 μl Harz) werden zweimal mit 250 μl 100 % Methanol gewaschen, indem sie 30 s lang bei 500 x g zentrifugieren.
      HINWEIS: Um den Verlust von Peptiden während des Entsalzungsprozesses zu reduzieren, wählen Sie Entsalzungssäulen mit einer Bindungskapazität, die der Eingangsmenge entspricht.
    3. Waschen Sie die Säulen zweimal mit 250 μl Elutionspuffer (60 % ACN, 0,1 % TFA), indem Sie sie 30 s lang bei 500 x g zentrifugieren.
    4. Äquilibrieren Sie die Säulen zweimal mit 250 μl Äquilibrierung und Waschpuffer (0,1 % TFA), indem Sie 30 s lang bei 500 x g zentrifugieren.
    5. Laden Sie die Proben auf die voräquilibrierten Säulen. Lassen Sie die Proben an die Säulen binden, indem Sie sie 6 Minuten lang bei 100 x g drehen. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Lösung die Spalte durchlaufen hat.
    6. Waschen Sie die Säulen dreimal mit 250 μl Äquilibrierung und waschen Sie den Puffer durch Zentrifugieren bei 500 x g für 30 s.
    7. Eluieren Sie die Peptide, indem Sie 125 μl Elutionspuffer zu jeder Säule hinzufügen und 3 Minuten lang bei 100 x g drehen. Vergewissern Sie sich, dass die Spalte keine übrig gebliebene Lösung enthält.
    8. Trocknen Sie die eluierten Peptide in einem Vakuumkonzentrator und lagern Sie die Peptide bei -80 °C für die zukünftige TMT-Markierung.

3. TMT16-Markierung von Peptiden, Markierungseffizienztest, Probenpooling und Entsalzung markierter Peptide

  1. TMT16-Markierung von Peptiden
    1. Resuspendieren Sie jede entsalzte Peptidprobe in 50 μl 50 mM HEPES (pH 8,5) durch mehrmaliges Vortexen oder Ultraschallauflösen, gefolgt von der Verwendung eines pH-Streifens zur Überprüfung des pH-Werts.
      HINWEIS: Die Probe kann sauer sein, wenn sie vor der Markierung nicht vollständig getrocknet wird, was sich negativ auf die Markierungseffizienz auswirkt. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert zwischen 7 und 8 liegt.
    2. Entnehmen Sie ~1 μg unmarkierte Peptide aus jeder Probe als Negativkontrollen für den TMT-Markierungseffizienztest.
    3. TMT16-Reagenzien werden in wasserfreiem ACN gelöst. Führen Sie die Markierungsreaktion durch, indem Sie die Reagenzien bei einem TMT:Protein-Verhältnis von 1,5:1 (w/w) hinzufügen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
      HINWEIS: Das für TMT16 verwendete TMT:Protein-Verhältnis ist 50 % höher als das für TMT11 verwendete Verhältnis. Diese geringe Diskrepanz kann darauf zurückzuführen sein, dass die Molekülmasse von TMT16 größer (1,2-fach) ist als die von TMT11-Reagenzien. Die Proteinmenge wird aus den Proben geschätzt, ohne den Verlust bei der Entsalzung zu berücksichtigen.
  2. Prüfung der Effizienz der Etikettierung
    1. Entnehmen Sie ~1 μg markierte Peptide aus jeder Probe für den Test der Markierungseffizienz. Die restlichen Proben werden bei -80 °C behandelt, ohne die Reaktion abzuschrecken.
    2. Entsalzen Sie jeweils ~1 μg TMT16-markierte und unmarkierte Proben mit C18-harzbeschichteten Pipettenspitzen gemäß dem Protokoll des Herstellers.
    3. Analysieren Sie die Proben mittels LC-MS/MS (siehe Abschnitt 5, mit der Ausnahme, dass der Gradient 10 min beträgt).
    4. Schätzen Sie die Markierungseffizienz ab, indem Sie die MS1-Intensitätsreduktion von unmarkierten Peptiden zwischen unmarkierten und markierten Proben analysieren. Wählen Sie 6 bis 10 verschiedene Peptide aus, um die Markierungseffizienz zu überprüfen und sicherzustellen, dass alle Peptide markiert sind.  Für eine vollständige Markierung werden unmarkierte Peptide nicht beobachtet.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die vollständige Markierung aller Proben für eine spätere genaue Proteinidentifizierung und -quantifizierung sicherzustellen.
    5. Wenn die Markierung nicht abgeschlossen ist, fügen Sie zusätzliche TMT-Reagenzien hinzu, um die verbleibenden Peptide zu markieren, und überprüfen Sie die Markierungseffizienz erneut, bevor Sie sie abschrecken. Nachdem die Probe vollständig markiert ist, wird die Reaktion bei Raumtemperatur durch Zugabe von Hydroxylamin bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,5 % abgeschreckt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  3. Probenpooling und Entsalzung
    1. Mischen Sie die Hälfte jeder TMT-markierten Probe, um eine Mischung herzustellen.
    2. 1 μg aus der Mischung entnehmen und mit C18-harzbeschichteten Pipettenspitzen entsalzen, dann mit LC-MS/MS unter Verwendung eines kurzen Gradienten (~30 min) analysieren.
    3. Berechnen Sie die relative Konzentration anhand der durchschnittlichen Intensität jedes TMT16-Reporterions und vergleichen Sie die Diskrepanzen zwischen den 16 Kanälen. Um eine gleichmäßige Durchmischung der einzelnen Kanäle zu erreichen, geben Sie den Rest der TMT-markierten Proben entsprechend der berechneten durchschnittlichen Intensität in die Mischung. Wiederholen Sie die Einstellung, bis alle Proben gleichmäßig gemischt sind. Repräsentative Daten, die den Prozess des Stichprobenpoolings zeigen, sind in Tabelle 1 dargestellt.
      HINWEIS: Da Pipettierfehler die Genauigkeit der Konzentrationen und die Proteinquantifizierung beeinträchtigen können, ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Pooling-Menge korrekt ist. Die Diskrepanzen in der Intensität zwischen 16 Proben sollten weniger als 5 % betragen.
  4. Entsalzung markierter Peptide
    HINWEIS: Da die Hintergrundderivate in der TMT16-Markierungsreaktion (z. B. TMTpro-NHOH aus der Hydroxylamin-Quenching-Reaktion und TMTpro-OH aus der TMT-Hydroxylierung) hydrophob sind, wird für TMT16-markierte Proben eine umfangreiche Waschbedingung verwendet, um die Derivate effektiv zu entfernen. Es wird die Zugabe von 5 % ACN im regulären Waschpuffer (0,1 % TFA) und das 10-fache Bettvolumen des Waschpuffers verwendet.
    1. Säuern Sie die gepoolte Probe an, indem Sie 10 % TFA auf pH < 3 hinzufügen.
    2. Die gepoolte Probe wird bei 21.000 x g 10 min lang zentrifugiert und der Überstand in ein neues Röhrchen gegeben.
    3. Trocknen Sie die Probe mit einem Vakuumkonzentrator, um ACN zu entfernen.
    4. Eine Festphasen-Extraktionskartusche mit 50 mg Sorptionssäule wird vorkonditioniert, indem die Säule mit 2 mL 100 % Methanol, gefolgt von 2 mL Elutionspuffer (60 % ACN plus 0,1 % TFA) und zuletzt 2 mL Waschpuffer (0,1 % TFA) gewaschen wird.
    5. Laden Sie die Probe auf die Säule. Stellen Sie die Flussrate auf ~100 μL/min ein, um das volle Ausmaß der Peptidbindung zu gewährleisten. Speichern Sie den Durchfluss.
    6. Waschen Sie die Säule dreimal mit 1 ml Waschpuffer.
    7. Eluieren Sie Peptide mit 1 mL Elutionspuffer.
    8. Trocknen Sie die eluierten Peptide in einem Vakuumkonzentrator und lagern Sie die Peptide bei -80 °C für die weitere Fraktionierung.

4. Offline-Vorfraktionierung des basischen pH-LC

  1. Vorbereitung des Fraktionierungssystems
    1. Bereiten Sie Puffer A (10 mM Ammoniumformiat, pH 8,0) und Puffer B (10 mM Ammoniumformiat, 90 % ACN, pH 8,0) für ein Hochleistungs-LC-System mit Mikroliterfluss vor.
    2. Aufbau einer HPLC-Säule mit verbrückten Ethylen-Hybridpartikeln (3,5 μm Partikelgröße, 4,6 mm × 25 cm) in einem Mikroliter-Flow-Hochleistungs-LC-System zur Fraktionierung.
    3. Installieren Sie eine 100-μl-Probenschleife und waschen Sie die Schleife nacheinander mit 300 μl Methanol, Wasser und Puffer A.
    4. Zum Waschen der Säule werden 100 μl Isopropanol : Methanol : Acetonitril : Wasser verwendet. Anschließend wird die Säule für 0,5 h in 95 % des Puffers A weiter äquilibriert.
  2. Probenvorbereitung
    1. Die gepoolte und entsalzte TMT16-Probe wird in 70 μl Puffer A aufgelöst. Vergewissern Sie sich, dass der pH-Wert der Probe ~ 8,0 beträgt. Wenn immer noch sauer, stellen Sie den pH-Wert mit 28 % Ammoniumhydroxid (NH4OH) auf 8,0 ein.
      HINWEIS: Um Probenverluste zu vermeiden, sollte das Probenvolumen weniger als 70 % des Schleifenvolumens betragen.
    2. Zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 21.000 x g , um Ausfällungen zu entfernen.
  3. Fraktionierung und Verkettung
    HINWEIS: Vor der eigentlichen Probenfraktionierung wird dringend ein Pilotversuch empfohlen, um sicherzustellen, dass das LC-System in gutem Zustand ist. Dies kann mit einer kleinen Menge Ihrer tatsächlichen Probe (~5%) oder mit einer nicht TMT-markierten Mischung von Peptiden durchgeführt werden.
    1. Injizieren Sie die Probe und fraktionieren Sie sie mit folgendem Gradienten: 5 % Puffer B für 10 Minuten, 5-15 % Puffer B für 2 Minuten, 15-45 % Puffer B für 148 Minuten und 45-95 % Puffer B für 5 Minuten. Verwenden Sie eine Flussrate von 0,4 mL/min.
    2. Stellen Sie den Fraktionssammler so ein, dass alle 1 Minute Fraktionen gesammelt werden, und verketten Sie 160 Fraktionen in 4 Zyklen wieder auf 40 Fraktionen.
      HINWEIS: Die Verkettung erfolgt durch Kombinieren von frühen, mittleren und späten LC-Fraktionen, die von denselben Zeitinterna eluiert wurden, zu einer verketteten Fraktion. Die verketteten Fraktionen haben eine geringe Überlappung in der ersten Dimension der LC, wodurch die effiziente Nutzung des Elutionsfensters in der zweiten Dimension der LC erhöht wird. Darüber hinaus können die Peptide durch mehrere Verkettungsrunden gleichmäßig über alle verketteten Fraktionen verteilt werden. Es wurde gezeigt, dass dieser Ansatz die Proteomabdeckung im Vergleich zur Analyse einzelner Fraktionen erhöht35,36.
    3. Trocknen Sie alle verketteten Fraktionen in einem Vakuumkonzentrator und lagern Sie die getrockneten Proben bei -80 °C für die weitere LC-MS/MS-Analyse.

5. Saure PH RPLC-MS/MS-Analyse

  1. Vorbereitung des sauren pH RPLC-MS/MS-Systems
    1. Verpacken Sie eine leere Säule (75 μm ID mit einer Spitzenblende von 15 μm) mit 1,9 μm C18-Harz auf eine Länge von 10-15 cm.
    2. Heizen Sie die Säule mit einer Schmetterlings-Portfolioheizung auf 65 °C, um den Gegendruck zu reduzieren.
    3. Waschen Sie die Säule gründlich mit 95 % Puffer B (3 % Dimethylsulfoxid, 0,2 % Ameisensäure und 67 % ACN). Anschließend wird die Säule in 95 % Puffer A (3 % Dimethylsulfoxid und 0,2 % Ameisensäure) vollständig äquilibriert.
    4. Überprüfen Sie die Leistung des LC-MS/MS-Systems, indem Sie 100 ng Rattenhirnpeptide oder BSA-Peptide laufen lassen, bevor Sie die experimentellen Proben analysieren.
  2. LC-MS/MS-Analyse von verketteten Fraktionen
    1. Rekonstituieren Sie die getrockneten Peptide aus den basischen pH-Fraktionen in 5 % FA und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 21.000 × g. Übertragen Sie den Überstand jeder Probe auf einen HPLC-Fläschcheneinsatz.
    2. Laden Sie ~1 μg Peptide jeder Fraktion auf die Säule. Die Peptide werden bei einer Flussrate von 0,25 μl/min mit einem 60-minütigen Gradienten von 18–45% Puffer B eluiert.
      HINWEIS: Um hohe Identifikationszahlen zu erhalten, führen Sie einen Bruch aus und passen Sie den Gradienten für die verbleibenden Brüche basierend auf dem ersten Lauf an. Der beste Gradient sollte gleichmäßig verteilte Peptide über den gesamten Gradienten aufweisen (Abbildung 4A).
    3. Betreiben Sie das Massenspektrometer mit folgenden Parametern für die Analyse von TMT16-markierten Proben: MS1-Scans (voller MS-Scanbereich: 450-1600 m/z; Orbitrap-Auflösung: 60.000; Ziel für automatische Verstärkungsregelung: 1 x 106; maximale Ionenzeit: 50 ms) und 20 datenabhängige MS2-Scans (Orbitrap-Auflösung: 60.000; AGC-Ziel: 1 x 105; Maximale ION-Zeit: 110 ms; Normalisierte Kollisionsenergie von HCD: 32 %; Isolationsfenster: 1,0 m/z; Isolations-Offset: 0,2 m/z; dynamischer Ausschluss: 10 s).
      HINWEIS: Die hier verwendeten Parameter sind für einen Massenspektrometertyp optimiert (siehe Materialtabelle). Bei verschiedenen MS-Instrumenten sollten die Geräteparameter fein abgestimmt werden, um qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erzielen. Eine Einstellung ist die Überwachung der normalisierten HCD-Kollisionsenergie, da die optimale Energie sowohl zwischen den Instrumenten als auch zwischen TMT11 und TMT16 variieren kann.

6. Datenverarbeitung

HINWEIS: Die Datenanalyse wurde unter Verwendung einer JUMP-Software-Suite 37,38,39 durchgeführt, die eine hybride Datenbanksuchmaschine (muster- und tagbasiert), eine Filtersoftware, die die False-Discovery-Rate (FDR) identifizierter Peptide/Proteine kontrolliert, und eine Quantifizierungssoftware für TMT-Datensätze umfasst. Je nach Situation des Nutzers kann die Datenanalyse mit anderen kommerziellen oder frei verfügbaren Programmen erfolgen.

  1. Datenbank-Suche
    1. Konvertieren Sie die .raw-Dateien aus dem MS-Instrument in .mzXML-Dateien und durchsuchen Sie MS2-Spektren mit einer nicht redundanten Ziel-Köder-Datenbank40 , die aus UniProt-Humanproteinsequenzen (oder einer anderen geeigneten speziesspezifischen Datenbank) generiert wurde, um die FDR der identifizierten Proteine zu berechnen.
      HINWEIS: Generieren Sie die nicht redundante Datenbank, indem Sie Proteinsequenzen aus den Datenbanken Swiss-Prot und TrEMBL kombinieren. Man kann auch kundenspezifische Proteinsequenzen hinzufügen, die nicht in diesen Referenzdatenbanken enthalten sind, einschließlich Protease-gespaltener Proteine, Proteine mit Einzelnukleotid-Polymorphismen und häufige Kontaminanten.
    2. Führen Sie eine Suche mit den folgenden Parametern durch. Massentoleranz für Vorläufer: 10 ppm; Massentoleranz für Produktionen: 15 ppm; maximale verpasste Spaltungen: 2; maximale Änderungsstellen: 3; statische Modifikationen: 304.20715 Da für TMT16-Tags auf Lys-Rückständen und N-Termini, 57.02146 Da für Carbamidomethylierung auf Cys-Resten; dynamische Modifikation: 15,99492 Da für die Oxidation auf Met.
  2. Filtern der Suchergebnisse
    1. Filtern Sie die resultierenden Peptid-Spektrum-Übereinstimmungen (PSMs) nach Peptidlänge (>6 Aminosäuren), Massengenauigkeit des Vorläuferions und JUMP-basierten Matching-Scores (Jscore und ΔJn). Die Peptide werden dann nach Peptidlänge, tryptischen Enden, Modifikationen, verpassten Spaltstellen und Ladungszustand gruppiert.
    2. Filtern Sie die Daten weiter mit den übereinstimmenden Werten, um eine FDR unter 1 % entweder auf Protein- (Gesamtproteomanalyse) oder auf Peptidebene (Phosphoproteomanalyse) zu erreichen.
      HINWEIS: Wenn Peptide/Proteine zur Positivkontrolle in den Filterschritten fehlen, kann die FDR auf ein angemessenes Niveau erhöht werden, damit diese Peptide/Proteine gerettet werden können.
    3. Für die Peptide, die von mehr als einem Mitglied einer Proteinfamilie gemeinsam genutzt werden, gruppieren Sie die übereinstimmenden Mitglieder in einer Gruppe.
      HINWEIS: Nach der Regel der Sparsamkeit wird die Gruppe durch das homologe Protein mit der höchsten Anzahl gemeinsamer Peptide und andere Proteine repräsentiert, die durch einzigartige Peptide übereinstimmen.
  3. Quantifizierung von Proteinen
    1. Quantifizieren Sie Proteine mit einem integrierten Programm einer statistischen Software-Suite, um die Intensitäten der TMT-Reporterionen über alle übereinstimmenden PSMs zusammenzufassen.
    2. Extrahieren Sie die TMT-Reporterionenintensitäten aus jedem akzeptierten PSM und korrigieren Sie die Rohintensitäten entsprechend der Isotopenverteilung der einzelnen Markierungsreagenzien (z. B. erzeugt TMT16-126 92,6 %, 7,2 % bzw. 0,2 % der 126-, 127C- und 128C-m/z-Ionen) und filtern Sie PSMs mit geringer Intensität und/oder hohem Rauschen auf der Grundlage benutzerdefinierter Schwellenwerte heraus. Normalisieren Sie die Quantifizierungsdaten anhand der getrimmten mittleren (oder medianen) Intensitäten der Stichproben, um die Lastverzerrung zu korrigieren.
    3. Berechnen Sie für jedes identifizierte Protein die mittelwertzentrierten Intensitäten über Proben hinweg (d. h. relative Intensitäten) der übereinstimmenden PSMs und fassen Sie die relativen Intensitäten der PSMs zusammen, indem Sie den probenbezogenen Durchschnitt nehmen. Wandeln Sie die relativen Signale in absolute Signale um, indem Sie die durchschnittliche Gesamtintensität der drei am häufigsten passenden PSMs multiplizieren.
    4. Korrekte Quantifizierungsinterferenz unter Verwendung eines zuvor berichteten y1-Ionen-Korrekturansatzes37 , der davon ausgeht, dass die y1-Ionenintensität mit der Reporterionenintensität korreliert. Durch die Abschätzung der linearen Beziehung zwischen y1- und Reporterionenintensitäten aus sauberen Scans wird das Interferenzniveau der kontaminierten y1-Ionenintensität in verrauschten Scans abgeleitet und korrigiert.
      HINWEIS: Bei TMT-markierten tryptischen Peptiden sind K-TMT- und R-Reste zwei repräsentative y1-Ionen (376,27574 Da bzw. 175,11895 Da) in einem MS2-Spektrum. Wenn nur ein y1-Ion nachgewiesen wird und mit dem identifizierten Peptid konsistent ist, wird das MS2 als sauberer Scan angesehen. Wenn beide y1-Ionen nachgewiesen werden, wird der MS2 als verrauschter Scan angesehen.
    5. Übertragen Sie die Proteinquantifizierungswerte zur weiteren Analyse in eine Tabelle. Verwenden Sie unüberwachte Datenanalysemethoden wie PCA oder Clustering-Analyse, um die Verteilung der Proben zu untersuchen. Um differentiell exprimierte Proteine zu identifizieren, verwenden Sie statistische Methoden wie t-Tests und Varianzanalyse (ANOVA).

7. Validierung von MS-Daten

HINWEIS: Bevor Sie zeitaufwändige biologische Experimente durchführen, sollten Sie mindestens eine Validierungsmethode verwenden, um die Qualität der MS-Daten zu bewerten.

  1. Manuelle Inspektion der MS/MS-Spektren von Proteinen von Interesse, um die Peptidsequenz und die TMT-Reporterionenintensitäten zu validieren.
  2. Verwenden Sie antikörperbasierte Ansätze (z. B. Western Blotting oder immunhistochemische Analyse), um Veränderungen der Proteinspiegel zu überprüfen. Um das Vorhandensein von nativen Peptiden zu bestätigen, verwenden Sie synthetische Peptide als interne Standards. Die MS/MS-Spektren und die Retentionszeit der Peptide während der LC-MS/MS sollten unter gleichen Bedingungen identisch sein.
  3. Verwenden Sie einen gezielten MS-Ansatz, um Proteinveränderungen zu überprüfen.

Ergebnisse

Das Protokoll für das neu entwickelte TMT16, einschließlich Markierungsreaktion, Entsalzung und LC-MS-Bedingungen, wurde systematisch optimiert41. Darüber hinaus haben wir die 11-Plex- und 16-Plex-Methoden direkt verglichen, indem wir sie zur Analyse derselben menschlichen AD-Proben verwendet haben41. Nach Optimierung der Schlüsselparameter für TMT16 liefern sowohl die TMT11- als auch die TMT16-Methode eine ähnliche Proteomabdeckung, ...

Diskussion

Ein optimiertes Protokoll für TMT16-basiertes tiefes Proteom-Profiling wurde in früheren Publikationen erfolgreich implementiert 12,13,41. Mit dem aktuellen Protokoll können mehr als 10.000 einzigartige Proteine aus bis zu 16 verschiedenen Proben in einem einzigen Experiment routinemäßig und mit hoher Präzision quantifiziert werden.

Um qualitativ hochwertige Erg...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise von den National Institutes of Health (R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, RF1AG064909 und U54NS110435) und ALSAC (American Lebanese Syrian Associated Charities) unterstützt. Die MS-Analyse wurde im Zentrum für Proteomik und Metabolomik des St. Jude Children's Research Hospital durchgeführt, das teilweise durch den NIH Cancer Center Support Grant (P30CA021765) unterstützt wird. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Criterion TGX Precast Midi Protein GelBiorad5671035
10X TGS (Tris/Glycine/SDS) BufferBioRad161-0772
4–20% Criterion TGX Precast Midi Protein GelBiorad5671095
50% HydroxylamineThermo Scientific90115
6 X SDS Sample Loading BufferBoston Bioproducts IncBP-111R
Ammonium Formate (NH4COOH)Sigma70221-25G-F
Ammonium Hydroxide, 28%Sigma338818-100ml
Bullet BlenderNext AdvanceBB24-AU
Butterfly Portfolio HeaterPhoenix S&TPST-BPH-20
C18 ZiptipsHarvard Apparatus74-4607Used for desalting
Dithiothreitol (DTT)SigmaD5545
DMSOSigma41648
Formic AcidSigma94318
Fraction CollectorGilsonFC203B
Gel Code Blue Stain ReagentThermo24592
Glass BeadsNext AdvanceGB05
HEPESSigmaH3375
HPLC Grade AcetonitrileBurdick & JacksonAH015-4
HPLC Grade WaterBurdick & JacksonAH365-4
Iodoacetamide (IAA)SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
Mass SpectrometerThermo ScientificQ Exactive HF
MassPrep BSA Digestion StandardWaters186002329
MethanolBurdick & JacksonAH230-4
Nanoflow UPLCThermo ScientificUltimate 3000
Pierce BCA Protein Assay kitThermo Scientific23225
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9umDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
Self-Pack ColumnsNew ObjectivePF360-75-15-N-5
SepPak 1cc 50mgWatersWAT054960Used for desalting
Sodium DeoxycholateSigma30970
SpeedvacThermo ScientificSPD11V
TMTpro 16plex Label Reagent SetThermo ScientificA44520
Trifluoroacetic Acid (TFA)Applied Biosystems400003
TrypsinPromegaV511C
Ultra-micro Spin Column,C18Harvard apparatus74-7206Used for desalting
UreaSigmaU5378
Xbridge Column C18 columnWaters186003943Used for basic pH LC

Referenzen

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