Irradiator التكليف وقياس الجرعات لتقييم LQ α والمعلمات β، مخطط الجرعات الإشعاعية، وفي ترسب جرعة vivo

Summary

ويوفر قياس الإشعاع تقنية لتعزيز دقة التجارب قبل السريرية وضمان أن تكون الجرعات الإشعاعية التي يتم تسليمها مرتبطة ارتباطا وثيقا بالمعلمات السريرية. ويصف هذا البروتوكول الخطوات التي يتعين اتخاذها في كل مرحلة أثناء تجارب الإشعاع قبل الاختباري لضمان التصميم التجريبي السليم.

Abstract

ويعتبر قياس الجرعات الإشعاعي أمراً حاسماً في دقة تسليم وتكاثر مخططات الإشعاع في النماذج قبل التكينية من أجل تحقيق أهمية عالية في مجال الترجمة. قبل إجراء أي تجارب في المختبر أو في الجسم الحي، يجب تقييم ناتج الجرعة المحددة للإشعاع والتصاميم التجريبية الفردية. باستخدام غرفة التأين، الكهربائي، وإعداد المياه الصلبة، ويمكن تحديد إخراج جرعة من حقول واسعة في isocenter. باستخدام إعداد مماثل مع الأفلام المشعة في مكان غرفة التأين، يمكن أيضا تحديد معدلات الجرعة للحقول الصغيرة في أعماق مختلفة. في المختبر كلونوجينيك البقاء على قيد الحياة اختبارات الخلايا السرطانية استجابة للعلاج الإشعاعي هي تجارب غير مكلفة التي توفر مقياسا للحساسية الراديوية المتأصلة من خطوط الخلية عن طريق تركيب هذه البيانات مع النموذج التقليدي الخطي التربيعي. المعلمات النموذجية المقدرة من هذه المقايسات، جنبا إلى جنب مع مبادئ الجرعات البيولوجية الفعالة، يسمح المرء لوضع جداول تجزئة متفاوتة للعلاج الإشعاعي التي توفر جرعات فعالة مكافئة في التجارب الحيوانية الحاملة للأورام. هذا هو عامل مهم للنظر في الصحيح في مقارنة في جداول العلاج الإشعاعي في الجسم الحي للقضاء على الخلط المحتملة للنتائج بسبب التباين في الجرعات الفعالة تسليمها. توفر هذه المقالة مجتمعة طريقة عامة للتحقق من إنتاج الجرعة قبل الأشعة الحيوانية والحيوانات في الخزانة، وتقييم في المختبر للحساسية الراديوية، والتحقق من إيصال الإشعاع في الكائنات الحية الصغيرة.

Introduction

تمثل السرطانات مجتمعة السبب الثاني الرئيسي للوفاة في الولايات المتحدة وفي العديد من البلدان حول العالم¹. العلاج الإشعاعي هو حجر الزاوية في العلاج للعديد من أنواع الأورام الفرعية ويدار إلى حوالي نصف جميع مرضى السرطان^2,3. وقد تحسنت نتائج المرضى على ما يقرب من جميع أنواع السرطان مع مرور الوقت والمعدات المستخدمة لتقديم جرعات الإشعاع قد تقدمت باطراد وبعض النهج العلاجية المتعددة الوسائط الفعالة وضعت^4,5,6, ولكن تكرار ومعدلات الوفيات للمرضى الذين يعانون من أنواع معينة من الأورام لا تزال مرتفعة^7,8,9. وهكذا، لا يزال العلاج الإشعاعي للسرطان مجالا نشطا للبحوث الأساسية والسريرية. تستخدم العديد من دراسات العلاج الإشعاعي قبل السريرية استخدام أجهزة الإشعاع الصغيرة النطاق لتوصيل جرعات الإشعاع إلى النماذج في المختبر أو الحيوان من السرطان. مع العديد من التجارب المحتملة لإجراء استكشاف تفاصيل البيولوجيا الإشعاعية الآلية أو العلاجات الجديدة، قد تواجه المزالق المشتركة التي تؤدي إلى استنتاجات غير صحيحة، وسوء استنساخ، والموارد الضائعة. تقع هذه المزالق ضمن ثلاثة مجالات هامة: قياس الجرعات المشع، وتوصيف في المختبر لخطوط الخلايا النموذجية، وفي جدول الجرعات الإشعاعية الحية والإعداد. يصعب تحقيق نتائج دقيقة وقابلة للتكرار من تجارب أكثر تقدما دون الاهتمام المسبق بهذه الجوانب الأساسية لأبحاث العلاج الإشعاعي.

ويصف البروتوكول المفصل هنا استراتيجية عامة لتجنب هذه المسائل أو التخفيف منها، ويستند إلى عدة منهجيات سبق وضعها الغرض منها استخدامها بصورة مستقلة. وقد تم دمج هذه الأساليب المتميزة بحيث يمكن للباحث المهتم في بدء أو تحسين تجارب العلاج الإشعاعي قبل الكلينيكي استخدام هذا كالتخطيط التجريبي القوي. ويتضمن الإطار المقترح منهجية لتكليف أجهزة إشعاع الحيوانات الصغيرة النطاق، وتحديد الخصائص الإشعاعية الأساسية لخطوط الخلايا السرطانية النموذجية، وتصميم وإدارة جدول زمني للداويات والتجزئة في النماذج الخاصة بالورم الجسمي.

Protocol

أي خطوات من هذا البروتوكول تنطوي على استخدام الحيوانات المختبرية، بما في ذلك مناولة وإجراءات، وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة فرجينيا الغربية في مورغانتاون، فيرجينيا الغربية (رقم البروتوكول: 1604001894).

1- تحديد ناتج الجرعة

1. استخدم هذا البروتوكول، استناداً إلى بروتوكول "الأسلوب الوهمي" التابع لمجموعة عمل الجمعية الأمريكية للفيزيائيين في الطب (AAPM TG) 61¹⁰ والمماثل لبروتوكول التكليف الذي وضعه Xstrahl، لتحديد إخراج شعاع من المشعع الحيواني الصغير فيما يتعلق بهندسة معينة في ظل ظروف الإعداد التالية.
   1. تعيين المشعل لتوصيل الإشعاع في 220 kVp و 13 م أي، مع حقل مفتوح (17 سم في 17 سم) في ايزونتر، أو 35 سم من المصدر. بالإضافة إلى ذلك، قم بتصفية الشعاع مع مرشح Cu 0.15 مم مع تركيز واسع. تحتوي بعض أجهزة الإشعاع الخلوية على مصدر مشع فقط، ولا يمكن استخدام هذا البروتوكول إلا في الأشعة السينية.
   2. محاذاة أشباح الماء الصلب في الترتيب التالي: 1 سم بلاطة، 2 سم بلاطة مع فتحة غرفة التأين، 2 سم بلاطة، 1 سم بلاطة. التراص أشباح المياه الصلبة في هذا النظام مواقف غرفة التأين في عمق 2 سم، والسماح 4 سم وكذلك ل backscatter. راجع الشكل 1 للحصول على تصوير رسومي لإعداد قياس الجرعات.
      ملاحظة: لاستيعاب كومة كبيرة، ثقيلة إلى حد ما من المياه الصلبة، يوصي المؤلفون الحصول على العرف 3D أريكة المطبوعة مع دعم متغير لضمان كومة الوهمية هو مستوى وعلى مسافة صحيحة من المصدر عبر سطح المواد، وليس فقط في المركز.
2. استخدام معدات القياس (أي، ADCL معايرة غرفة التأين، الكهربائي) وشرح لعوامل التصحيح المستخدمة يمكن العثور عليها في جدول المواد والجدول 1 على التوالي.
   ملاحظة: أن ADCL يوفر قيم_{N ك} في بضع نقاط لطبقات القيمة نصف مختلفة (HVL، قياس جودة الحزم). وينبغي أن تستند قيمة_{N k} التي ستستخدم في البروتوكول إلى استلِك قيم ADCL لـ HVL المقاسة للوحدة. قام الصانع بقياس HVL من وحدتنا واستخدمنا ذلك في تحديد معدل الجرعة الناتج.
3. قم بإعداد المكدس phantom ثم إدراج غرفة التأين في phantom كما هو محدد في الخطوة 1.1.2.
   1. ضبط كومة الوهمية بحيث المصدر إلى السطح المسافة (SSD)، أو المسافة من مصدر الإشعاع إلى السطح الأول، هو 33 سم عندما تعادل بشكل مناسب.
      ملاحظة: يقترح المؤلفون إنشاء أريكة مطبوعة ثلاثية الأبعاد مخصصة، كبيرة بما يكفي لدعم أبعاد ألواح المياه الصلبة. بالإضافة إلى ذلك واحد، المستخدمة في هذا البروتوكول يحتوي على مكون قابل للتعديل لتسوية المكدس phantom.
4. خذ متوسط ثلاثة التعرضات منفصلة للأشعة السينية، قراءات دقيقة واحدة مع الجهد الكهربائي التحيز تعيين في 300 V. سيتم تسميته النتيجة M⁺.
   ملاحظة: يتم إجراء عمليات التشعيع مع جهاز من المقرر أن يسلم الإشعاع في 220 كيلو ف ف و 13 م أ. هذا هو نفسه بالنسبة للخطوات التالية اثنين (الخطوات 1.5-1.6). لسلامة المستخدم، تأكد من أن الأبواب تظل مغلقة أثناء العلاجات.
5. تنفيذ مجموعة أخرى من ثلاثة التعرض للأشعة السينية منفصلة، 1 قراءات دقيقة مع الجهد الكهربائي التحيز تعيين في -150 V. سيتم تسميته النتيجة M_L.
6. تنفيذ مجموعة أخرى من ثلاثة التعرض للأشعة السينية منفصلة، 1 قراءات دقيقة مع الجهد الكهربائي التحيز تعيين في -300 V. وسوف يطلق على النتيجة M_H، أو أيضا M^-.
7. حساب P_pol و P_أيون باستخدام المعادلة 1 و المعادلة 2 على التوالي كما هو موضح أدناه:
   (المعادلة 1)
   (المعادلة 2)
8. قياس درجة الحرارة، في مئوية، والضغط، في كيلو باسكال، داخل المشعع باستخدام مقياس حرارة الرقمية معايرة ومقياس. ثم، حساب P_TP كما هو مبين أدناه في المعادلة 3.
   ملاحظة: يفترض هذا الحساب أن ADCL تستخدم قيم درجة الحرارة القياسية والضغط من 22 درجة مئوية و 101.33 كيلو باسكال عند ذكر قيمتها لمعامل معايرة الكيرما الهواء.
   (المعادلة 3)
9. حساب قراءة الغرفة تصحيحها، M، عن طريق ضرب قراءة غرفة الخام، M_H،من قبل P_elec،P_pol،P_ion،وP_TP. يمكن العثور على هذه المعادلة أدناه في المعادلة 4.
   ملاحظة: يفترض هذا الحساب أن ADCL تنفيذ معايرة مع الجهد التحيز تعيين إلى -300V، وهو ممارسة شائعة إلى حد ما.
   (المعادلة 4).
10. مزيد من ضرب قراءة الغرفة تصحيحها من قبل_{ن ك}، [(μ_en/ ع)^ث_الهواء]_الماء، P Q_{، شام}، و P_اغاد. هناك حاجة فقط إلى_اأغام P للقياسات التي يتم الحصول عليها في الماء. لذلك، لهذا البروتوكول P_{مُجرد 1.}
    ملاحظة: باستخدام الشروط في هذا البروتوكول العناصر الثلاثة الأخيرة إعطاء قيمة 1.0731. هذه القيمة تعتمد على جودة الحزمة، لذلك يجب أن يكون من المعروف HVL لتحديده. قيمة 1.0731 محددة إلى وحدتنا ويتم إعطاء كمثال. لتحديد قيم P_{Q و cham} و [(μ_en/p)^w_air)_الماء الخاص بوحدتك ، استخدم HVL المقاس و اُستدُل من الجدول السابع، والجدول الثامن، وصحّ لحجم الحقل المرجعي وفقًا للحجم 3 والشكل 4 من بروتوكول AAPM TG61¹⁰. في حالتنا، ضرب N_k في 1.0731 يوفر الجرعة إلى الماء، D_ث، في Gy لوقت اسمي قدره 1 دقيقة، على افتراض أن_قيمة N ADCL تعطى في Gy / Coulumbs.
11. تحديد التأثير النهائي للإشعاع المستخدم. عندما يتم إنشاء الأشعة السينية لأول مرة، يرتفع الناتج إلى قيمته الكاملة على مدى بعض الوقت المحدود. وبالمثل، عند إيقاف تشغيل مصدر الأشعة السينية، ينخفض الإخراج إلى الصفر خلال بعض الوقت المحدود.
    1. حساب الوقت لهذا الانتقال أو تأثير النهاية. ويمكن القيام بذلك عن طريق اتخاذ متوسط ثلاث قراءات مع الجهد الكهربائي التحيز تعيين في -300 V، لمجموعة متنوعة من إعدادات الوقت. قم بذلك لمدة 6، 12، 18، 24، 30، و 60 ثانية.
    2. رسم قراءات الكهربائي ضد الزمن والعثور على أفضل خط مستقيم. يمكن حساب الوقت الإجمالي، t، للعلاج لمدة دقيقة واحدة بواسطة المعادلة 5:
       (المعادلة 5).
12. حساب معدل الجرعة لاشععة معينة عن طريق المعادلة 6:
    (المعادلة 6)

2. إنشاء منحنى معايرة فيلم radiochromic

1. للحصول على قائمة بالمواد الضرورية، راجع جدول المواد.
2. باستخدام مجموعة مماثلة تقريبا حتى البروتوكول السابق، ووضع الفيلم في عمق 2 سم في كومة الماء الصلبة الوهمية. ترتيب أشباح المياه الصلبة هو تافهة طالما أن هناك 2 سم من الماء الصلب أعلاه و 4 سم من الماء الصلب أدناه لتراكم وآثار backscatter.
3. باستخدام الجرعة المحددة التي تم التكليف بها في البروتوكول 1، حدد أوقات العلاج للجرعات المذكورة في الجدول 2 باستخدام المعادلة 7:
   (المعادلة 7)
4. إعداد عدة قطع من الفيلم ضمان أن كل فيلم هو من نفس الحجم ويبقى في نفس التوجه من العلاج من خلال الحصول على المسح الضوئي. ويمكن القيام بذلك عن طريق وضع قطع قطري صغير في الزاوية اليسرى السفلى. كل فيلم من هذه النقطة إلى الأمام يجب أن يكون من نفس الدفعة من الفيلم.
   ملاحظة: إعداد 3 نسخ متماثلة منفصلة لكل نقطة جرعة ليتم تقييمها.
5. مسح قطع قطع باستخدام ماسح ضوئي 48 بت لون الصورة مع جميع التصحيحات إيقاف. تأكد من وضع كل فيلم في المركز الدقيق لسرّة المسح الضوئي. القيم التي تم الحصول عليها هي عمليات الفحص قبل التعرض المستخدمة لتحديد الكثافة البصرية غير المكشوفة^11،12. احفظ كافة الصور في . تنسيق ملف tiff لتجنب ضغط البيانات الرئيسية.
   ملاحظة: يوصي المؤلفون بمسح الأفلام ثلاث مرات واستخدام المتوسط الذي تم الحصول عليه كقيمة مفردة لفيلم معين.
6. ابدأ تشعيع الأفلام بوضع قطعة من الفيلم فوق 4 سم من الماء الصلب ووضع ما تبقى من 2 سم من الماء الصلب أعلاه، كما هو موضح سابقا في هذا القسم.
7. ضبط مجموعة الوهمية بحيث الفيلم هو نفس المسافة من المصدر كما كانت غرفة التأين عند تحديد الناتج الجرعة. هذه هي النقطة متساوي المركز من المشعع.
8. برنامج وقت العلاج المحسوب في الخطوة 2.3 أعلاه لجرعة واحدة المقررة.
9. تكرار العلاج لكل جرعة من الجرعات المذكورة في الجدول 2.
10. السماح للأفلام باستراحة لمدة 24 ساعة محمية من الضوء.
11. الحصول على ما بعد التعرض للفيلم بمسح بنفس الطريقة كما هو أعلاه.
12. استيراد الصور إلى برنامج تحليل ImageJ وإجراء جميع القياسات على القناة الحمراء.
    1. اسحب الصورة في . تنسيق ملف Tiff في ImageJ.
    2. انقر على القائمة المنسدلة للصورة. حدد لون من القائمة المنسدلة للصورة. حدد تقسيم القنوات من خيار اللون.
    3. باستخدام قناة الصورة الحمراء فقط، رسم منطقة من الاهتمام باستخدام أداة المستطيل. اضغط على Ctrl+ M. نسخ قيمة متوسط من نافذة النتائج.
    4. كرر الخطوات 2.12.1-2.12.4 لكافة الأفلام الممسوحة ضوئياً.
13. الحصول على قيمة بكسل في موقع مركزي 1 سم مربع في 1 سم لكل من الأفلام غير المكشوفة وفضحها. سيتم الإشارة إلى هذه القيم على أنها PV_U(D) و PV_(D) على التوالي، ويمكن استخدامها لحساب صافي الكثافة البصرية كما هو موضح في المعادلة 8.
    (المعادلة 8) ¹³
14. كرر الخطوة 2.13 لكل زوج من صور الفيلم، سواء قبل التعرض وما بعد التعرض.
15. رسم رسم بياني للجرعة مقابل صافي الكثافة البصرية وتناسب المنحنى إلى متعدد الحدود مكعب في شكل y = ax³ + bx² + cx + d. ويمكن الاطلاع على مثال في الشكل 2B.

3. تحديد قيمة α/β لخطوط خلايا سرطانية محددة عن طريق فحص كلونوجينيك

ملاحظة: البروتوكول التالي هو إصدار معدل من الأساليب التي وصفها Franken وآخرون¹⁴ ويمكن رؤيتها في الشكل 3.

1. تنمو الخلايا إلى ~ 80٪ التقاء. تجنب استخدام المصادر المفرطة في التقاء الخلايا لهذه التجربة، حيث أنه من الضروري أن تكون الخلايا في مرحلة اللوغاريتم لنمو الخلايا. بالنسبة لنتائج الفحص المُمثلة لكلونوجين المعروضة في الشكل 3C، تم استزراع خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 في Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مع مصل الأبقار الجنينية بنسبة 10٪ والبنسلين / الستريبتوميسين وتم احتضانها عند 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ في حاضنة مرطبة.
2. بذور الخلايا في الكثافة المطلوبة لم مقايسة مستعمرة. إن التخفيفات الدقيقة أثناء البذر حاسمة في تحديد كفاءة الطلاء في الفحص. تأكد من لوحة النسخ المتماثلة متعددة.
3. المضي قدما في هذه الخطوة إذا العلاج الإشعاعي سوف تسبق الخلية الطلاء (الشكل 3A). بدلاً من ذلك، انتقل إلى الخطوة 3.4 إذا كان الطلاء الخلية سيسبق العلاج الإشعاعي.
   1. إجراء العلاج الإشعاعي المطلوب على قارورة الثقافة. أي علاجات إضافية (أي العلاج بالعقاقير) يمكن أن يتم إجراؤها في أي وقت قبل أو بعد ذلك. للحصول على النتائج التمثيلية في الشكل 3C، حدث العلاج الإشعاعي بعد طلاء الخلايا ، مفصلة في الخطوة 3.4.
   2. استخراج الخلايا باستخدام أسلوب التبسينيونية المفضلة وإنشاء تعليق خلية واحدة. إزالة وسائل الإعلام والثقافة وإضافة إنزيم المؤتلف (على سبيل المثال، TrypLE اكسبرس) لفصل الخلايا من القارورة. احتضان الخلايا مع الانزيم لمدة 3 دقائق تقريبا حتى يتم فصل الخلايا كما تم الكشف عن استخدام المجهر الخفيف. تحييد الانزيم باستخدام حجم متساو من وسائل الإعلام ثقافة الخلية. خلايا الطرد المركزي في 300 س ز لمدة 10 دقيقة و resuspend إلى التركيز المطلوب في الوسط الثقافة.
   3. لوحة الخلايا في الكثافات المطلوبة في النسخ المتماثلة متعددة.
   4. استبدال مع وسائل الإعلام الطازجة بعد أول 24 ح.
   5. استمر في استبدال الوسائط كل 2-3 أيام.
   6. مواصلة زراعة الخلايا حتى السيطرة المستعمرات تتجاوز 50 خلية لكل مستعمرة، ~ 9-14 يوما. المستعمرات السيطرة هي تلك المجموعات المعالجة التي لا تتلقى جرعات الإشعاع. للتجارب التي تستخدم العلاجات المخدرات أيضا، مجموعة أخرى من السيطرة مع الجرعات الدوائية ولكن لن تكون هناك حاجة أيضا العلاج الإشعاعي.
4. المضي قدما في هذه الخطوة عند خلايا البذر قبل العلاج الإشعاعي ( الشكل3B).
   1. استخراج الخلايا باستخدام أسلوب التبسينيونية المفضلة وإنشاء تعليق خلية واحدة.
   2. ضع الخلايا في الكثافات المطلوبة في نسخ متماثلة متعددة.
   3. السماح للخلايا بالتمسك بطبقة بين عشية وضحاها.
   4. إجراء الجرعات الإشعاعية المطلوبة. ويمكن إجراء علاجات إضافية، مثل الدوس الدوائي، في أي وقت قبل أو بعد هذه الخطوة، طالما أن الخلايا قد تعلق على لوحات العلاج الخاصة بهم. للحصول على النتائج التمثيلية في الشكل 3C،1250 الدماغ المداري MDA-MB-231 كانت مطلية قبل العلاج (الخطوة 3.4). ثم تم علاج الخلايا بـ 15 ن ن م دوكسيروبايسين قبل 3 ساعات من التشعيع مع 3 جي من الأشعة السينية.
   5. استبدال وسائل الإعلام بعد 24 ساعة الأولى.
   6. استبدال وسائل الإعلام كل 2-3 أيام.
   7. ثقافة الخلايا المعالجة حتى السيطرة على مستعمرة مجموعة تتجاوز 50 الخلايا، ~ 9-14 يوما. المستعمرات السيطرة هي تلك المجموعات المعالجة التي لا تتلقى جرعات الإشعاع. للتجارب التي تستخدم العلاجات المخدرات أيضا، مجموعة أخرى من السيطرة مع الجرعات الدوائية ولكن لن تكون هناك حاجة أيضا العلاج الإشعاعي.
5. إزالة وسائل الإعلام الثقافة من الآبار أو الأطباق، وغسل مع برنامج تلفزيوني.
6. إصلاح الخلايا لمدة 15 دقيقة في 1:7 (v:v) حل من حمض الخليك الجليدي والميثانول.
7. إزالة حل التثبيت.
8. بعد التثبيت، وخلايا وصمة عار لمدة 30 دقيقة، أو 2 ح إذا كان الوقت متوفرا، في درجة حرارة الغرفة مع 2.5-5.0 ملغ / مل حل من البنفسجي الكريستال في محلول 4:1 (الخامس:الخامس) من الماء المقطر والميثانول.
9. إزالة حل تلطيخ وغسل الخلايا في حمام المياه كبيرة، درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: لا تغسل تحت الماء الجاري.
10. عد العدد الناتج من المستعمرات في كل مجموعة العلاج وحساب جزء البقاء على قيد الحياة من كل لوحة.
11. رسم كسر البقاء على قيد الحياة ضد الجرعة المقابلة تسليمها، وتناسب المنحنى مع نوبة أسية.
12. لتقدير قيمة α/β، استخدم احتواء أسي للمؤامرة أعلاه لتقدير القيم لكل معلمة قابلة للتعديل في المعادلة الخطية التربيعية الموجودة أدناه:
    (المعادلة 9)
    ملاحظة: يمكن عادةً أن يتم تشعيع الخلايا في isocenter دون أي تجميع شريطة أن يكون حجم الحقل كبيرًا بما يكفي لاستيعاب أطباق الأطباق أو الأطباق بتري. قد تشمل المزالق المحتملة في هذا البروتوكول غلة مثل عدم تكوين مستعمرة، وهجرة الخلايا الكبيرة مع نمو الخلايا واضحة ولكن لا توجد مستعمرات حقيقية، أو التلوث بسبب العلاج في غرفة الإشعاع غير العقيمة.

4- تحديد ناتج الجرعة المحددة للتصاميم التجريبية المتغيرة

1. قرر حجم الحقل المطلوب والمسافة من المصدر.
   ملاحظة: سوف Coll تغيير معدل الجرعة بغض النظر عن حجم أو المسافة من collimator من مصدر الأشعة السينية.
2. باستخدام أشباح المياه الصلبة لتوفير تراكم و backscatter، وضع قطعة من الفيلم في الاتجاه الصحيح الذي يصور أفضل تصميم تجريبي.
   ملاحظة: بالنسبة لأي إعداد تجريبي قد لا توفر المياه الصلبة التمثيل الأكثر دقة لتصميم معين. بدلا من ذلك نوصي باستخدام السفن التجربة الفعلية (أي، طبق بيتري، لوحات جيدا، والأشباح الحيوانية الصغيرة، الخ).
3. تشع الأفلام لمدة 1 (N = 3) و 2 (N = 3) دقيقة.
4. السماح للأفلام باستراحة لمدة 24 ساعة محمية من الضوء.
5. تحديد الكثافة البصرية الصافية لكل فيلم من الأفلام بعد الإجراءات من القسم 2. استخدام منحنى معايرة الفيلم لتحديد الجرعة من كثافة بصرية صافي.
6. تحديد الجرعة في 1 دقيقة، D₁، كما معدل الجرعة الناتجة، Ḋ، لهذا الإعداد التجريبية المعرفة من قبل المعادلة 10 على النحو التالي:
   (المعادلة 10)
7. وبالمثل، معادلة الجرعة في 2 دقيقة من قبل المعادلة 11 على النحو التالي:
   (المعادلة 11)
8. بسبب التأثير النهائي، قد يكون معدل الجرعة للحسابات المذكورة أعلاه مختلفة قليلا. لهذا السبب لحساب D_exp لتصميم التجريبية المطلوبة ، واستخدام متوسط من_exp D الفردية كما هو مبين في المعادلة 12:
   (المعادلة 12)
9. باستخدام هذا المتوسط ، وتحديد الوقت لعلاج أي جرعة المطلوب لهذا الإعداد خاصة في المعادلة 13:
   (المعادلة 13)

5. علاج الفئران التي تحمل الأورام في الموقع التشريحي من الفائدة

1. تخدير الماوس مع تقنيات التخدير الآمن والإنساني التي وافقت عليها IACUC المؤسسة.
2. وضع الحيوانات تخدير في ضبط النفس كما هو مبين في التصميم التجريبي المطلوب.
3. هذه الخطوة اختيارية، إذا لم تكن متوفرة انتقل إلى الخطوة 5.6. الحصول على مخطط الراديو، وذلك باستخدام كاميرا مدخل على متن الطائرة، من الماوس دون collimation باستخدام مرشح الألومنيوم.
4. الحصول على التصوير الإشعاعي الثاني مع التجميع في مكان.
5. تراكب المخططات الراديوية في ImageJ لتوضيح موضع الحزمة.
6. باستخدام قيمة α/β المحددة مسبقًا، حدد مخطط الجرعة الذي يوفر النهج الأكثر معقولية للإجابة على سؤال بحثي (أي إذا كان يريد نماثة آثار جرعة 30Gy التي يتم تسليمها في 10 أجزاء من 3 جيه، ولكن فقط ترغب في إعطاء أربعة كسور). باستخدام المعادلة 14، مع α المفترضة/ β قيمة 10 (يمكن تحديد هذه القيمة لخطوط الخلايا السرطانية الفردية في البروتوكول 3)و BED مماثلة لتلك 30 Gy/10 F، علاج مع 24 Gy في 4 كسور من 6 جيه.
7. علاج الحيوان للوقت المحدد نظرا للجرعة المطلوبة.

6- تأكيد الترسب الهَثولوجي للجرعة في الجسم الحي

1. بعد بروتوكول 5، وجمع الأنسجة ذات الاهتمام في غضون ساعة واحدة من العلاج^15،16. بعد حصاد الأنسجة، والمضي قدما مع بروتوكول المناعة المفضلة. ويرد أدناه مثال على ذلك.
2. perfuse مع الجليد البارد 4٪ شبهformaldehyde (PFA).
3. بعد الإصلاح في PFA عند 4 درجة مئوية.
4. بعد التثبيت، وإصلاح الأنسجة بالتتابع في 10٪، 20٪، و 30٪ السكروز لمدة 24 ساعة لكل في درجة حرارة الغرفة.
5. تضمين الأنسجة في الجيلاتين و إصلاح بالتتابع في 4٪ PFA ومرة أخرى في السكروز 10-30٪ لمدة 24 ساعة لكل في درجة حرارة الغرفة.
6. تقليم كتلة ومكان في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
7. شريحة الأنسجة إلى 20-30 ميكرومتر المقاطع.
8. الشرائح المثبطة كأقسام عائمة حرة في ستة لوحة جيدة^17،18.
   1. غسل ثلاث مرات و Permeabilize لمدة 30 دقيقة على شاكر مع 1.83٪ ليسين في 1٪ تريتون، و 4٪ مصل الماعز المعطل للحرارة.
   2. تحتضن أقسام مع الأجسام المضادة γH2AX لمدة ٢٤ ساعة، تليها حضانة لمدة ساعتين مع الأجسام المضادة الثانوية المرغوب فيها.
   3. الشرائح الأغطية مع أغطية زجاجية باستخدام وسائط التركيب المفضلة.
9. صورة على مجهر فلوري.

النتائج

وبعد البروتوكول 1 سوف توفر معدل جرعة في Gy / min، وهو خاص للإشعاع المستخدمة. ومع ذلك، بغض النظر عن نوع المشعع، مع معدل جرعة معروف منحنى المعايرة يمكن أن تنشأ باستخدام بروتوكول 2 إنتاج أفلام مماثلة ومنحنى معايرة مماثلة لتلك الموجودة في الشكل 2A-B. إن الفحص الناجح من البروتوكول 3 سوف ينتج مستعمرات متميزة ومُتَسمّاً جيداً من الخلايا التي تلطخ البنفسجي المتجانس. ويمكن مقارنة تقدير α/β بقيم المؤلفات أو مجموعات المعالجة الأخرى لتفسير الحساسية الراديوية لخط الخلية. استخدام منحنى المعايرة وضعت بعد البروتوكول 2 وعرضها في الشكل 2B، والبروتوكول 4 سوف تسفر عن اثنين من عينات الفيلم تشبه الشكل 2A التي يمكن استخدامها لتقدير مرات التشعيع التجريبية المطلوبة. إذا كانت كاميرا تصوير البوابة على متن الطائرة متاحة للإشعاع المستخدمة، يمكن الحصول على الموجات الراديوية للحيوانات الصغيرة مع وبدون تجميع. وتراكب هذه الصور سوف تظهر الموضع الدقيق للشعاع الإشعاعي collimated نسبة إلى الحيوان الصغير تعامل كما هو مبين في الشكل 4A. ويمكن تأكيد ترسب الجرعة الناجحة في البروتوكول 5 بعد البروتوكول 6. ومن المؤشرات التي تشير إلى أن الإشعاع يترسب في نظم في الجسم الحي أو في المختبر هو الكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل. يتضح في الشكل 4B، نفس الماوس تعامل فقط من خلال نصف الكرة الأيمن في الشكل 4A، يوضح تلطيخ γH2AX الإيجابية فقط في نصف الكرة الأرضية المعالج. في هذا الشكل، ملطخة النوى مع DAPI لإظهار شيئين; 1) كله من الدماغ الذي تم تطبيق الأجسام المضادة المضادة γH2AX على أثناء التحليل النسيجي، و 2) نصف الكرة الأرضية غير المعالجة من الدماغ لا تزال غير مظلية.

الشكل 1: الخام انشاء غرفة التأين والمياه الوهمية التي أنشئت لتحديد الناتج جرعة. يوضح الرسم التخطيطي إعداد أساسي باستخدام المكونات المختلفة المطلوبة لإجراء قياس الجرعات باستخدام غرفة تأين وأشباح المياه الصلبة داخل مجلس الوزراء من المشعع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: توليد منحنى المعايرة باستخدام فيلم إشعاعي. (A) تغيير اللون تمثيلي للفيلم radiochromic مع زيادة الجرعة. أعلى اليسار (0 cGy); أسفل اليمين (2000 cGy). (ب)منحنى معايرة الفيلم المشع المحتمل مقارنة صافي الكثافة البصرية والجرعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: فحص كلونوجينيك للخلايا السرطانية. يمكن أن يتم العلاج الإشعاعي للخلايا قبل الطلاء في ستة أطباق جيدا / أطباق بيتري (A), أو بعد (B). في لوحة (C) ، يتم عرض صورة تمثيلية من كلونوجينيك ناجحة مع خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 بعد اتباع البروتوكول القسم 3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: استخدام مزدوجة متراكبة radiograms لتحديد المواقع (إن كان متوفرا) والإيجابية γH2AX تلوين الترسبات المناعية لتأكيد ترسب الجرعة. (A) الممثل تراكبات الإذاعة التي تصور موضع شعاع الإشعاع. (B) نتائج تمثيلية تشير إلى ترسب الجرعة إلى نصف الكرة الأيمن كما يتضح من زيادة كثافة γH2AX. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عامل التصحيح	تفسير
Nκ	معامل معايرة الكيرما الهوائي
[(μen/ρ)Wالهواء] المياه	الحصة من معامل امتصاص الطاقة الشامل من المياه إلى الهواء؛ حوالي 1.05
Pq, شام	تصحيح المحاسبة عن جذع الغرفة التي تؤثر على الفوتون فلوتبنس من قبل الغرفة؛ تقريبا 1.022
فمُلَمّد	محاسبة التصحيح لغادة حماية غرفة التأين؛ قيمة 1، كما هو غرفة للماء
Ppol	عامل تصحيح المحاسبة القطبية; يحدد في البروتوكول 1
Pأيون	عامل تصحيح حساب إعادة التركيب الأيوني؛ يحدد في البروتوكول 1
PTP	تصحيح عامل acocunting لتمرّد وضغطة على يوم التجربة; يحدد في البروتوكول 1

الجدول 1: عوامل التصحيح اللازمة لتحديد معدل الجرعات في البروتوكول 1.

جرعه	ن
0.5	3
1	3
2	3
3	3
4	3
6	3
8	3
10	3
12*	3
15*	3
20*	3
* فقط ضروري للجرعات التي تتجاوز 10 للتجارب الفردية.

الجدول 2: الجرعات التي ستستخدم في توليد منحنى معايرة الأفلام المشعة.

Discussion

يصف البروتوكول أعلاه منهجًا سهل الاستخدام لتقييم الجرعات الإشعاعية، وتحديد قيم α/β في خطوط الخلايا السرطانية، ومثالًا موجزًا على نهج التشعيع في نموذج ما قبل التكين من انبثاث الدماغ لسرطان الثدي. يمكن استخدام هذه الطرق لدراسة أي نموذج من السرطان ولا تقتصر فقط على انبثاث الدماغ من سرطان الثدي. في هذا القسم سوف نناقش التعقيدات ذات الصلة الكامنة تحت التجارب العلاج الإشعاعي قبل الكلينيكي.

يتضمن قياس الجرعات جزأين: 1) معايرة الإخراج مع غرفة مزارع ، بحيث يتم إنشاء معدل الجرعة من وحدة الأشعة السينية ، و 2) إعداد نظام قياس قياس الجرعات العملي باستخدام فيلم radiochromic. فيما يتعلق بمعايرة الإخراج، يوفر TG-61 طريقة قابلة للتكرار في الماء. البروتوكول هنا يستخدم غميكس RMI 457 المياه الصلبة، على النحو الموصى به من قبل XStrahl، الشركة المصنعة للإشعاع. على الرغم من أن قياس الجرعات النسبية (لمحات أو منحنيات جرعة العمق تطبيعها إلى أقصى جرعة) تحليل مع الماء الصلب، يوافق على أفضل من 1٪ مع أن من الماء، وهناك فرق من حوالي 3 إلى 4٪ في الجرعة المطلقة بسبب ارتفاع معامل امتصاص الطاقة الجماعية للمياه الصلبة مقارنة بالماء. ومع ذلك، حيث أن جميع المنشآت من نظام XStrahl استخدام بروتوكول المياه الصلبة لمعايرة الانتاج، ونحن لم تصحيح لهذه الاختلافات. معرفة الناتج يسمح لحساب الوقت التعرض المطلوب لتقديم الجرعة المطلوبة. وضع الفيلم في الإعداد نفسه كما غرفة المزارعين يسمح لنا لتقديم جرعات معروفة للفيلم. مسح الفيلم ثم يوفر الكثافات البصرية. ويمكن بعد ذلك رسم الجرعات على الفيلم على قياس صافي الكثافة البصرية المقابلة (الفرق في الكثافة البصرية بعد التعرض وقبله). ينتج هذا منحنى معايرة الفيلم. عندما نغير الاجهزة التجريبية، يمكن أن يتغير معدل الجرعة في هذه الحالة، لأن معدل الجرعة يعتمد على حجم الحقل وعمقه والمواد التي يتم إشعاعها. يعرض الفيلم مع الإعداد التجريبية يوفر لنا كثافة بصرية صافية، وباستخدام منحنى معايرة الفيلم، يمكننا بعد ذلك تحديد الجرعة المقابلة. تقسيم هذه الجرعة بحلول الوقت الذي تم فيه إشعاع الفيلم، نحصل على معدل الجرعة. ويمكن بعد ذلك استخدام معدل الجرعة هذا لحساب وقت التعرض لتقديم الجرعة المطلوبة للإعداد التجريبي المعطى. البروتوكول الموصوف أعلاه يعالج العديد من الفروق الدقيقة المرتبطة قياس الجرعات الفيلم. على سبيل المثال، بعد التعرض، يتطلب الفيلم حوالي 24 ساعة لتفاعلات المواد الكيميائية في الطبقة النشطة للفيلم لتكون كاملة تقريبا. عدم انتظار هذا القدر من الوقت سيؤدي إلى انخفاض الكثافة البصرية.

لأي دراسة أن يكون قياس الجرعات استنساخها من المهم أن نعرف ونفهم العديد من العناصر الرئيسية للإشعاع معين. على وجه الخصوص، من المهم أن نعرف والتفصيل للباحثين الآخرين في صنع ونموذج من المشعع المستخدمة، نوع المصدر (الأشعة السينية، المشعة، الخ)، والطاقة، طبقة نصف القيمة، حجم الحقل، المصدر إلى السطح والمصدر إلى مسافات isocenter، حجم المواد المشعة، التوهين قبل و backscatter بعد المواد المشععة، معدل الجرعة الخاصة بالتجربة، مخطط التجزئة، معدات قياس الجرعات المستخدمة بالضبط، وبروتوكول قياس الجرعات المستخدمة. كل هذه النقاط من المعلومات هي ما يصف بشكل متماسك نوعية شعاع من المشعع معين قبل تقديم جرعة إلى أي أو خلية¹⁹. وثمة نقطة أخرى ذات صلة بالمعلومات من هذا البروتوكول وغيره هي أن معدل الجرعة المحقق في البروتوكول 1 هو مجرد ناتج المشعع المستخدم. بالنسبة لأي تجربة معينة من المهم تحديد معدل الجرعة لهذا الإعداد المحدد(البروتوكول 4) بالمقارنة مع منحنى معايرة الفيلم المشع المولد(البروتوكول 2).

التجريب في المختبر يوفر تفاصيل هامة حول السلوك الإشعاعي من خطوط الخلايا السرطانية. في المختبر clonogenic الخلية البقاء على قيد الحياة المقايسة بدقة تقدير كمي والحساسية الراديوية المتأصلة في خط الخلية²⁰، والمساعدة في تصميم جداول تجزئة في التجارب الحيوانية الخلوية أو الصغيرة اللاحقة²¹. على وجه التحديد، هذه المقايسة القيم التقريبية للمعلمات α β التي تستخدم في النموذج الخطي التربيعي للتنبؤ موت الخلايا استجابة للعلاج الإشعاعي وفقا للمعادلة:

(المعادلة 9)

حيث SF هو الجزء الباقي من الخلايا القابلة للحياة clonogenically، D هو جرعة الإشعاع في Gy، α β هي المعلمات المجهزة²². وتوفر نسبة α/β مقياساً متأصلاً للحساسية الراديوية الخلوية، مع وجود قيم أعلى ترتبط بزيادة حساسية خط الخلية^22. ولأن هذه العلاقة الوظيفية غير خطية فيما يتعلق بالجرعة، فإن الآثار البيولوجية لمخطط تجزئة العلاج الإشعاعي لا ترتبط فقط بمجموع الجرعة التي تم تسليمها ولكن أيضاً بعدد وحجم الكسور^23. الجرعة البيولوجية الفعالة (BED) هو مقياس للجرعة البيولوجية الحقيقية التي سلمت إلى الأنسجة ويسمح المقارنة المباشرة لمختلف مخططات كسور^24,25. تتطلب معادلة BED تقديرًا α/β فقط، ويتم عرضها أدناه:

(المعادلة 14)

حيث n هو عدد من الكسور من الجرعة D. كلونوجينيك الخلية تقييم α/β وتسهيل المقارنة المباشرة بين مخططات تجزئة العلاج الإشعاعي عبر معادلة BED. ويمكن استخلاص استنتاجات غير صحيحة بشأن استجابة منديل أو جهاز للعلاج الإشعاعي (أو مجموعات من العلاج الإشعاعي مع طرائق أخرى) إذا كان برنامج علاج الإيدز في مجموعات العلاج غير منصف داخل التجارب أو فيما بينها. على سبيل المثال، 2 كسور من 10 GY مقارنة مع 4 كسور من 5 Gy لا تعطي نفس السرير، وبالتالي لا يمكن مقارنة هذه المخططات الزبيدات مباشرة من حيث الاستجابة البيولوجية. معادلة BED، في حين أن ناقصة بسبب القيود الكامنة في النموذج الخطي التربيعي، تقديرات موثوق بها الآثار العادلة لمجموعة واسعة من ظروف العلاج^{التجريبية 24،25}.

ومن الواضح أن مقايسات بقاء الخلايا ال Clonogenic تلعب دورا هاما في دراسة آثار العلاج الإشعاعي في نماذج السرطان، ولكن التجريب في المختبر يقدم عددا من الخيارات الإضافية لمواصلة استكشاف التفاصيل الميكانيكية لعلم الأحياء الإشعاعية الخلايا السرطانية. واستخدمت تعديلات بسيطة من الخلية كلونوجينيك البقاء على قيد الحياة فحص لتحديد أساليب العمل لبعض العلاج الكيميائي تحسس الراديو، مثل paclitaxel أو etoposide^26،27. وتشمل كذلك في المختبر الخيارات التجريبية دراسات الكيمياء المناعية لدراسة مسارات إصلاح الخلوية محددة، مثل γ-H2AX بؤر و / أو 53BP1 تلطيخ لإصلاح كسر الحمض النووي مزدوجة تقطعت بهم السبل²⁸. قد تكون هذه التجارب ذات أهمية خاصة عند مقارنة العلاج الإشعاعي كطرجة واحدة مع العلاجات المركبة ، خاصة عند البحث عن تفاصيل ميكانيكية لخط خلية معين. وتشمل الخيارات التجريبية الأخرى قياسات السيتوكين لفحص الدور الفطري لاستجابة الخلية الالتهابية للإشعاع أو تحليل طريقة موت الخلايا (أي، موت الخلايا، نخر، كارثة ميتوسي، الخ) في ظل ظروف علاجية مختلفة^29،30،31. يمكن لهذا النوع من التجارب أن يكمل أو يحل محل التجارب على الحيوانات ويوفر فهماً أكثر اكتمالاً لعلم الأحياء الإشعاعية لخط الخلايا السرطانية. بغض النظر عن اختيار تجارب إضافية لإجراء، معيار كلونوجينيك الخلية البقاء على قيد الحياة على النحو المبين في البروتوكول 3 هو تقييم لاسلكية أولية هامة لخط الخلية.

توفر المعايرات clonogenic وقياس الجرعات الإشعاعية للباحث وسيلة للتخطيط الدقيق للتجارب لتشبه بشكل مباشر السيناريوهات السريرية. مع إضافة نماذج القوارض السرطانية قبل الظهرية الصغيرة ، من الممكن دراسة الاستجابة للإشعاع وحده أو في سياق خطة العلاج في الجسم الحي. قبل استخدام الحيوانات، من المهم تحديد الناتج الجرعة النسبية من الإعداد المحدد إذا كان يختلف عن الإعداد المستخدمة لتحديد الجرعة^{الناتجة 32،33}. عندما يتعلق الأمر بتحديد معدل جرعة لأحجام الحقل من < 10 ملم، واستخدام غرفة التأين يصبح أقل دقة بسبب المحاذاة داخل حقل صغير وحجم جزئي متوسط التأثيرات³³. وقد استخدم استخدام فيلم radiochromic لتحديد الانتاج في تركيبة مع التجارب المناعية في الجسم الحي لتحديد الناتج وترسب الجرعة في الماضي^{16,34,35,36,37,38}.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid, glacial	Sigma-Aldrich	A6283	This or comparable glacial acetic acid products are acceptable.
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C6158	This or comparable crystal violet products are acceptable.
Digital Baraometer	Fisher Scientific	14-650-118	For pressure and temperature measurements.
Electrometer	Standard Imaging	CDX 2000B	Calibrated by an ADCL; Need correction factor, Pelec
Film	Gafchromic	EBT3 Film	Comes in sheets of 25; calibration films and experimental films must come from same set
Ionization Chamber	Farmer	PTW TN30013	Calibrated by an ADCL @ two calibration points
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	This or comparable methanol products are acceptable.
Photo Scanner	Epson	Perfection V700	Equivalent scanners are V800, V10000, V11000, V12000
XenX	Xstrahl	NA	Irradiator used.