نموذج فأر للتحقيق في دور الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان في نمو الورم

Summary

يتم توفير بروتوكول للحقن المشترك للخلايا السرطانية والخلايا الليفية ومراقبة نمو الورم بمرور الوقت. يمكن استخدام هذا البروتوكول لفهم الأساس الجزيئي لدور الخلايا الليفية كمنظم لنمو الورم.

Abstract

يمكن أن تلعب الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) دورا مهما في نمو الورم من خلال خلق بيئة دقيقة تعزز الورم. يمكن أن تكون نماذج دراسة دور CAFs في البيئة المكروية للورم مفيدة لفهم الأهمية الوظيفية للخلايا الليفية والخلايا الليفية من الأنسجة المختلفة والعوامل الوراثية المحددة في الخلايا الليفية. تعد نماذج الماوس ضرورية لفهم المساهمين في نمو الورم وتطوره في سياق الجسم الحي. هنا ، يتم توفير بروتوكول يتم فيه خلط الخلايا السرطانية مع الخلايا الليفية وإدخالها في الفئران لتطوير الأورام. يتم تحديد أحجام الورم بمرور الوقت وأوزان الورم النهائية ومقارنتها بين المجموعات. يمكن أن يوفر البروتوكول الموصوف مزيدا من التبصر في الدور الوظيفي ل CAFs في نمو الورم وتطوره.

Introduction

داخل البيئة المكروية للورم ، أحد أبرز أنواع الخلايا هو الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAF) ¹. يمكن أن تلعب هذه الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان دورا مثبطا للورم ^2,3. على سبيل المثال ، تفرز الخلايا الليفية المعبرة عن S100A الكولاجين الذي يمكن أن يغلف المواد المسرطنة ويحمي من تكوين السرطان⁴. علاوة على ذلك ، فإن استنفاد الخلايا الليفية العضلية الإيجابية α الملساء (SMA) في سرطان البنكرياس يسبب كبت المناعة ويسرع تطور سرطان البنكرياس². يمكن أن تتطور CAFs أيضا مع الخلايا السرطانية وتعزز تطور الورم⁵،⁶،^7،8. يمكن للخلايا الليفية توليف وإفراز بروتينات مصفوفة خارج الخلية تخلق بيئة معززة للورم⁸. يمكن أن تسبب بروتينات المصفوفة خارج الخلية هذه تصلبا ميكانيكيا للأنسجة ، وهو ما يرتبط بتطور الورم ^9,10. يمكن أن تعمل المصفوفة خارج الخلية المودعة كحاجز مادي يمنع التسلل المناعي¹¹. ارتبط ترسب المصفوفة بواسطة CAFs أيضا بغزو الورم حيث ثبت أن الفبرونيكتين الناتج عن CAFs يعزز غزو الورم¹². تعزز CAFs تكوين الأوعية الدموية وتجند الخلايا المثبطة للمناعة إلى البيئة المكروية للورم عن طريق إفراز عامل النمو المحول β (TGF- β) ، وعامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) ، والإنترلوكين -6 (IL-6) ، و CXC-chemokine ligand 12 (CXCL12) ¹³،^14،15. نظرا لدورها المركزي في تعزيز نمو الورم ، فإن الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان هي هدف ناشئ للعلاج المضاد للسرطان⁶،¹⁶،^17،18.

يصف البروتوكول أدناه طريقة لاختبار كيفية تأثير الخلايا الليفية على نمو الأورام في نموذج فأر راسخ ومستخدم على نطاق واسع لنمو الورم. من أجل فهم أهمية الخلايا الليفية في البيئة المكروية للورم ، تم تعديل البروتوكول القياسي لإدخال الخلايا السرطانية في الفئران لمراقبة نموها ليشمل الخلايا الليفية مع إدخال الخلايا السرطانية. يمكن إدخال الخلايا السرطانية تحت الجلد أو داخل الأدمة. قد يؤدي الإدخال داخل الأدمة إلى أورام تنشأ من الجلد نفسه. تمثل الطعوم الخارجية التي يتم فيها حقن الخلايا السرطانية والخلايا الليفية في الفئران أداة منهجية مهمة لتشريح دور الخلايا الليفية والمجموعات الفرعية للخلايا الليفية وعوامل البروتين في القدرة على تعزيز نمو السرطان¹⁹،^20،21. يتم توفير بروتوكول مفصل للحقن المشترك للخلايا السرطانية والخلايا الليفية في الفئران. يمكن استخدام هذه الطريقة لمقارنة وجود أو عدم وجود الخلايا الليفية ، لمقارنة الخلايا الليفية من مصادر مختلفة²⁰ ، أو لمقارنة الخلايا الليفية مع وبدون التعبير عن بروتينات معينة¹⁹. بعد إدخال الخلايا السرطانية والخلايا الليفية ، يمكن مراقبة حجم الورم بمرور الوقت. في نهاية التجارب ، يمكن تشريح الأورام ووزنها. من خلال مراقبة نمو الورم بمرور الوقت ، يمكن تشريح أهمية العوامل المختلفة.

هناك طرق بديلة ممكنة لدراسة دور الخلايا الليفية في نمو الورم. على سبيل المثال ، هناك نماذج قائمة على Cre-loxed توفر خروجا مغلوطا خاصا بالأنسجة للجينات مع محركات يتم التعبير عنها بشكل تفضيلي في الخلايا الليفية. توفر هذه الأساليب أيضا فرصا للتحقيق في دور جينات ومسارات معينة في الخلايا الليفية لتطور الورم. بالمقارنة مع النهج القائمة على Cre-lox ، فإن البروتوكول المقدم سيمثل نهجا أسرع بكثير لمراقبة دور الخلايا الليفية لأنه سيتم مراقبة نمو الورم على مدى بضعة أسابيع فقط. كما أن النهج المقدم أقل تكلفة بشكل ملحوظ لأنه لا يتطلب توليد وإسكان مستعمرات الفئران المعدلة وراثيا. يمكن استخدام البروتوكول المقدم لاختبار تأثير ضربة قاضية للجينات المختلفة بسرعة باستخدام shRNAs بدلا من الحاجة إلى تطوير مستعمرات الفئران. كما أن النهج المقدم أكثر مرونة لأنه سيسمح بمقارنة أعداد مختلفة من الخلايا الليفية ، ونسب مختلفة من الخلايا السرطانية والخلايا الليفية ، وضربة قاضية للجينات المختلفة ، وحتى مقارنة الخلايا الليفية من مواقع أو أنواع الأنسجة المختلفة. سيكون لنهج Cre-lox ميزة أن الخلايا الليفية موجودة داخل الفئران في سياق فسيولوجي أكثر.

سيكون البروتوكول المذكور هنا ذا قيمة للعلماء الذين يسعون إلى مراقبة آثار الخلايا الليفية على نمو الورم بسرعة وفعالية من حيث التكلفة. هذا البروتوكول ذو قيمة خاصة للعلماء الذين يبحثون في مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا الليفية أو الخلايا الليفية من مصادر مختلفة على نمو الورم على نمو الورم. إذا كان من المهم أن يحدث بدء الورم في سياق فسيولوجي ، فيجب النظر في نماذج الفئران المعدلة وراثيا.

هناك العديد من الطرق الممكنة لإجراء هذه التجارب. يمكن استخدام الفئران ذات الكفاءة المناعية كمضيفات ، مما يسمح بالتحقيق في تفاعلات الخلايا المناعية الليفية. بالنسبة لنماذج الفئران ذات الكفاءة المناعية ، يجب حقن خلايا سرطان الفئران والخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs). يسمح استخدام MEFs أيضا للباحث بالاستفادة من مجموعة واسعة من سلالات الفئران بالضربة القاضية لاختبار وجود أو عدم وجود جين مهم. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة لاختبار دور الخلايا الليفية البشرية في تعزيز نمو الأورام في الفئران المشتقة من الخلايا السرطانية البشرية. يمكن إجراء إدخال الخلايا السرطانية تحت الجلد أو بشكل تقويمي. بالنسبة للورم الميلانيني ، كما هو موضح أدناه ، يمكن حقن خليط الورم والخلايا الليفية داخل الأدمة للحقن التقويمي الذي يحاكي عن كثب الموقع داخل الجلد حيث قد يتطور الورم الميلانيني.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب الموصوفة من قبل لجنة رعاية الحيوان في جامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس.

ملاحظة: حدد الخلايا السرطانية والخلايا الليفية التي تتطابق مع الفئران المضيفة لسلالة الفأر. حدد الخلايا السرطانية والخلايا الليفية التي تتطابق مع جنس الفأر المضيف. الحصول على الفئران من مستعمرات التربية أو شرائها من البائعين ذوي السمعة الطيبة. إدخال الأورام في الفئران التي هي ~ 8-10 أسابيع من العمر. الفئران مع الفراء ستكون في مرحلة التيلوجين أو الراحة من دورة بصيلات الشعر. خطط لنسبة 0.5 إلى 3 خلايا ليفية إلى الخلايا السرطانية.

1. تحديد العدد المناسب من الفئران لاستخدامها في التجارب

1. قبل إجراء الدراسات ، قم بإجراء تحليل للطاقة لتحديد العدد المناسب من الفئران لاستخدامها في الدراسات. استخدم الصيغة التالية لتحديد حجم العينة لتجربة باستخدام الطاقة المحددة:
   n = (Z (_1-α / 2) + Z _(1-β) / ES_{) 2}
   إذا كان α هو المستوى المحدد للأهمية (عادة 0.05) ، فإن 1-α / 2 = 0.975 و Z = 1.960.
   β هي القوة وإذا كانت الطاقة مطلوبة بنسبة 80٪ ، فإن Z = 0.84.
   
   ES ، حجم التأثير = \ μ_{1-μ 0} \ / σ
   حيث μ 0 هو المتوسط تحت الفرضية H₀ ، μ 1 هو المتوسط تحت الفرضية H₁ ، و σ هو الانحراف المعياري لنتيجة الفائدة²².
   ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من المعلومات حول حساب حجم العينة²².

2. توليد الخلايا السرطانية للحقن

1. حدد معدل النمو ذي الصلة بالمعادلة التالية:
   غرام = (ln (N (t) / N (0))) / t
   
   ملاحظة: يتم عرض مثال للخلايا التي تتضاعف خلال 24 ساعة
   مضاعفة الوقت = ln (2) / معدل النمو
   24 ساعة = ln (2) / معدل النمو
   24 * معدل النمو = .693
   معدل النمو = .693/24 = .028875
2. حدد عدد الخلايا السرطانية التي يجب أن تطبقها ومقدار الوقت الذي تحتاجه الخلايا للنمو قبل الحقن.
   ملاحظة: يتم حقن 0.25-1 مليون خلية سرطانية لكل ورم يتم تشكيله.
3. احسب عدد الأيام المطلوبة لتوليد عدد كاف من الخلايا وفقا للمعادلة
   N(t)=N(0)e^gr*t
   حيث N (t) هو عدد الخلايا في الوقت t ، N (0) هو عدد الخلايا في الوقت 0 ، gr هو معدل النمو ، و t هو الوقت.
   ملاحظة: مثال على هذه الحسابات لزراعة 500000 خلية لتوليد 10⁶ خلايا في كل من الأورام ال 12. بناء على هذه الحسابات ، 5 أيام كافية لتنمية العدد اللازم من الخلايا:
   N(t)=N(0)e^gr*t
   12 × 10⁶ = 500000 إلكترون ^{(غرام * ر)}
   12 × 10⁶ = 500000 إلكترون ^{(.028875 * ر)}
   24=ه^(.028875*س)
   ln (24) = 0.028875x
   3.178 = 0.028875x
   X = 110 ساعة = 4.59 يوما
   اترك وقتا إضافيا للخلايا لتعلق على اللوحة وللخلايا التي فقدت أثناء التجميع.
4. خلايا سرطان الصفائح.
   ملاحظة: ارتد القفازات ومعاطف المختبر عند العمل مع الخلايا المزروعة.
   ملاحظة: قم بإجراء معالجات الخلايا في غطاء التدفق الصفحي لتقليل إدخال الميكروبات من الهواء إلى العينات. عالج غطاء زراعة الأنسجة بالأشعة فوق البنفسجية قبل الاستخدام. استخدم تقنية معقمة وفقط الأدوات البلاستيكية والمواد الاستهلاكية لزراعة الخلايا المعقمة مثل الألواح المعالجة بزراعة الأنسجة والماصات والأنابيب المخروطية.
   1. احسب العدد والحجم الصحيحين لألواح زراعة الأنسجة بناء على عدد الخلايا في القارورة وتركيز الخلية المطلوب بمجرد طلائها.
   2. تسمية لوحات زراعة الأنسجة.
   3. تحضير حمام مائي بالماء عند 37 درجة مئوية.
   4. توسط القسمة في أنابيب مخروطية الشكل وتوضع في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية. يمكن زراعة العديد من الخلايا السرطانية في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS).
   5. قم بإزالة العدد المطلوب من قوارير الخلايا المجمدة من مجمد النيتروجين السائل.
      ملاحظة: استخدم قفازات الفريزر عند التعامل مع الخلايا في مجمد النيتروجين السائل.
   6. قم بإذابة قوارير الخلية بسرعة في حمام مائي أثناء رجها برفق.
      ملاحظة: أضف الإيثانول إلى القفازات أثناء التعامل مع القوارير للحفاظ على العقم.
   7. باستخدام تقنية معقمة في غطاء زراعة الأنسجة ، قم بسحب الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 10 مل من DMEM + 10٪ FBS.
   8. جهاز طرد مركزي خليط الخلية عند 180 × جم لمدة 5 دقائق.
   9. قم بإزالة المادة الطافية برفق باستخدام شفط معقم أو ماصة معقمة سعة 10 مل.
   10. أعد تعليق الخلايا الموجودة في الحبيبات برفق إلى 1 مل من DMEM + 10٪ FBS.
   11. ماصة الخلايا المعاد تعليقها على لوحة زراعة الأنسجة المسمى مع p1000 معقمة.
   12. باستخدام ماصات معقمة سعة 10 مل ، ماصة متوسطة مع مصل في ألواح زراعة الأنسجة.
   13. احتضان لوحات زراعة الأنسجة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂.
5. توسيع الخلايا السرطانية لتوليد خلايا سرطانية كافية للحقن.
   ملاحظة: راقب الخلايا باستخدام المجهر الضوئي للالتقاء. التربسين كل يومين إلى ثلاثة أيام أو حسب الحاجة لمنع الخلايا من الوصول إلى التقاء 100٪. إذا كانت هناك حاجة إلى عدد كبير من الخلايا ، فاستخدم القوارير الفائقة (جدول المواد) لزراعة عدد كبير من الخلايا بطريقة فعالة من حيث المساحة والمتوسطة. في كل مرة تحتاج فيها الخلايا إلى المرور ، اتبع هذا الإجراء:
   1. قم بإزالة الوسط من اللوحة بشفط معقم أو ماصة معقمة سعة 10 مل.
   2. اغسل الطبق برفق عن طريق سحب محلول ملحي دافئ مخزن بالفوسفات (PBS). ثم قم بإزالة برنامج تلفزيوني بشفط معقم أو ماصة.
   3. ماصة 5 مل من 1x حمض التربسين-إيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) في برنامج تلفزيوني لصفيحة 10 سم على الخلايا واحتضانها لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
   4. قم بإزالة الخلايا من اللوحة باستخدام صنابير لطيفة لإزاحة الخلايا من اللوحة.
   5. باستخدام ماصة معقمة سعة 10 مل ، اجمع الخلايا في DMEM مع مصل FBS بنسبة 10٪ في أنابيب مخروطية.
   6. أنابيب مخروطية الطرد المركزي في 180 × غرام لمدة 5 دقائق.
   7. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق سكبها. يجب أن تكون بيليه الخلية مرئية. راقبه للتأكد من بقائه في الأنبوب.
   8. أعد تعليق الخلايا المحببة بإضافة 1 مل من DMEM + 10٪ FBS وسحب السحب لأعلى ولأسفل برفق.
   9. الخلايا المعاد تعليقها على ألواح زراعة الأنسجة الجديدة بالحجم المناسب مع DMEM + 10٪ FBS (10 مل من الوسائط مناسبة للوحة زراعة الأنسجة 10 سم).

3. توليد الخلايا الليفية للحقن

ملاحظة: سوف تشيخ الخلايا الليفية الأولية بعد الكثير من المضاعفة / الممرات. من المهم استخدام الخلايا الليفية الأولية بعد عدد محدود من الممرات أو المضاعفات. تتبع عدد الممرات أو المضاعفة التي نمت فيها الخلايا الليفية من جلد الفأر أو الإنسان. استخدم الخلايا الليفية التي تحتوي على أقل من 15 ممرا للخلايا الليفية الجلدية البشرية الأولية. استخدم الخلايا الليفية التي تحتوي على أقل من 9 ممرات للخلايا الليفية الجنينية للفأر. يتم تغيير الخلايا الليفية عندما تصبح متقاربة. التربسين الخلايا الليفية عندما تكون متقاربة بنسبة 90٪ تقريبا. سيكون للخلايا الليفية خصائص مختلفة اعتمادا على كيفية زراعتها. يروج العديد من العلماء للزراعة على ركائز أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية من لوحات زراعة الأنسجة مثل مصفوفات الكولاجين ثلاثية الأبعاد التي تلتقط البيئات الشبيهة بالأنسجة بشكل أكثر فعالية²³،^24،25.

1. استخدم المعادلة في القسم 2.1 لتحديد معدل نمو الخلايا الأرومية الليفية.
2. استخدم المعادلة في القسم 2.2 لتحديد عدد الأيام اللازمة لتوسيع الخلايا الليفية.
3. قم بصفيحة الخلايا الليفية كما هو موضح في القسم 2.3 باستخدام الوسيط المناسب في اليوم المناسب للتأكد من أن الخلايا السرطانية والخلايا الليفية ستكون جاهزة للحقن في نفس اليوم.
4. قم بتوسيع الخلايا الليفية في الوسط المناسب لتوليد عدد كاف من الخلايا الليفية اللازمة باتباع الإجراءات الموضحة في القسم 2.4.

4. حلق الفئران لإعداد الفئران للحقن

ملاحظة: ارتد معاطف المختبر وشبكات الشعر وأغطية الأحذية والقفازات عند العمل مع الفئران.

1. قبل يوم إلى يومين من الحقن ، وفقا لقواعد اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان ، قم بتخدير الفئران. في حالة استخدام الأيزوفلوران للتخدير ، استخدم مزيجا من الأيزوفلوران و O₂. ضع الفئران في غرفة التخدير وأدخل خليط إيزوفلوران (5٪) / O₂ للحث على التخدير. ثم ضع مخروط الأنف على الحيوان المخدر للحفاظ على المستوى الجراحي للتخدير مع تدفق مستمر من خليط الأيزوفلوران (2٪) / O₂ .
2. افحص الحيوانات للتأكد من أنها في المستوى الجراحي المناسب للتخدير عن طريق الضغط على إصبع قدم الفأر والتأكد من أن الفأر لا يتحرك.
3. باستخدام مقص الحيوانات بشفرة جراحية # 40 ، قم بإزالة الفراء برفق من المواضع المناسبة على جوانب الفئران عن طريق تمرير مقص الحيوانات على الجلد عدة مرات حتى تتم إزالة الفراء.
4. راقب الفئران حتى تتعافى من التخدير.

5. تحضير الخلايا السرطانية والخلايا الليفية للحقن

ملاحظة: يجب حقن الخلايا السرطانية والخلايا الليفية في أقرب وقت ممكن بعد جمعها ، ويفضل أن يكون ذلك في غضون 30 دقيقة. في صباح يوم الحقن ، احصد الخلايا السرطانية والخلايا الليفية بشكل منفصل عن لوحات زراعة الأنسجة. لكل نوع خلية قم بتنفيذ الخطوات التالية:

1. قم بإزالة الوسط من لوحة زراعة الأنسجة بشفط معقم لطيف أو عن طريق سحب الوسط.
2. ماصة بلطف على 5 مل من PBS دون تعطيل الخلايا. دوامة برنامج تلفزيوني. قم بشفط PBS برفق بالشفط أو السحب من PBS.
3. يوضع برفق 5 مل من التربسين-EDTA في برنامج تلفزيوني على طبقة الخلايا ويحتضن لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
4. قم بإزالة الخلايا من اللوحة بصنابير لطيفة لإزاحة الخلايا. ماصة الخلايا عدة مرات مع ماصة 10 مل ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي يحتوي على DMEM مع 10 ٪ FBS.
5. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب المخروطية في 180 × غرام لمدة 5 دقائق.
6. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق سكبها برفق ، مع الاحتفاظ بحبيبات الخلية. اغسل بيليه الخلية مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني. في كل مرة ، ماصة 10 مل من PBS على الخلايا. تخلط بلطف مع ماصة p1000.
7. أجهزة الطرد المركزي الخلايا كما في الخطوة 5.5. قم بإزالة PBS برفق باستخدام ماصة وكرر.
8. أعد تعليق الخلايا المغسولة والحبيبية في 1 مل من PBS باستخدام p1000.
9. تنظيف شريحة مقياس الدم مع الكحول وجافة.
10. ماصة 100 ميكرولتر من خليط الخلية في أنبوب وإضافة 400 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان الأزرق لتركيز أزرق تريبان النهائي بنسبة 0.32٪.
11. املأ برفق غرف مقياس الدم الزجاجي أسفل غطاء الغطاء عن طريق سحب خليط الخلية حتى تمتلئ الحجرة.
12. باستخدام المجهر ، ركز على خطوط الشبكة لهدف 10x.
13. عد الخلايا الحية غير الملوثة والخلايا الزرقاء في مجموعة واحدة من 16 مربعا.
14. عد كل 4 مجموعات من 16 مربعا.
15. متوسط عدد الخلايا للخلايا الواضحة والزرقاء من 4 مجموعات من 16 مربعا واضربها في 10000. اضرب في 5 لتصحيح التخفيف 1: 5 من Trypan الأزرق.
16. العد النهائي هو التركيز في الخلايا / مل للخلايا القابلة للحياة والميتة. اضرب في الحجم لتحديد العدد الإجمالي للخلايا السرطانية والخلايا الليفية. تأكد من أن جزء الخلايا القابلة للحياة هو >80٪.
17. تأكد من وجود عدد كاف من خلايا سرطان الجلد والخلايا الليفية لجميع الحقن المخطط لها ، بافتراض فقدان 20٪ على الأقل من العينة أثناء الحقن.
18. نقل العدد المطلوب من الخلايا إلى أنبوب مخروطي جديد وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي (180 × غرام لمدة 5 دقائق).
19. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 10 مل.
20. أعد تعليق الحبيبات بالتركيز المطلوب بالكمية المناسبة من دستور الأدوية الأمريكي (USP) بدرجة PBS (50 ميكرولتر لكل ورم للحقن داخل الأدمة و 100 ميكرولتر لكل ورم للحقن تحت الجلد).

6. حقن الخلايا السرطانية والخلايا الليفية في الفئران

ملاحظة: إذا تمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية ، فقم بحقن ورمين في كل فأر ، واحد على كل جناح. عشوائيا أي ماوس سيتلقى أي حقنة على الجانبين الأيمن والأيسر. اعتمادا على عدد الفئران المراد حقنها ، قم بتخدير الفئران وحقن الخلايا السرطانية والخلايا الليفية في الفئران على دفعات.

1. للحقن تحت الجلد للخلايا السرطانية
   1. تخدير الفئران كما هو موضح في القسم 4.1.
   2. امسح الجلد المحلوق بمسحات الكحول.
   3. املأ حقنة معقمة بالحجم المطلوب من الخلايا أو خليط الخلايا وقم بتغطية المحقنة بإبرة قياس 27.
      ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات هواء. حرك المحقنة حسب الحاجة لإزالة الفقاعات. بمجرد إدخال الخلايا في المحقنة ، حافظ على الخلايا داخل المحاقن مختلطة جيدا عن طريق قلب المحاقن باستمرار لمنع التكتل.
   4. أدخل الإبرة في المنطقة تحت الجلد على جناح الماوس وحقن الخلايا برفق في الماوس. استخدم معلق خلية 100 ميكرولتر لكل ورم للحقن تحت الجلد (لا ينصح باستخدام حجم يزيد عن 100 ميكرولتر لكل حقنة).
   5. راقب الفئران حتى تتعافى من التخدير. إذا لزم الأمر ، زود الفئران بمواد عازلة إضافية مثل الأكواخ و / أو وسادات التدفئة لمساعدة الفئران على التعافي التام.
2. للحقن داخل الأدمة للخلايا السرطانية
   1. تخدير الفئران كما هو موضح في القسم 4.1.
   2. امسح الجلد المحلوق بمسحات الكحول.
   3. املأ حقنة معقمة بالحجم المطلوب من الخلايا أو خليط الخلايا وقم بتغطية المحقنة بإبرة قياس 27.
      ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات هواء. حرك المحقنة حسب الحاجة لإزالة الفقاعات. بمجرد إدخال الخلايا في المحقنة ، حافظ على الخلايا داخل المحاقن مختلطة جيدا عن طريق قلب المحاقن باستمرار لمنع التكتل.
   4. أدخل إبرة قياس 27 في المنطقة داخل الأدمة من الجلد على جناح الفأر وحقن الخلايا برفق في المنطقة داخل الأدمة في الفأر. استخدم معلق خلية 50 ميكرولتر لكل ورم للحقن داخل الأدمة (لا ينصح باستخدام حجم يزيد عن 50 ميكرولتر لكل حقنة).
   5. راقب الفئران حتى تتعافى من التخدير. إذا كانت هناك علامات على أن الفئران في محنة ، استشر الطبيب البيطري. إذا لزم الأمر ، زود الفئران بمواد عازلة إضافية مثل الأكواخ و / أو وسادات التدفئة لمساعدة الفئران على التعافي التام.

7. مراقبة الفئران أثناء نمو الورم

1. راقب الفئران يوميا بحثا عن أي علامات للألم أو الضيق (وضعية منحنية ، أو تلوي ، أو نطق ، أو تمدد على طول القفص ، أو الضغط على بطنها إلى أسفل أرضية القفص ، أو الإحجام عن التحرك حول القفص) أو تكوين الخراج. إذا كانت هناك علامات على أن الفئران في محنة ، استشر الطبيب البيطري.
2. بمجرد تكوين الأورام، قم بقياس حجم الورم كل يومين إلى ثلاثة أيام تقريبا. قياس طول الورم (أطول جانب) والعرض (عمودي على الطول) مع الفرجار.
   ملاحظة: أفضل الممارسات هي أن يقوم نفس الشخص بإجراء هذه القياسات طوال التجربة لتقليل التباين في البيانات. بالنسبة للقياسات ، قم بتخدير الفئران كما هو موضح في القسم 4.1
3. احسب أحجام الورم بالصيغة الحجم = 0.5 × (الطول ×^{العرض 2}).

8. حصاد الأورام وقياس أوزان الورم

1. القتل الرحيم للفئران عندما يصل نمو الورم إلى نقطة نهاية تجريبية أنشأتها لجنة المؤسسة المعنية برعاية الحيوان. ضع الفئران في غرفة والقتل الرحيم مع إزاحة بطيئة (20-30٪ في الدقيقة) لهواء الغرفة مع CO₂ المضغوط لمدة دقيقة واحدة بعد توقف التنفس.
2. أداء خلع عنق الرحم على الفئران. كبح القوارض على سطح مستو صلب. ضع قلما قويا أو أي شيء آخر على الجزء الخلفي من الرقبة عند قاعدة الجمجمة. ادفع بسرعة للأمام وللأسفل مع تقييد الجسم للرأس أثناء السحب للخلف مع اليد التي تمسك بقاعدة الذيل. تأكد مع الجس من قطع الحبل الشوكي.
   ملاحظة: يجب إجراء خلع عنق الرحم من قبل موظفي المختبر ذوي الخبرة.
3. لكل فأر في التجربة ، تأكد من أن الفأر لم يعد على قيد الحياة عن طريق التحقق من عدم وجود تنفس ولا ضربات قلب ولا استجابة لقرصة إصبع القدم.
4. باستخدام مشرط معقم ومقص جراحي ، قم باستئصال الورم بالكامل من الماوس. باستخدام المقص الجراحي ، قم بقص الأنسجة غير السرطانية من الورم.
5. وزن الورم على ميزان تحليلي وتسجيل وزن الورم.

9. التحليل الإحصائي لأحجام الورم وأوزان الورم

1. قارن أحجام الورم بمرور الوقت في كل مجموعة مع تحليل التباين المتكرر (ANOVA). إجراء تحليل مزدوج إذا تم حقن ورمين لكل فأر.
2. قارن أوزان الورم بين المجموعات المصابة ب ANOVA باستخدام اختبار ثنائي الذيل. يمكن بعد ذلك استخدام اختبار Tukey اللاحق لتحديد المجموعات التي تختلف اختلافا كبيرا عن بعضها البعض. إجراء تحليل مزدوج إذا تم حقن ورمين لكل فأر.

النتائج

تم استزراع خلايا سرطان الجلد البشرية A2058 والخلايا الليفية الجلدية البشرية الأولية في ظل ظروف معقمة. تم جمع الخلايا وغسلها ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. تم حقن الفئران التي تعاني من نقص المناعة (NU / J - سلالة Foxn1 عارية) تحت الجلد على جناح واحد مع 0.25 مليون خلية سرطان الجل...

Discussion

في التجربة الموضحة في الشكل 1، أدى إدخال الخلايا الليفية الجلدية البشرية مع خلايا الورم الميلانيني A2058 البشرية إلى أورام أكبر مما كانت عليه عندما تم إدخال خلايا الورم الميلانيني بدون الخلايا الليفية المحقونة بشكل مشترك. يمكن اكتشاف هذا الاختلاف بسهولة بناء على حجم الورم و...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
26G Needles	Fisher Scientific	14-826-10
Alcohol swabs	Fisher Scientific	326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40	WAHL Professional	8787-450A
Athymic nude mice (NU/J)	The Jackson labs	002019	These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells	ATCC	ATCC® CRL-11147™	This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks	Fisher Scientific	14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g	Fisher Scientific	14-432-22
Countess Cell Counting Chamber	Fisher Scientific	C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	11965-118
Fetal bovine serum	Fisher Scientific	MT35010CV
Fibroblasts	ATCC	PCS-201-012	We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice	Fisher Scientific	50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet	Celltreat	667210B
Sterile 5 ml serological pipet	Celltreat	229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns	Fisher Scientific	09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	15400054
Sterile tissue-culture grade PBS	Fisher Scientific	50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet	Celltreat	667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes	Genesee Scientific	25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes	Genesee Scientific	25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes	Genesee Scientific	25-260
Trypan blue	Fisher Scientific	C10228