A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
الغرض من هذا البروتوكول هو وصف طريقة لإنتاج شرائح من الحصين الظهري للفحص الفيزيولوجي الكهربي. يستخدم هذا الإجراء التروية باستخدام ACSF المبرد قبل تحضير الشريحة بزاوية تقطيع قريبة من الإكلية مما يسمح بالحفاظ على الخلايا العصبية الرئيسية السليمة.
تعد تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة من شرائح دماغ القوارض الحادة الدعامة الأساسية للأبحاث الفيزيولوجية العصبية الحديثة ، مما يسمح بالقياس الدقيق للخصائص الخلوية والمشبكية. ومع ذلك ، هناك حاجة متزايدة لإجراء تحليلات مترابطة بين الأنماط التجريبية المختلفة بالإضافة إلى الفيزيولوجيا الكهربية للشرائح ، على سبيل المثال: الكيمياء المناعية ، البيولوجيا الجزيئية ، التصوير في الجسم الحي أو التسجيل الفيزيولوجي الكهربي. للإجابة على الأسئلة المعقدة من أي وقت مضى عن وظائف الدماغ. ومع ذلك ، فإن التوصل إلى استنتاجات ذات مغزى من هذه الأساليب التجريبية المختلفة ليس بالأمر السهل ، لأنه حتى داخل هياكل الدماغ الموصوفة جيدا نسبيا ، توجد درجة عالية من التباين شبه الإقليمي للوظيفة الخلوية. لا يوجد مكان يتمثل فيه هذا بشكل أفضل من CA1 للحصين ، الذي له خصائص ظهرية بطنية محددة جيدا ، بناء على الخصائص الخلوية والجزيئية. ومع ذلك ، فإن العديد من الدراسات المنشورة تفحص أنماط التعبير عن البروتين أو مرتبطة سلوكيا في النشاط في الجسم الحي في المدى الظهري للحصين. وشرح النتائج ميكانيكيا باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية الخلوية من منطقة البنترو الإنسية. هذا مربك أيضا بسبب حقيقة أن العديد من تجارب الفيزيولوجيا الكهربية للشرائح الحادة يتم إجراؤها في الصغيرة ، عندما يتم إجراء أنماط تجريبية أخرى في الأكثر نضجا. لمعالجة هذه المشكلات ، تتضمن هذه الطريقة نضح عبر القلب للقوارض الناضجة (>60 يوما) مع السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي متبوعا بإعداد شرائح إكليلية معدلة بما في ذلك عمود الحاجز للحصين الظهري للتسجيل من الخلايا الهرمية CA1. تؤدي هذه العملية إلى توليد شرائح حادة صحية من الحصين الظهري مما يسمح باستجواب الفيزيولوجيا الكهربية الخلوية القائمة على الشريحة المطابقة للتدابير الأخرى.
يمكن القول إن الحصين هو الهيكل الأكثر دراسة جيدا في دماغ الثدييات ، نظرا لحجمه الكبير نسبيا وبنيته الصفيحية البارزة. تورط الحصين في عدد من العمليات السلوكية: التنقل المكاني ، والذاكرة السياقية ، وتشكيل الحلقة. ويرجع ذلك جزئيا إلى السهولة النسبية للوصول إلى الأجزاء الظهرية من الحصين في القوارض لتحليلها في الجسم الحي . في الواقع ، عادة ما تكون خلايا الإخراج الرئيسية أقل من 2 مم من سطح القرص.
في القوارض ، الحصين عبارة عن هيكل كبير نسبيا ، يتكون من غزو الدماغ الممتد من الحاجز الظهري إلى القشرة المخية البطنية. وهي تتألف من 2 مناطق رئيسية: التلفيف المسنن والكورنو الأمونيس (CA); ينقسم الأخير إلى 3 مناطق فرعية موصوفة جيدا (CA1-3) تمتد إلى مسام التلفيف المسنن (المعروف سابقا باسم CA4) ، بناء على الاتصال والتشريح الخلوي والخصائص الجينية1. يتم الحفاظ على هذا الهيكل على طول المدى الظهري البطني للحصين ، وإن كان ذلك مع اختلافات كبيرة في الخصائص المشبكية2،3،4 ، والتشريح5 ، والتنوع الجيني6،7،8 ، والوظيفة السلوكية9،10. من بين مناطق CA ، يتكون الحقل الفرعي CA1 إلى حد كبير من الخلايا الهرمية CA1 الجلوتاماتية (CA1 PCs) ، والتي تم تحديد 3 أنواع فرعيةلها 11 ، والخلايا العصبية الداخلية المثبطة التي تشكل ~ 10٪ من الخلايا العصبية ، ولكنها متنوعة للغاية مع أكثر من 30 نوعا فرعيا محددا12،13،14. بالإضافة إلى الاختلافات الإقليمية المحددة ، فقد ثبت أن الشيخوخة الطبيعية لها تأثيرات كبيرة على الانتقال المشبكي15،16،17 ، والتشريح18 ، والملف الجيني19. الطريقة القياسية الذهبية الحالية لتقييم تعقيدات الخصائص الخلوية والمشبكية بطريقة خاضعة للرقابة هي من خلال استخدام تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة من شرائح الدماغ الحادة20.
يعتمد فهم وظيفة الحصين إلى حد كبير على التلاعب الظهري نظرا لسهولة الوصول إليها جراحيا أو تشريحيا للمهام السلوكية ، أو زرع أقطاب كهربائية أو نوافذ تصوير ، أو تعبير البلازميد الفيروسي. في العديد من الدراسات بالإضافة إلى ذلك ، يتم تنفيذ هذه الإجراءات مع القوارض المتأخرة أو البالغة لمنع التباين في بنية الدماغ أثناء النمو. على الرغم من ذلك ، يتم تنفيذ العديد من الأساليب لفحص الفيزيولوجيا الكهربية الخلوية وتحت الخلوية في القوارض المبكرة إلى المتوسطة ، من الجزء البطني الإنسي في الغالب من الحصين في مستواه المستعرض21،22،23،24،25. عندما يتم تقييم المدى الظهري البطني بالكامل ، يتم استخدام مفرمة الأنسجة للحفاظ على المدى العرضي4،26 ، أو تم إجراء التجربة في الفئران الصغيرة27 أو الفئران28. علاوة على ذلك ، من المعروف أن تبريد الأنسجة قبل تشريح الدماغ يحافظ على بنية الحصين في الفئران29 والخلايا العصبية القشرية الحديثة في الفئران30،31. ومع ذلك ، هناك ندرة في التفاصيل فيما يتعلق بإنتاج شرائح الدماغ من المحور العرضي الظهري للحصين ، كما تم إنشاؤه بواسطة الشرائح الإكليلية المعدلة ، في الفئران الناضجة.
يصف هذا البروتوكول نهجا يمكن من خلاله الحصول على تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة من الخلايا العصبية المفردة أو الأزواج في شرائح إكليلية معدلة من الحصين الظهري من الفئران المسنة ، متبوعا بتحديد مورفولوجي لاحق. يتم الحصول على شرائح الدماغ السليمة بعد التروية عبر القلب للسائل الدماغي النخاعي الاصطناعي المبرد (ACSF) ، مما يسهل قياس الخصائص الفيزيولوجية الكهربية من أجهزة الكمبيوتر CA1 والخلايا العصبية الداخلية المحلية.
تم توليد جميع وصيانتها وفقا لإرشادات وزارة الداخلية والمؤسسات (HO # P135148E). تم الحفاظ على جميع الفئران في دورة ضوئية / مظلمة مدتها 12 ساعة وتم منحها إمكانية الوصول إلى الغذاء والماء.
1. نضح عبر القلب من ACSF المبرد
2. تحضير شرائح الدماغ من الحصين الظهري
3. تسجيل الخلايا العصبية الحصين الظهرية
يسمح البروتوكول الموصوف أعلاه بإعداد شرائح قابلة للحياة من عمود الحاجز للحصين الظهري في الفئران الناضجة. العامل الرئيسي في هذا البروتوكول هو نضح السكروز المبرد ACSF ، قبل تحضير الشريحة ، مما ينتج عنه أجهزة كمبيوتر CA1 صحية قريبة من سطح الشريحة. يتم تقييم جودة الشريحة المنت?...
هنا ، يتم وصف بروتوكول لإنتاج شرائح دماغية عالية الجودة من المدى الظهري ل CA1 للحصين ، مما يسمح بالتسجيلات من خلايا عصبية متعددة قابلة للحياة داخل هذه المنطقة. يعد النهج الاندماجي لتسجيل الخلية بأكملها من الشرائح القريبة من الإكليل متبوعا بتصور الخلايا العصبية أمرا بالغ ...
ويعلن صاحب البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.
يود المؤلف أن يشكر البروفيسور ديفيد جيه إيه ويلي ، والدكتورة إيما بيركنز ، ولورا سيمويس دي أوليفيرا ، والبروفيسور بيتر سي كايند على التعليقات المفيدة حول تحسين المخطوطة والبروتوكول ، ومبادرة سيمونز لتطوير الدماغ لتوفير تكاليف النشر.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acquisition software | Molecular Devices | pClamp 10 | |
Adult rats | Various | n/a | Any strain of adult rat (60 days and older) |
Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 700B | |
Analysis software | Freeware | Stimfit | https://github.com/neurodroid/stimfit |
Bone Scissors | FST | 16152-12 | Littauer style |
Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0060 | Borosilicate glass pipettes with filament 1.5 mm outer diameter, 0.86 mm inner diameter. |
Carbogen | BOC | Various | 95% O2/5% CO2 |
CCD camera | Scientifica | SciCamPro | https://www.scientifica.uk.com/products/ |
Chemicals/Reagents | Sigma Aldrich | Various | All laboratory reagents procured from Sigma Aldrich. |
Cyanoacrylate (i.e. RS Pro 3) | RS Components | 918-6872 | Avoid gel based cyanoacrylate formulations |
Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1550B | |
Dissection pins/needles | Various | Various | Use 16 gauge needles (above) |
Electrophysiology system | Scientifica | SliceScope | https://www.scientifica.uk.com/products/ scientifica-slicescope |
Fine iris scissors | FST | 14568-12 | With Tungsten-Carbide tips |
Glass Petri dish | Fisher Scientific | 12911408 | |
Hypodermic needles | BD Healthcare | Various | 16, 18, and 22 gauge |
Isofluorane 100% W/W (i.e.IsoFlo) | Zoetis | 50019100 | |
Mayo-type scissors | FST | 14110-17 | Blunt tips |
Micromanipulators | Scientifica | Microstar | https://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-microstar-micromanipulator |
Paintbrush | Art store | n/a | A fine bristled paintbrush, procured from a local art shop. |
Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11546963 | A glass Pasteur pipette, but cut so that the blunt end is used to transfer pipette. |
Peristaltic pump | Watson Marlow | 12466260 | Single channel peristaltic pump |
Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Other models and methods of pipette production would work equally well. |
Plastic syringes (1, 2, 5 mL) | BD Healthcare | Various | |
Rongeur bone tool | FST | 16021-14 | |
Slice holding chamber | Homemade | ||
Slice weight/harp | Harvard Apparatus | SHD-22L/15 | Alternatives would be suitable. |
Sodium Pentobarbital (i.e. Pentoject) | Animalcare Ltd | 10347/4014 | 200 mg/mL; other formulations of pentobarbital would be suitable |
Spatula | Bochem | 3213 | Available from Fisher Scientific |
Syringe filters | Fisher Scientific | 10482012 | Corning brand syringe filters, 0.22 µm pore diameter. |
Vibtratome | Leica | 1491200S001 | VT1200S model with Vibrocheck |
Water Bath | Fisher Scientific | 15167015 | 5 Litre water bath, for example: Grant Instruments™JBA5 scientifica-scicam-pro |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved