성체 설치류에서 해마의 등쪽 극에서 급성 뇌 절편 준비

요약

이 프로토콜의 목적은 전기생리학적 검사를 위해 등쪽 해마 절편을 생성하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 절차는 절편 준비 전에 건강한 주요 뉴런을 보존할 수 있도록 관상 절개 각도에 가까운 절편 준비 전에 냉각된 ACSF와 함께 관류를 사용합니다.

초록

급성 설치류 뇌 절편의 전체 세포 패치 클램프 기록은 현대 신경 생리학 연구의 주류이며 세포 및 시냅스 특성을 정확하게 측정할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 슬라이스 전기생리학 외에도 서로 다른 실험 모드 간의 상관 분석을 수행해야 할 필요성이 계속 증가하고 있습니다(예: 면역조직화학, 분자생물학, 생체 내 이미징 또는 전기생리학적 기록). 뇌 기능에 대한 점점 더 복잡한 질문에 답하기 위해. 그러나 이러한 다양한 실험적 접근 방식에서 의미 있는 결론을 내리는 것은 비교적 잘 설명된 뇌 구조 내에서도 세포 기능의 높은 수준의 하위 지역 변이가 존재하기 때문에 간단하지 않습니다. 이것은 해마의 CA1보다 더 잘 예시된 곳은 없는데, 이는 세포 및 분자 특성에 기초하여 잘 정의된 배측-복부 특성을 가지고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 많은 발표된 연구는 해마의 등쪽 범위에서 단백질 발현 패턴 또는 행동적으로 상관된 생체 내 활동을 조사합니다. 그리고 ventro-medial region의 세포 전기생리학을 사용하여 결과를 기계적으로 설명합니다. 이것은 많은 급성 슬라이스 전기 생리학 실험이 어린 동물에서 수행되는 반면 다른 실험 모드는 더 성숙한 동물에서 수행된다는 사실에 의해 더욱 혼란스러워집니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 이 방법은 성숙한(>60일 된 설치류)의 인공 뇌척수액을 심 관통 관류한 후 CA1 피라미드 세포에서 기록하기 위해 등쪽 해마의 중격을 포함한 변형된 관상 절편을 준비합니다. 이 과정은 등쪽 해마의 건강한 급성 절편을 생성하여 다른 측정치와 일치하는 절편 기반 세포 전기생리학적 조사를 가능하게 합니다.

서문

해마(hippocampus)는 포유류의 뇌에서 가장 잘 연구된 구조라고 할 수 있는데, 이는 상대적으로 큰 크기와 두드러진 층류 구조로 인해 가능합니다. 해마는 여러 가지 행동 과정, 즉 공간 탐색, 전후 관계상 기억 및 에피소드 형성과 관련이 있습니다. 이것은 부분적으로는 생체 내 분석을 위해 설치류에서 해마의 등쪽 부분에 대한 접근이 상대적으로 쉽기 때문입니다. 실제로, 주요 출력 셀은 일반적으로 파이얼 표면에서 2mm 미만입니다.

설치류에서 해마는 상대적으로 큰 구조로, 등쪽 중격에서 복부 신피질까지 뻗어있는 텔 렌 팔론의 침습으로 형성됩니다. 그것은 2 개의 주요 영역으로 구성됩니다 : 치상 회랑 (dentate gyrus)과 cornu ammonis (CA); 후자는 연결성, 세포 해부학 및 유전적 특성¹에 따라 치상회(dentate gyrus hilus, 이전에는 CA4로 알려짐)로 확장되는 3개의 잘 설명된 하위 영역(CA1-3)으로 나뉩니다. 이 구조는 시냅스 특성 ^2,3,4, 해부학⁵, 유전적 다양성 ^6,7,8 및 행동 기능 ^9,10에 큰 차이가 있지만 해마의 배측부 범위를 따라 유지됩니다. CA 영역 중 CA1 하위 필드는 주로 글루타메이터성 CA1 피라미드 세포(CA1 PC)로 구성되며, 이에 대해 3개의 하위 유형이 정의되었으며,¹¹과 뉴런의 ~10%를 구성하지만 30개 이상의 하위 유형이 정의된 매우 다양한 억제성 중간뉴런으로 구성됩니다 12,13,14. 지역별 차이 외에도 정상적인 노화는 시냅스 전달 ^15,16,17, 해부학적 구조¹⁸, 유전적 프로필¹⁹에 극적인 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 통제된 방식으로 세포 및 시냅스 특성의 복잡성을 평가하는 현재의 황금 표준 방법은 급성 뇌 절편에서 전체 세포 패치 클램프 기록을 사용하는 것입니다²⁰.

해마 기능에 대한 이해는 주로 등쪽 조작에 기반을 두고 있는데, 이는 행동 작업, 전극 또는 이미징 창의 이식 또는 바이러스 플라스미드 발현을 위해 외과적 또는 해부학적으로 쉽게 접근할 수 있기 때문입니다. 또한 많은 연구에서 이러한 절차는 발달 중 뇌 구조의 변동을 방지하기 위해 청소년 후기 또는 성인 설치류와 함께 수행됩니다. 그럼에도 불구하고 세포 및 세포 내 전기 생리학을 조사하기 위한 많은 접근 방식은 대부분 횡평면에 있는 해마의 복부 내측 부분에서 초기에서 중기 어린 설치류에서 수행됩니다 21,22,23,24,25. 전체 배-복부 범위가 평가된 경우, 횡방향 범위^4,26를 유지하기 위해 조직-절단기를 사용하거나, 어린 쥐27 또는 생쥐²⁸에서 실험을 수행하였다. 또한, 뇌를 해부하기 전에 조직을 냉각시키면 쥐의 경우 해마 구조가 보존되는 것으로 알려져 있으며⁽²⁹), 쥐의 경우 신피질 뉴런(neocortical neuron)을 보존하는 것으로 알려져 있다^30,31. 그럼에도 불구하고, 성숙한 쥐에서 변형된 관상 절편에 의해 생성된 해마의 등쪽 횡축에서 뇌 절편의 생산에 관한 세부 사항은 부족합니다.

이 프로토콜은 늙은 쥐의 등쪽 해마의 변형된 코로나 절편에 있는 단일 또는 쌍의 뉴런에서 전체 세포 패치-클램프 기록을 얻은 다음 사후 형태학적 식별을 수행할 수 있는 접근 방식을 설명합니다. 냉각된 인공 뇌척수액(ACSF)의 경심 관류 후 건강한 뇌 절편을 얻어 CA1 PC 및 국소 중간뉴런의 전기생리학적 특성을 쉽게 측정할 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물은 내무부 및 기관 지침(HO# P135148E)에 따라 생성 및 유지 관리되었습니다. 모든 쥐는 12시간의 명암 주기로 유지되었으며 음식과 물에 대한 임시로 접근할 수 있었습니다.

1. 냉각된 ACSF의 경심 관류

1. 모든 실험에 앞서 ~200mL의 수크로스-ACSF(표 1)를 -20°C(반냉동될 때까지, 슬라이싱을 위해)의 냉동고에 넣고 추가로 ~100-200mL의 여과된 수크로스-ACSF를 얼음(관류용)에 올려 탄수화물(95% O₂/5% CO₂)로 버블링합니다.
2. 집 우리에서 성체 쥐를 모아 소음과 빛 수준에 적응할 수 있도록 시술실의 수용 케이지에 ~30분 동안 두십시오.
3. 해부 도구(그림 1A), 관류 부위 및 주사 가능한 마취제(최종 농도 100mg/kg의 200mg/mL 펜토바르비탈 나트륨 약 1mL)를 준비합니다.
4. 내부에 작은 티슈 페이퍼 또는 면봉을 넣어 적절한 마취실을 준비합니다. 1-2mL의 휘발성 이소플루란 마취제를 챔버의 흡수성 물질에 주입합니다.
5. 쥐를 마취실에 넣어 진정시킵니다. 호흡 속도가 초당 ~1번의 얕은 호흡으로 떨어질 때까지 호흡을 모니터링합니다.
6. 이 시점에서 슬라이스하는 동안 사용하기 위해 얼음에 탄수화물과 함께 반냉동 자당-ACSF를 거품을 일으키기 시작합니다.
7. 쥐의 무게를 잰 다음 무게를 기록하십시오.
8. 제조된 펜토바르비탈나트륨을 복강내강에 주입하여 쥐를 말기 마취합니다. 펜토바르비탈나트륨의 용량은 100mg/kg이어야 하며, 이전에 복용한 약물의 중량 및 재고 농도에서 계산됩니다. 쥐를 홀딩 챔버에 넣고 말기 마취가 시작될 때까지 0.5-5 분 동안 기다립니다.
9. 반사 작용 중단 확인: 뭉툭한 프로브(즉, 둥근 집게)를 사용하여 각막 깜박임(동공을 만짐)과 뒷발 꼬집기(다리를 들어 올리고 뒷발을 꼬집음) 반사를 모두 테스트합니다. 반사 신경이 멈추면 피하 주사 바늘을 사용하여 쥐를 폴리스티렌 또는 코르크 수술 보드에 고정합니다.
10. 흉강을 열고 캐뉼라를 심장의 좌심실 기저부에 놓습니다. 우심방에 구멍을 뚫고 즉시 얼음처럼 차가운(0-1°C) 자당-ACSF로 관류를 시작합니다(50mL/분의 연동 펌프 사용).
11. 체액의 완전한 교환과 신체의 냉각이 발생하면(<5분) 캐뉼라와 핀을 제거한 다음 단두대를 사용하여 참수합니다.
12. 뼈 가위와 Rongeur 뼈 도구를 사용하여 두개골을 신중하고 빠르게 제거합니다(그림 1A, 1B).
    1. 뼈 가위를 사용하여 구멍, 매그넘을 통해 2x 양측 절단으로 시작하고 Rongeurs로 두개골을 람다 봉합사로 제거합니다. 뼈 가위로 정중선 봉합선을 따라 눈 바로 뒤까지 조심스럽게 자릅니다.
    2. 정중선에 수직으로 두개골을 통해 2x 양측 절단을 만듭니다. Rongeurs를 사용하여 정중선을 따라 두개골을 엽니다. 미세한 가위나 갈고리 바늘을 사용하여 피아 마테르를 제거할 때 각별히 주의하십시오.
13. 뭉툭한 주걱을 사용하여 두개골에서 뇌를 퍼내고 좌우 압박으로 두개신경과 시신경을 절단합니다. 자르기 전에 뇌를 발암화된 반냉동(0– 1 °C) 자당-ACSF에 1-2분 동안 넣습니다.

2. 등쪽 해마에서 뇌 절편의 준비

1. 반냉동(0–1 °C) 자당-ACSF에서 관류된 뇌를 제거하고 여과지를 깐 유리 페트리 접시에 넣습니다. 뇌를 복부 표면에 놓습니다.
2. 메스(22번 칼날)를 사용하여 뇌의 뒤쪽 부분을 수직에서 ~10°로 제거하여 뇌를 스테이지에 접착할 수 있는 평평한 표면을 만듭니다(그림 1C).
3. 소량의 시아노아크릴레이트 접착제를 비브라톰의 단계에 바릅니다. 접착제를 펴서 뇌 절단면의 단면적보다 약 50% 더 큰 박막을 만듭니다.
4. 유리 접시에서 뇌를 주걱 위로 들어 올리고, 면이 아래로 향하게 자른 다음 붓을 사용하여 조직을 안내합니다. 조직 조각으로 뇌를 닦아 과도한 ACSF를 제거하고 절단된 표면을 접착제 중앙으로 밀어 넣습니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 얼음처럼 차가운 자당-ACSF 1-2mL를 뇌에 첨가하여 뇌 블록에서 접착제를 제거합니다.
5. 뇌를 슬라이싱 챔버에 넣고 반냉동 자당 ACSF를 주입합니다. 숟가락이나 주걱을 사용하여 여분의 얼음이 뇌 블록에 닿지 않도록 한 다음 발암시킵니다(그림 1D).
6. 비브라톰의 날을 뇌의 등쪽 표면에서 ~1mm, 브레그마 앞쪽에서 수직으로 ~1mm 위치로 이동합니다. 칼날이 완전히 잠겼는지 확인하고 페인트 브러시를 사용하여 거품을 제거합니다.
7. 뇌를 자르기 시작합니다. 등쪽 해마까지 자르려면 0.1-0.2mm/s의 속도를 사용하고 1-1.5mm의 수평 블레이드 움직임과 ~90Hz의 상호 진동 속도를 사용합니다. 등쪽 해마를 자를 때는 속도를 0.05-0.1mm/s로 줄이십시오.
8. 뇌당 등쪽 해마 조각(명목상 3-4개의 전체 조각 또는 6-8개의 반쪽 절편)을 수집합니다. 복부-내측 해마의 세로 절편이 필요한 경우 계속 자릅니다. 등쪽 해마를 절단한 후에는 대략 제^3심실 의 위치 이상으로 추가 조직을 절단할 필요가 없습니다. 비브라톰을 멈추고 구부러진 피하 주사 바늘로 조각을 분리하고 슬라이싱 챔버의 바닥에 모입니다.
   참고: 슬라이스의 두께는 실험 요구 사항에 따라 250-500μm일 수 있습니다. 등쪽 해마에서 기록하는 경우 일반적으로 400μm 두께의 슬라이스를 사용하여 적절한 현미경 검사 조건을 허용하면서 로컬 네트워크를 최대한 보존합니다.
9. 해마 현미경으로 해마와 그 위에 있는 피질만 포함하도록 절단을 잘라냅니다. 예열된 35°C 챔버로 슬라이스를 앞쪽 표면이 위를 향하도록 옮깁니다.
10. 수행할 실험에 따라 보관 챔버를 결정합니다. 수중 기록 챔버에서 슬라이스 표면에 가까운 고품질 전체 세포 패치 클램프 또는 세포 외 필드 기록을 얻으려면 수중 챔버에 보관하십시오. 또는 액체/기체 계면 챔버에 저장하여 진동 네트워크 활동 또는 계면 세포외장 기록을 기록할 수 있습니다.
11. 침수 보관 조건의 경우 마지막 슬라이스가 보관 챔버에 들어간 시간부터 30분 동안 35ºC에서 슬라이스가 복구되도록 합니다. 이를 통해 대사 과정을 재활성화하고 절단된 신경돌기를 다시 밀봉할 수 있습니다. 30분 후 보관실을 실온으로 옮깁니다.

3. 등쪽 해마 뉴런 기록

1. 모세관 유리로 기록 패치 피펫을 제작합니다. 이 프로토콜은 필라멘트가 있는 외경 1.5mm, 내경 0.86mm의 붕규산 유리를 사용하며, 세포 내 용액으로 채울 때 3-5MΩ의 팁 저항을 생성합니다(표 1). 세포 내 용액을 얼음 위에서 차갑게 하여 에너지 성분의 저하를 방지하고 사용하기 전에 여과하십시오(주사기 필터, 기공 크기: 0.2μm).
2. ACSF를 기록하고 수조 (35-40ºC)에서 예열합니다. 발암 및 예열된 ACSF를 연동 펌프의 도움을 받는 관류 튜브를 통해 기록 챔버로 전달합니다. 슬라이스를 챔버로 옮기기 몇 분 전에 관류를 시작하십시오.
3. 관류를 중지하고 뇌 절편을 전방 표면이 위를 향하도록 하여 기록 챔버로 옮깁니다. "하프" 모양을 형성하기 위해 실크 단일 섬유가 부착된 백금 링으로 슬라이스를 제자리에 고정합니다. CA1의 피라미드층 이 첫 번째 기록 피펫의 축에 수직으로 달리도록 슬라이스를 배치합니다.
4. 6-8 mL∙^min-1의 최적 속도로 ACSF(표 1)를 기록하는 발암 및 예열된(35-40ºC)의 흐름을 다시 시작합니다.
   참고: 높은 유속(6-8 mL∙^min-1)은 슬라이스³²에서 네트워크 활성을 유지하는 데 최적입니다. 더 낮은 유속(즉, 2-3 mL∙^min-1)을 사용하여 이미징 실험 또는 생물학적으로 관련된 네트워크 활성이 필요하지 않은 경우 슬라이스 안정성을 유지할 수 있습니다.
5. 40x 대물렌즈 배율(CCD 카메라로 시각화)을 갖춘 IR-DIC(infrared differential inference contrast) 광학계를 사용하여 슬라이스 품질을 평가합니다. 매끄럽고 가볍게 딤플이 있는 표면 아래 20-30μm 깊이의 str. 피라미드 에서 많은 수의 타원형 모양, 적당히 대비되는 CA1 PC를 볼 수 있는 경우 좋은 슬라이스 품질을 가정합니다(그림 2A). 품질이 좋지 않은 슬라이스에는 고르지 않은 슬라이스 표면과 함께 대비가 심하거나 수축하거나 부풀어 오른 세포가 많이 포함되어 있습니다.
6. 패치 피펫을 세포 내 용액(예: 24mM의 세포 내 [Cl^-] 기반)으로 채워 발표된 다른 데이터와 비교할 수 있습니다.
7. 앞서 설명한 대로 전체 세포 패치 클램프 기록을 수행합니다²². 돌파구의 막 전위(V_M)가 -50mV보다 탈분극되고 직렬 저항이 >30MΩ인 경우 분석에서 세포를 제외합니다. 또는 직렬 저항이 녹음 과정에서 >20%씩 변합니다. 이러한 기록 조건에서 직렬 저항은 일반적으로 8 – 25MΩ 범위이며 최대 1시간 동안 안정적입니다.
8. 등쪽 해마에서 CA1 고유 흥분성을 검사하려면 전류 클램프 구성에서 다음 프로토콜을 사용하여 전체 세포 기록으로 고유한 생리학적 특성을 테스트합니다.
   1. 바이어스 전류가 가해지지 않은 휴지 멤브레인 전위에서 작은(-10pA, 500ms) 전류 단계를 30회 반복합니다.
   2. 바이어스 전류가 적용된 -70mV에서 트레이스 제품군을 3회 반복하여 500ms 기간(-100 - +400pA, 25pA 단계)의 탈분극 전류 단계에 하이퍼를 적용합니다.
   3. 0.1에서 20Hz까지의 가변 주파수로 100pA 피크 대 피크 진폭의 정현파를 적용합니다. 3회 반복합니다.
   4. 5x 2 nA, 2 ms 자극을 적용하여 20, 40, 60, 80, 100 Hz에서 활동 전위를 구동합니다. 주파수당 10 스윕.
   5. -70mV 전압 클램프에서 녹음을 위해 5분간의 자발적 흥분성 시냅스후 전류(EPSC)를 적용합니다.
9. 성공적인 기록 후 조직학적 분석을 위해 세포를 재밀봉하려면 패치 피펫을 천천히 후퇴시켜 아웃사이드 패치를 생성합니다. -5 mV 테스트 펄스로 측정한 바와 같이 실험 수준에서 >1 GΩ까지 직렬 저항의 증가가 관찰되면 유지 전위를 -40 mV로 높이고 파이펫을 완전히 집어넣습니다.
10. 실험 설계에 필요한 통계적 검정력을 충족하기 위해 동일한 슬라이스에서 추가 기록을 수행합니다.
11. 기록 챔버에서 기록된 뉴런이 포함된 뇌 절편을 제거하고 24웰 플레이트에 넣고 ACSF를 4% 파라포름알데히드(0.1M 인산염 완충액)로 대체하고 밤새 그대로 둡니다.
12. 다음 날, PFA를 0.1M 인산염 완충액으로 교체하고 조직학적 처리까지 보관합니다. 앞서 설명한 바와 같이 형광 접합 스트렙타비딘(streptavidin)으로 세포를 시각화합니다²².

결과

위에서 설명한 프로토콜은 성숙한 쥐의 등쪽 해마의 중격 극에서 생존 가능한 절편을 준비할 수 있도록 합니다. 이 프로토콜의 핵심 요소는 절편 준비 전에 냉각된 자당-ACSF를 관류하여 절편 표면 근위부에 건강한 CA1 PC를 만드는 것입니다. 생산된 절편의 품질은 IR-DIC 광학 하에서 육안으로 평가되며, 큰 난형 모양의 세포체를 가진 것으로 확인된 건강한 세포는 조밀한 층?...

토론

여기에서는 해마의 CA1의 등쪽 범위에서 고품질 뇌 절편을 생성하여 이 영역 내의 여러 생존 가능한 뉴런에서 녹음할 수 있도록 하는 프로토콜이 설명되어 있습니다. 근 코로나 절편에서 전체 세포 기록과 뉴런 시각화의 조합 접근 방식은 세포 생존 가능성과 정체성을 확인하는 데 매우 중요합니다.

이 프로토콜은 2가지 주요 이유로 실행 가능한 슬라?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acquisition software	Molecular Devices	pClamp 10
Adult rats	Various	n/a	Any strain of adult rat (60 days and older)
Amplifier	Molecular Devices	Axopatch 700B
Analysis software	Freeware	Stimfit	https://github.com/neurodroid/stimfit
Bone Scissors	FST	16152-12	Littauer style
Capillary Glass	Harvard Apparatus	30-0060	Borosilicate glass pipettes with filament 1.5 mm outer diameter, 0.86 mm inner diameter.
Carbogen	BOC	Various	95% O2/5% CO2
CCD camera	Scientifica	SciCamPro	https://www.scientifica.uk.com/products/
Chemicals/Reagents	Sigma Aldrich	Various	All laboratory reagents procured from Sigma Aldrich.
Cyanoacrylate (i.e. RS Pro 3)	RS Components	918-6872	Avoid gel based cyanoacrylate formulations
Digitizer	Molecular Devices	Digidata 1550B
Dissection pins/needles	Various	Various	Use 16 gauge needles (above)
Electrophysiology system	Scientifica	SliceScope	https://www.scientifica.uk.com/products/ scientifica-slicescope
Fine iris scissors	FST	14568-12	With Tungsten-Carbide tips
Glass Petri dish	Fisher Scientific	12911408
Hypodermic needles	BD Healthcare	Various	16, 18, and 22 gauge
Isofluorane 100% W/W (i.e.IsoFlo)	Zoetis	50019100
Mayo-type scissors	FST	14110-17	Blunt tips
Micromanipulators	Scientifica	Microstar	https://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-microstar-micromanipulator
Paintbrush	Art store	n/a	A fine bristled paintbrush, procured from a local art shop.
Pasteur pipette	Fisher Scientific	11546963	A glass Pasteur pipette, but cut so that the blunt end is used to transfer pipette.
Peristaltic pump	Watson Marlow	12466260	Single channel peristaltic pump
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97	Other models and methods of pipette production would work equally well.
Plastic syringes (1, 2, 5 mL)	BD Healthcare	Various
Rongeur bone tool	FST	16021-14
Slice holding chamber	Homemade
Slice weight/harp	Harvard Apparatus	SHD-22L/15	Alternatives would be suitable.
Sodium Pentobarbital (i.e. Pentoject)	Animalcare Ltd	10347/4014	200 mg/mL; other formulations of pentobarbital would be suitable
Spatula	Bochem	3213	Available from Fisher Scientific
Syringe filters	Fisher Scientific	10482012	Corning brand syringe filters, 0.22 µm pore diameter.
Vibtratome	Leica	1491200S001	VT1200S model with Vibrocheck
Water Bath	Fisher Scientific	15167015	5 Litre water bath, for example: Grant Instruments™JBA5 scientifica-scicam-pro