تحضير شرائح الدماغ الحادة من القطب الظهري للحصين من القوارض البالغة

Summary

الغرض من هذا البروتوكول هو وصف طريقة لإنتاج شرائح من الحصين الظهري للفحص الفيزيولوجي الكهربي. يستخدم هذا الإجراء التروية باستخدام ACSF المبرد قبل تحضير الشريحة بزاوية تقطيع قريبة من الإكلية مما يسمح بالحفاظ على الخلايا العصبية الرئيسية السليمة.

Abstract

تعد تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة من شرائح دماغ القوارض الحادة الدعامة الأساسية للأبحاث الفيزيولوجية العصبية الحديثة ، مما يسمح بالقياس الدقيق للخصائص الخلوية والمشبكية. ومع ذلك ، هناك حاجة متزايدة لإجراء تحليلات مترابطة بين الأنماط التجريبية المختلفة بالإضافة إلى الفيزيولوجيا الكهربية للشرائح ، على سبيل المثال: الكيمياء المناعية ، البيولوجيا الجزيئية ، التصوير في الجسم الحي أو التسجيل الفيزيولوجي الكهربي. للإجابة على الأسئلة المعقدة من أي وقت مضى عن وظائف الدماغ. ومع ذلك ، فإن التوصل إلى استنتاجات ذات مغزى من هذه الأساليب التجريبية المختلفة ليس بالأمر السهل ، لأنه حتى داخل هياكل الدماغ الموصوفة جيدا نسبيا ، توجد درجة عالية من التباين شبه الإقليمي للوظيفة الخلوية. لا يوجد مكان يتمثل فيه هذا بشكل أفضل من CA1 للحصين ، الذي له خصائص ظهرية بطنية محددة جيدا ، بناء على الخصائص الخلوية والجزيئية. ومع ذلك ، فإن العديد من الدراسات المنشورة تفحص أنماط التعبير عن البروتين أو مرتبطة سلوكيا في النشاط في الجسم الحي في المدى الظهري للحصين. وشرح النتائج ميكانيكيا باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية الخلوية من منطقة البنترو الإنسية. هذا مربك أيضا بسبب حقيقة أن العديد من تجارب الفيزيولوجيا الكهربية للشرائح الحادة يتم إجراؤها في الصغيرة ، عندما يتم إجراء أنماط تجريبية أخرى في الأكثر نضجا. لمعالجة هذه المشكلات ، تتضمن هذه الطريقة نضح عبر القلب للقوارض الناضجة (>60 يوما) مع السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي متبوعا بإعداد شرائح إكليلية معدلة بما في ذلك عمود الحاجز للحصين الظهري للتسجيل من الخلايا الهرمية CA1. تؤدي هذه العملية إلى توليد شرائح حادة صحية من الحصين الظهري مما يسمح باستجواب الفيزيولوجيا الكهربية الخلوية القائمة على الشريحة المطابقة للتدابير الأخرى.

Introduction

يمكن القول إن الحصين هو الهيكل الأكثر دراسة جيدا في دماغ الثدييات ، نظرا لحجمه الكبير نسبيا وبنيته الصفيحية البارزة. تورط الحصين في عدد من العمليات السلوكية: التنقل المكاني ، والذاكرة السياقية ، وتشكيل الحلقة. ويرجع ذلك جزئيا إلى السهولة النسبية للوصول إلى الأجزاء الظهرية من الحصين في القوارض لتحليلها في الجسم الحي . في الواقع ، عادة ما تكون خلايا الإخراج الرئيسية أقل من 2 مم من سطح القرص.

في القوارض ، الحصين عبارة عن هيكل كبير نسبيا ، يتكون من غزو الدماغ الممتد من الحاجز الظهري إلى القشرة المخية البطنية. وهي تتألف من 2 مناطق رئيسية: التلفيف المسنن والكورنو الأمونيس (CA); ينقسم الأخير إلى 3 مناطق فرعية موصوفة جيدا (CA1-3) تمتد إلى مسام التلفيف المسنن (المعروف سابقا باسم CA4) ، بناء على الاتصال والتشريح الخلوي والخصائص الجينية¹. يتم الحفاظ على هذا الهيكل على طول المدى الظهري البطني للحصين ، وإن كان ذلك مع اختلافات كبيرة في الخصائص المشبكية^2،3،4 ، والتشريح⁵ ، والتنوع الجيني^6،7،8 ، والوظيفة السلوكية^9،10. من بين مناطق CA ، يتكون الحقل الفرعي CA1 إلى حد كبير من الخلايا الهرمية CA1 الجلوتاماتية (CA1 PCs) ، والتي تم تحديد 3 أنواع فرعية^{لها 11} ، والخلايا العصبية الداخلية المثبطة التي تشكل ~ 10٪ من الخلايا العصبية ، ولكنها متنوعة للغاية مع أكثر من 30 نوعا فرعيا محددا^12،13،14. بالإضافة إلى الاختلافات الإقليمية المحددة ، فقد ثبت أن الشيخوخة الطبيعية لها تأثيرات كبيرة على الانتقال المشبكي^15،16،17 ، والتشريح¹⁸ ، والملف الجيني¹⁹. الطريقة القياسية الذهبية الحالية لتقييم تعقيدات الخصائص الخلوية والمشبكية بطريقة خاضعة للرقابة هي من خلال استخدام تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة من شرائح الدماغ الحادة²⁰.

يعتمد فهم وظيفة الحصين إلى حد كبير على التلاعب الظهري نظرا لسهولة الوصول إليها جراحيا أو تشريحيا للمهام السلوكية ، أو زرع أقطاب كهربائية أو نوافذ تصوير ، أو تعبير البلازميد الفيروسي. في العديد من الدراسات بالإضافة إلى ذلك ، يتم تنفيذ هذه الإجراءات مع القوارض المتأخرة أو البالغة لمنع التباين في بنية الدماغ أثناء النمو. على الرغم من ذلك ، يتم تنفيذ العديد من الأساليب لفحص الفيزيولوجيا الكهربية الخلوية وتحت الخلوية في القوارض المبكرة إلى المتوسطة ، من الجزء البطني الإنسي في الغالب من الحصين في مستواه المستعرض^{21،22،23،24،25}. عندما يتم تقييم المدى الظهري البطني بالكامل ، يتم استخدام مفرمة الأنسجة للحفاظ على المدى العرضي^4،26 ، أو تم إجراء التجربة في الفئران الصغيرة²⁷ أو الفئران²⁸. علاوة على ذلك ، من المعروف أن تبريد الأنسجة قبل تشريح الدماغ يحافظ على بنية الحصين في الفئران²⁹ والخلايا العصبية القشرية الحديثة في الفئران^30،31. ومع ذلك ، هناك ندرة في التفاصيل فيما يتعلق بإنتاج شرائح الدماغ من المحور العرضي الظهري للحصين ، كما تم إنشاؤه بواسطة الشرائح الإكليلية المعدلة ، في الفئران الناضجة.

يصف هذا البروتوكول نهجا يمكن من خلاله الحصول على تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة من الخلايا العصبية المفردة أو الأزواج في شرائح إكليلية معدلة من الحصين الظهري من الفئران المسنة ، متبوعا بتحديد مورفولوجي لاحق. يتم الحصول على شرائح الدماغ السليمة بعد التروية عبر القلب للسائل الدماغي النخاعي الاصطناعي المبرد (ACSF) ، مما يسهل قياس الخصائص الفيزيولوجية الكهربية من أجهزة الكمبيوتر CA1 والخلايا العصبية الداخلية المحلية.

Protocol

تم توليد جميع وصيانتها وفقا لإرشادات وزارة الداخلية والمؤسسات (HO # P135148E). تم الحفاظ على جميع الفئران في دورة ضوئية / مظلمة مدتها 12 ساعة وتم منحها إمكانية الوصول إلى الغذاء والماء.

1. نضح عبر القلب من ACSF المبرد

1. قبل جميع التجارب ، ضع ~ 200 مل من السكروز ACSF (الجدول 1) في الفريزر عند -20 درجة مئوية (حتى شبه مجمدة ، للتقطيع) و ~ 100-200 مل أخرى من السكروز المصفى ACSF على الجليد (للنضح) ، فقاعات مع الكربوجين (95٪ O₂/5٪ CO₂).
2. اجمع فأرا بالغا من قفص منزله وضعه لمدة ~ 30 دقيقة في قفص احتجاز في غرفة العمليات للتأقلم مع مستويات الضوضاء والضوء.
3. تحضير أدوات التشريح (الشكل 1 أ) ومنطقة التروية والمخدر عن طريق الحقن (حوالي 1 مل من 200 ملغم/مل بنتوباربيتال الصوديوم للتركيز النهائي 100 ملغم/كغ).
4. قم بإعداد غرفة تخدير مناسبة عن طريق وضع مسحة صغيرة من المناديل الورقية أو الصوف القطني بالداخل. أدخل 1-2 مل من مخدر الأيزوفلوران المتطاير إلى المادة الماصة في الغرفة.
5. ضع الجرذ في غرفة التخدير للتخدير. راقب التنفس حتى ينخفض معدل التنفس إلى ~ 1 نفس ضحل في الثانية.
6. في هذه المرحلة ، ابدأ في غلي السكروز شبه المجمد ACSF مع الكربوجين على الثلج لاستخدامه أثناء التقطيع.
7. قم بوزن الجرذ ولاحظ وزنه.
8. تخدير الفئران بشكل نهائي عن طريق حقن البنتوباربيتال الصوديوم المحضر في التجويف داخل الصفاق. يجب أن تكون جرعة البنتوباربيتال الصوديوم 100 مجم / كجم ، محسوبة من الوزن المأخوذ مسبقا وتركيز مخزون الدواء. ضع الجرذ في غرفة احتجاز واترك 0.5-5 دقائق لبدء التخدير النهائي.
9. تأكيد توقف ردود الفعل: اختبر كل من وميض القرنية (المس التلميذ) وقرص المخلب الخلفي (رفع الساق والضغط على المخلب الخلفي) باستخدام مسبار حاد (أي ملقط مستدير). بمجرد توقف ردود الفعل ، قم بتثبيت الجرذ على اللوح الجراحي للبوليسترين أو الفلين باستخدام إبر تحت الجلد.
10. افتح تجويف الصدر وضع القنية في قاعدة البطين الأيسر للقلب. ثقب الأذين الأيمن وابدأ على الفور بالتروية باستخدام السكروز المثلج البارد (0-1 درجة مئوية) ACSF (باستخدام مضخة تمعجية عند 50 مل / دقيقة).
11. بمجرد حدوث التبادل الكامل للسوائل وتبريد الجسم (<5 دقائق) ، قم بإزالة القنية والدبابيس ، ثم قطع الرأس باستخدام المقصلة.
12. قم بإزالة الجمجمة بعناية وسرعة باستخدام مقص العظام وأدوات عظام Rongeur (الشكل 1أ ، 1 ب).
    1. ابدأ بعمل شق ثنائي 2x من خلال الثقبة ماغنوم باستخدام مقص العظام وقم بإزالة الجمجمة إلى خياطة لامدا باستخدام Rongeurs. قص بعناية على طول خياطة خط الوسط باستخدام مقص العظام خلف العينين مباشرة.
    2. قم بعمل 2x قطع ثنائية عبر الجمجمة ، عموديا على خط الوسط. باستخدام Rongeurs ، افتح الجمجمة على طول خط الوسط. توخي الحذر الشديد لإزالة الأم باستخدام مقص دقيق أو إبرة معقوفة.
13. اخرج الدماغ من الجمجمة باستخدام ملعقة حادة ، وقطع الأعصاب القحفية والبصرية بضغط من جانب إلى آخر. ضع الدماغ في السكروز المكربوجين وشبه المجمد (0-1 درجة مئوية) لمدة 1-2 دقيقة قبل التقطيع.

2. تحضير شرائح الدماغ من الحصين الظهري

1. قم بإزالة الدماغ المنفوخ من السكروز شبه المجمد (0-1 درجة مئوية) ووضعه في طبق بتري زجاجي مبطن بورق الترشيح. ضع الدماغ على سطحه البطني.
2. باستخدام مشرط (شفرة رقم 22) ، قم بإزالة الجزء الخلفي من الدماغ عند ~ 10 درجة من الوضع الرأسي لإنشاء سطح مستو للصق الدماغ على المسرح (الشكل 1 ج).
3. ضع كمية صغيرة من غراء سيانواكريليت على مرحلة الاهتزاز. انشر الغراء لعمل طبقة رقيقة أكبر بنسبة 50٪ تقريبا من مساحة المقطع العرضي لسطح الدماغ المقطوع.
4. ارفع الدماغ من الطبق الزجاجي على ملعقة ، واقطع الجانب لأسفل ، باستخدام فرشاة رسم لتوجيه الأنسجة. امسح الدماغ بقطعة من الأنسجة لإزالة ACSF الزائد وحرك الدماغ ، وقطع السطح لأسفل ، على مركز الغراء. باستخدام ماصة باستور ، أضف 1-2 مل من السكروز المثلج ACSF فوق الدماغ لإزالة الغراء بعيدا عن كتلة الدماغ.
5. ضع الدماغ في غرفة التقطيع وغمره بالسكروز شبه المجمد ACSF. استخدم ملعقة أو ملعقة لإبعاد الثلج الزائد عن كتلة الدماغ ، ثم الكربوجين (الشكل 1 د).
6. حرك شفرة الاهتزاز إلى موضعها: ~ 1 مم من السطح الظهري للدماغ وعموديا ~ 1 مم أمام البريجما. تأكد من غمر الشفرة بالكامل ، وقم بإزالة الفقاعات باستخدام فرشاة الرسم.
7. ابدأ في تقطيع الدماغ. للتقليم إلى الحصين الظهري ، استخدم سرعة 0.1-0.2 مم / ثانية ، مع حركة شفرة أفقية من 1-1.5 مم ومعدل تذبذب متبادل ~ 90 هرتز. عند تقطيع الحصين الظهري ، قلل السرعة إلى 0.05-0.1 مم / ثانية.
8. اجمع شرائح الحصين الظهري (اسميا 3-4 شرائح كاملة أو 6-8 شرائح نصف مقطوعة) لكل دماغ. إذا كانت هناك حاجة إلى شرائح طولية من الحصين البطني الإنسي ، فاستمر في التقطيع. بمجرد تقطيع الحصين الظهري ، ليست هناك حاجة لقطع أنسجة إضافية تتجاوز^{موضع البطين} الثالث تقريبا. أوقف الاهتزاز ، وافصل الشريحة بإبرة تحت الجلد مثنية ، واجمعها في قاعدة غرفة التقطيع.
   ملاحظة: يمكن أن يتراوح سمك الشرائح بين 250 و 500 ميكرومتر ، اعتمادا على المتطلبات التجريبية. بالنسبة للتسجيلات من الحصين الظهري ، عادة ما تستخدم شرائح بسمك 400 ميكرومتر للحفاظ على أكبر قدر ممكن من الشبكة المحلية ، مع السماح بظروف الفحص المجهري المناسبة.
9. قم بقص الشرائح لتحتوي فقط على الحصين والقشرة المغطى تحت مجهر تشريح. انقل الشرائح إلى حجرة 35 درجة مئوية الدافئة مسبقا بحيث يكون السطح الأمامي متجها لأعلى.
10. تحديد غرفة التخزين بناء على التجربة المراد إجراؤها. للحصول على تسجيلات عالية الجودة لمشبك التصحيح أو خارج الخلية بالقرب من سطح الشريحة في غرف التسجيل المغمورة ، قم بتخزينها في غرف مغمورة. بدلا من ذلك ، قم بتخزينها في غرفة واجهة سائلة / غاز لتسجيلات نشاط الشبكة التذبذبية أو تسجيلات مجال الواجهة خارج الخلية.
11. بالنسبة لظروف التخزين المغمورة ، اسمح للشرائح بالتعافي عند 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة من وقت دخول آخر شريحة إلى غرفة التخزين. هذا يسمح بإعادة تنشيط عمليات التمثيل الغذائي وإعادة ختم الأعصاب المقطوعة. بعد 30 دقيقة ، انقل غرفة التخزين إلى درجة حرارة الغرفة.

3. تسجيل الخلايا العصبية الحصين الظهرية

1. تصنيع ماصات تصحيح التسجيل من الزجاج الشعري. يستخدم هذا البروتوكول قطرا خارجيا 1.5 مم ، وزجاج البورسليكات بقطر داخلي 0.86 مم مع خيوط ، مما ينتج عنه مقاومة طرف تتراوح من 3 إلى 5 MΩ عند ملئه بمحلول داخل الخلايا (الجدول 1). احتفظ بالمحاليل داخل الخلايا مبردة على الثلج لمنع تدهور المكونات النشطة وتصفيتها قبل الاستخدام (مرشح الحقنة ، حجم المسام: 0.2 ميكرومتر).
2. تسجيل الكربوجينات ACSF والتسخين المسبق في حمام مائي (35-40 درجة مئوية). قم بتوصيل ACSF المكربن والدافئ مسبقا إلى غرفة التسجيل عبر أنبوب التروية بمساعدة مضخة تمعجية. ابدأ التروية قبل عدة دقائق من نقل الشريحة إلى الغرفة.
3. أوقف التروية وانقل شريحة دماغية إلى غرفة التسجيل بحيث يكون السطح الأمامي متجها لأعلى. ثبت الشريحة في مكانها بحلقة بلاتينية مع ألياف مفردة من الحرير متصلة لتشكيل شكل "القيثارة". ضع الشرائح بحيث تعمل الطبقة الهرمية من CA1 بشكل عمودي على محور ماصة التسجيل الأولى.
4. أعد تشغيل تدفق تسجيل ACSF المكربوجيني والدافئ مسبقا (35-40 درجة مئوية) (الجدول 1) بالمعدل الأمثل 6-8 مل في الدقيقة ^-1.
   ملاحظة: معدلات التدفق العالية (6-8 مل∙ ^دقيقة-1) هي الأمثل للحفاظ على نشاط الشبكة في الشرائح³². يمكن استخدام معدلات التدفق المنخفضة (أي 2-3 مل ∙ دقيقة ^-1) للحفاظ على استقرار الشريحة لتجارب التصوير أو عندما لا يكون نشاط الشبكة ذي الصلة بيولوجيا مطلوبا.
5. تقييم جودة الشريحة باستخدام بصريات تباين الاستدلال التفاضلي بالأشعة تحت الحمراء (IR-DIC) مع تكبير موضوعي 40x (يتم تصورها بكاميرا CCD). افترض جودة شريحة جيدة إذا كان من الممكن رؤية عدد كبير من أجهزة كمبيوتر CA1 ذات الشكل البيضاوي والتباين المعتدل في شارع الهرمي على أعماق 20-30 ميكرومتر تحت سطح أملس ومدمل قليلا (الشكل 2 أ). تحتوي الشرائح ذات الجودة الرديئة على أعداد كبيرة من الخلايا شديدة التباين أو المنكمش أو المنتفخة ، مع سطح شريحة غير مستو.
6. املأ الماصات اللاصقة بمحلول داخل الخلايا (على سبيل المثال، بناء على [Cl^-] داخل الخلايا يبلغ 24 ملليمتر) للسماح بالمقارنة مع البيانات المنشورة الأخرى.
7. قم بإجراء تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة كما هو موضح^{سابقا 22}. استبعاد الخلايا من التحليل إذا كانت إمكانات الغشاء (V_M) عند الاختراق أكثر استقطابا من -50 مللي فولت ، فإن مقاومة السلسلة هي >30 MΩ ؛ أو تتغير مقاومة السلسلة بنسبة >20٪ على مدار التسجيل. في ظل ظروف التسجيل هذه ، تكون مقاومة السلسلة عادة في حدود 8 - 25 MΩ ومستقرة لمدة تصل إلى ساعة واحدة.
8. لفحص الاستثارة الجوهرية CA1 من الحصين الظهري ، اختبر الخصائص الفسيولوجية الجوهرية مع تسجيلات الخلية الكاملة باستخدام البروتوكولات التالية في تكوين المشبك الحالي:
   1. من إمكانات غشاء الراحة مع عدم تطبيق تيار التحيز ، قم بتطبيق خطوات حالية صغيرة (-10 باسكال ، 500 مللي ثانية) تتكرر 30 مرة.
   2. من -70 مللي فولت مع تطبيق تيار التحيز ، قم بتطبيق فرط على خطوات التيار لإزالة الاستقطاب لمدة 500 مللي ثانية (-100 إلى +400 باسكال ، 25 خطوة باسكال) مع 3 تكرارات لعائلة من الآثار.
   3. قم بتطبيق موجة جيبية تبلغ 100 pA من الذروة إلى الذروة ، بتردد متغير من 0.1 إلى 20 هرتز. كرر 3 مرات.
   4. قم بتطبيق محفزات 5x 2 nA و 2 مللي ثانية لدفع إمكانات الفعل عند 20 ، 40 ، 60 ، 80 ، 100 هرتز.
   5. من مشبك جهد -70 مللي فولت ، قم بتطبيق 5 دقائق من التيارات المثيرة التلقائية بعد المشبكي (EPSC) للتسجيل.
9. لإعادة إغلاق الخلايا للتحليل النسيجي بعد التسجيل الناجح ، قم بإنتاج بقع خارجية للخارج عن طريق سحب ماصة التصحيح ببطء. عند ملاحظة زيادة في مقاومة السلسلة من المستويات التجريبية إلى >1 GΩ كما تم قياسها بواسطة نبضة اختبار -5 مللي فولت، ارفع إمكانات الاحتجاز إلى -40 مللي فولت وسحب الماصة بالكامل.
10. قم بإجراء تسجيلات إضافية في نفس الشريحة لتلبية القوة الإحصائية المطلوبة للتصميم التجريبي.
11. قم بإزالة شرائح الدماغ التي تحتوي على خلايا عصبية مسجلة من غرفة التسجيل ، وضعها في طبق مكون من 24 بئرا ، واستبدل ACSF بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد (في محلول فوسفات 0.1 M) واتركه طوال الليل.
12. في اليوم التالي ، استبدل PFA بمخزن فوسفات 0.1 M وقم بتخزينه حتى المعالجة النسيجية. تصور الخلايا التي تحتوي على الستربتافيدين المترافق بالفلورسنت كما هو موضح^{سابقا 22}.

النتائج

يسمح البروتوكول الموصوف أعلاه بإعداد شرائح قابلة للحياة من عمود الحاجز للحصين الظهري في الفئران الناضجة. العامل الرئيسي في هذا البروتوكول هو نضح السكروز المبرد ACSF ، قبل تحضير الشريحة ، مما ينتج عنه أجهزة كمبيوتر CA1 صحية قريبة من سطح الشريحة. يتم تقييم جودة الشريحة المنت?...

Discussion

هنا ، يتم وصف بروتوكول لإنتاج شرائح دماغية عالية الجودة من المدى الظهري ل CA1 للحصين ، مما يسمح بالتسجيلات من خلايا عصبية متعددة قابلة للحياة داخل هذه المنطقة. يعد النهج الاندماجي لتسجيل الخلية بأكملها من الشرائح القريبة من الإكليل متبوعا بتصور الخلايا العصبية أمرا بالغ ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acquisition software	Molecular Devices	pClamp 10
Adult rats	Various	n/a	Any strain of adult rat (60 days and older)
Amplifier	Molecular Devices	Axopatch 700B
Analysis software	Freeware	Stimfit	https://github.com/neurodroid/stimfit
Bone Scissors	FST	16152-12	Littauer style
Capillary Glass	Harvard Apparatus	30-0060	Borosilicate glass pipettes with filament 1.5 mm outer diameter, 0.86 mm inner diameter.
Carbogen	BOC	Various	95% O2/5% CO2
CCD camera	Scientifica	SciCamPro	https://www.scientifica.uk.com/products/
Chemicals/Reagents	Sigma Aldrich	Various	All laboratory reagents procured from Sigma Aldrich.
Cyanoacrylate (i.e. RS Pro 3)	RS Components	918-6872	Avoid gel based cyanoacrylate formulations
Digitizer	Molecular Devices	Digidata 1550B
Dissection pins/needles	Various	Various	Use 16 gauge needles (above)
Electrophysiology system	Scientifica	SliceScope	https://www.scientifica.uk.com/products/ scientifica-slicescope
Fine iris scissors	FST	14568-12	With Tungsten-Carbide tips
Glass Petri dish	Fisher Scientific	12911408
Hypodermic needles	BD Healthcare	Various	16, 18, and 22 gauge
Isofluorane 100% W/W (i.e.IsoFlo)	Zoetis	50019100
Mayo-type scissors	FST	14110-17	Blunt tips
Micromanipulators	Scientifica	Microstar	https://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-microstar-micromanipulator
Paintbrush	Art store	n/a	A fine bristled paintbrush, procured from a local art shop.
Pasteur pipette	Fisher Scientific	11546963	A glass Pasteur pipette, but cut so that the blunt end is used to transfer pipette.
Peristaltic pump	Watson Marlow	12466260	Single channel peristaltic pump
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97	Other models and methods of pipette production would work equally well.
Plastic syringes (1, 2, 5 mL)	BD Healthcare	Various
Rongeur bone tool	FST	16021-14
Slice holding chamber	Homemade
Slice weight/harp	Harvard Apparatus	SHD-22L/15	Alternatives would be suitable.
Sodium Pentobarbital (i.e. Pentoject)	Animalcare Ltd	10347/4014	200 mg/mL; other formulations of pentobarbital would be suitable
Spatula	Bochem	3213	Available from Fisher Scientific
Syringe filters	Fisher Scientific	10482012	Corning brand syringe filters, 0.22 µm pore diameter.
Vibtratome	Leica	1491200S001	VT1200S model with Vibrocheck
Water Bath	Fisher Scientific	15167015	5 Litre water bath, for example: Grant Instruments™JBA5 scientifica-scicam-pro