腫瘍増殖における癌関連線維芽細胞の役割を調べるためのマウスモデル

要約

癌細胞と線維芽細胞を同時注入し、腫瘍の成長を経時的に監視するためのプロトコルが提供されます。このプロトコルは、腫瘍増殖の調節因子としての線維芽細胞の役割の分子基盤を理解するために使用できます。

要約

がん関連線維芽細胞(CAF)は、腫瘍を促進する微小環境を作り出すことにより、腫瘍の成長に重要な役割を果たすことができます。腫瘍微小環境におけるCAFの役割を研究するためのモデルは、線維芽細胞、さまざまな組織からの線維芽細胞、および線維芽細胞の特定の遺伝的要因の機能的重要性を理解するのに役立ちます。マウスモデルは、in vivoの状況における腫瘍の成長と進行の寄与を理解するために不可欠です。ここでは、がん細胞を線維芽細胞と混合し、マウスに導入して腫瘍を発生させるプロトコールを提供する。経時的な腫瘍サイズと最終的な腫瘍重量が決定され、グループ間で比較されます。記載されたプロトコルは、腫瘍の成長および進行におけるCAFの機能的役割についてより多くの洞察を提供することができる。

概要

腫瘍微小環境の中で、最も顕著な細胞型の1つは、がん関連線維芽細胞(CAF)¹です。これらの癌腫関連線維芽細胞は、腫瘍抑制の役割を果たすことができる^2,3。例えば、S100A発現線維芽細胞は、発がん物質をカプセル化し、癌腫形成から保護することができるコラーゲンを分泌する⁴。さらに、膵臓がんにおけるα平滑筋アクチン(SMA)陽性筋線維芽細胞の枯渇は免疫抑制を引き起こし、膵臓がんの進行を加速させます²。CAFはまた、癌細胞と共進化し、腫瘍の進行を促進することができます⁵、^6、7、8。線維芽細胞は、腫瘍促進環境を作り出す細胞外マトリックスタンパク質を合成して分泌することができる⁸。これらの細胞外マトリックスタンパク質は、組織の機械的硬化を引き起こす可能性があり、これは腫瘍の進行に関連する^9,10。沈着した細胞外マトリックスは、免疫浸潤¹¹を阻害する物理的障壁として作用することができる。CAFsによるマトリックス沈着は、CAFsによって生成されるフィブロネクチンが腫瘍浸潤を促進することが示されているため、腫瘍浸潤とも関連している¹²。CAFは、トランスフォーミング成長因子β(TGF-β)、血管内皮増殖因子(VEGF)、インターロイキン-6(IL-6)、およびCXC-ケモカインリガンド12(CXCL12)を分泌することにより、血管新生を促進し、免疫抑制細胞を腫瘍微小環境に動員します13,14,15。腫瘍増殖の促進における中心的な役割のために、癌関連線維芽細胞は抗癌療法の新たな標的である6,16,17,18。

以下のプロトコルは、十分に確立され広く使用されている腫瘍増殖のマウスモデルにおいて、線維芽細胞が腫瘍の成長にどのように影響するかをテストするための方法について説明しています。腫瘍微小環境における線維芽細胞の重要性を理解するために、マウスに癌細胞を導入してその成長を監視するための標準プロトコルは、癌細胞導入を伴う線維芽細胞を含むように変更されました。癌細胞は、皮下または皮内に導入することができる。皮内導入は、皮膚自体から発生する腫瘍をもたらすであろう。癌細胞と線維芽細胞をマウスに同時注射する異種移植片は、癌増殖を促進する能力における線維芽細胞、線維芽細胞の亜集団、およびタンパク質因子の役割を分析するための重要な方法論的ツールを表しています^19,20,21。癌細胞と線維芽細胞をマウスに同時注射するための詳細なプロトコルが提供されています。この方法は、線維芽細胞の存在または非存在を比較するために、異なる供給源からの線維芽細胞を比較するために²⁰、または特定のタンパク質の発現の有無にかかわらず線維芽細胞を比較するために^{使用することができる19}。癌細胞および線維芽細胞が導入された後、腫瘍の大きさを経時的にモニターすることができる。実験の終わりに、腫瘍を解剖して計量することができます。腫瘍の成長を経時的に監視することにより、さまざまな要因の重要性を分析できます。

腫瘍増殖における線維芽細胞の役割を研究するための可能な代替アプローチがあります。一例として、線維芽細胞で優先的に発現されるドライバーを有する遺伝子の組織特異的ノックアウトを提供するCre-loxedベースのモデルがある。このようなアプローチは、腫瘍の進行に対する線維芽細胞における特定の遺伝子および経路の役割を調査する機会も提供する。Cre-loxベースのアプローチと比較して、提供されたプロトコルは、腫瘍の成長がわずか数週間で監視されるため、線維芽細胞の役割を監視するためのはるかに迅速なアプローチを表します。提供されたアプローチはまた、遺伝子操作されたマウスのコロニーを生成および収容する必要がないため、大幅に安価である。提供されたプロトコルは、マウスコロニーを開発する必要なしに、shRNAを使用して異なる遺伝子のノックダウンの効果を迅速にテストするために使用できます。提供されたアプローチは、異なる数の線維芽細胞の比較、異なる癌細胞と線維芽細胞の比率、異なる遺伝子のノックダウン、さらには異なる組織部位または種からの線維芽細胞の比較を可能にするため、より柔軟である。Cre-loxアプローチは、線維芽細胞がより生理学的な状況でマウス内に存在するという利点を有するであろう。

ここで報告されたプロトコルは、腫瘍の成長に対する線維芽細胞の影響を迅速かつ費用効果の高い方法で監視しようとする科学者にとって価値があります。このプロトコルは、腫瘍増殖に対する腫瘍増殖に関する線維芽細胞または異なるソースからの線維芽細胞の異なるサブセットを調査する科学者にとって特に価値があります。腫瘍の開始が生理学的な状況で起こることが重要であるならば、遺伝子操作されたマウスモデルが考慮されるべきです。

これらの実験を実行するには、いくつかの可能なアプローチがあります。免疫コンピテントマウスを宿主として使用することができ、線維芽細胞と免疫細胞の相互作用の調査が可能になります。免疫コンピテントマウスモデルの場合、マウスがん細胞とマウス胚性線維芽細胞(MEF)を注射する必要があります。MEFを使用することで、研究者は広範囲のノックアウトマウス系統を利用して、目的の遺伝子の有無を試験することもできます。あるいは、免疫不全マウスを使用して、ヒト癌細胞に由来するマウスにおける腫瘍の増殖の促進におけるヒト線維芽細胞の役割を試験することができる。癌細胞の導入は、皮下または同所的に行うことができる。黒色腫の場合、後述するように、腫瘍-線維芽細胞混合物を皮内注射して、黒色腫が発症する皮膚内の位置をより厳密にシミュレートする同所性注射を行うことができます。

プロトコル

記載されているすべての実験は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の動物管理委員会によって承認されました。

注:マウス系統の宿主マウスに一致する癌細胞と線維芽細胞を選択します。宿主マウスの性別に一致する癌細胞と線維芽細胞を選択します。繁殖コロニーからマウスを入手するか、評判の良いベンダーから購入します。8~10週齢のマウスに腫瘍を導入する。毛皮を持つマウスは、毛包周期の休止期または休止期になります。癌細胞に対する線維芽細胞の比率を0.5対3で計画します。

1.実験に使用するマウスの適切な数を決定します

1. 研究を実行する前に、検出力分析を実行して、研究に使用するマウスの適切な数を決定します。次の式を使用して、指定した検出力を持つ実験のサンプルサイズを決定します。
   n = (Z(_1-α/₂)+Z_(1-β)/ES₎²
   αが選択された有意水準(通常は0.05)である場合、1-α/2 = 0.975およびZ = 1.960です。
   βは電力であり、80%の電力が必要な場合は、Z = 0.84です。
   
   ES、効果サイズ = \μ_{1-μ 0}\/σ
   ここで、μ₀は仮説H₀の平均、μ 1は仮説H₁の平均、σは関心のある結果の標準偏差^です22。
   注:サンプルサイズの計算の詳細については、²²を参照してください。

2.注射用の癌細胞を生成する

1. 次の式で関連する成長率を決定します。
   Gr = (ln (N(t)/N(0)))/t
   
   注:24時間で2倍になるセルの例が示されています
   倍加時間 = ln(2)/成長率
   24 時間 = LN(2)/成長率
   24*成長率 = .693
   成長率 = .693/24= .028875
2. プレート化するがん細胞の数と、注射前に細胞を増殖させる必要がある時間を決定します。
   注:形成された腫瘍ごとに0.25〜100万個の癌細胞が注入されます。
3. 式に従って十分な数のセルを生成するのに必要な日数を計算します
   N(t)=N(0)e^gr*t
   ここで、N(t)は時刻tの細胞数、N(0)は時刻0の細胞数、grは成長率、tは時間です。
   注:500,000個の細胞を増殖させて、12個の腫瘍のそれぞれに10個の⁶ 個の細胞を生成するためのこれらの計算の例。これらの計算に基づいて、必要な数の細胞を成長させるには5日で十分です。
   N(t)=N(0)e^gr*t
   12 x 10⁶ = 500,000e^(gr*t)
   12 x 10⁶=500,000e^(.028875*t)
   24=e^(.028875*x)
   ln(24)=0.028875x
   3.178=0.028875x
   X = 110時間= 4.59日
   細胞がプレートに付着し、収集中に失われた細胞のために余分な時間を確保してください。
4. プレート癌細胞。
   注:培養細胞を扱うときは、手袋と白衣を着用してください。
   注:層流フードで細胞操作を実行して、空気からサンプルへの微生物の導入を最小限に抑えます。使用前に組織培養フードを紫外線で処理してください。滅菌技術を使用し、滅菌細胞培養プラスチック製品と、組織培養処理プレート、ピペット、コニカルチューブなどの消耗品のみを使用してください。
   1. バイアル内の細胞数と播種後の所望の細胞濃度に基づいて、組織培養プレートの正しい数とサイズを計算します。
   2. 組織培養プレートにラベルを付けます。
   3. 37°Cの水で水浴を準備します。
   4. 培地を円錐形のチューブに分注し、37°Cの水浴に入れます。 多くの癌細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で増殖させることができます。
   5. 必要な数の凍結細胞のバイアルを液体窒素冷凍庫から取り出します。
      注意: 液体窒素冷凍庫で細胞を取り扱うときは、冷凍庫の手袋を使用してください。
   6. 穏やかに振とうしながら、水浴中で細胞バイアルを素早く解凍する。
      注意: 無菌性を維持するために、バイアルを取り扱うときに手袋にエタノールを追加します。
   7. 組織培養フード内で滅菌技術を使用して、10 mLのDMEM + 10%FBSを含む15 mLのコニカルチューブに細胞をピペットで入れます。
   8. 細胞混合物を180 x g で5分間遠心分離します。
   9. 滅菌吸引または滅菌10 mLピペットで上清を静かに取り除きます。
   10. ペレット内の細胞を1 mLのDMEM + 10%FBSに静かに再懸濁します。
   11. 再懸濁した細胞を滅菌p1000で標識した組織培養プレート上にピペットします。
   12. 滅菌済みの10 mLピペットを使用して、血清を含むピペット培地を組織培養プレートに入れます。
   13. 組織培養プレートを5%_CO2を含む37°Cの組織培養インキュベーター内でインキュベートする。
5. がん細胞を拡張して、注射に十分ながん細胞を生成します。
   注:コンフルエント性について光学顕微鏡で細胞を監視します。2〜3日ごと、または必要に応じてトリプシン処理して、細胞が100%コンフルエントに達するのを防ぎます。多数の細胞が必要な場合は、ハイパーフラスコ(材料表)を使用して、スペース効率および中効率の高い方法で多数の細胞を増殖させます。細胞を継代する必要があるたびに、次の手順に従います。
   1. 滅菌吸引または滅菌10 mLピペットでプレートから培地を取り除きます。
   2. 温かいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でピペッティングしてプレートを穏やかに洗浄します。次に、滅菌吸引またはピペットでPBSを取り外します。
   3. ピペット5 mLの1xトリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)をPBSで10 cmプレートで細胞上に置き、37°Cで5分間インキュベートします。
   4. 穏やかなタップでプレートから細胞を取り除き、プレートから細胞を取り除きます。
   5. 滅菌済みの10 mLピペットを使用して、細胞をコニカルチューブ内の10%FBS血清とともにDMEMに回収します。
   6. 円錐管を180 x g で5分間遠心分離します。
   7. 上清を注いで取り除きます。セルペレットが見えるはずです。それがチューブに残っていることを確認するためにそれを見てください。
   8. 1 mLのDMEM + 10%FBSを添加し、穏やかに上下にピペッティングして、ペレット細胞を再懸濁します。
   9. 細胞をDMEM + 10% FBSで適切なサイズの新しい組織培養プレートに再懸濁します(10 mLの培地は10 cmの組織培養プレートに適しています)。

3.注射用の線維芽細胞を生成します

注:原発性線維芽細胞は、倍増/継代が多すぎると老化します。限られた数の継代または倍増の後に初代線維芽細胞を使用することが重要です。線維芽細胞がマウスまたはヒトの皮膚から成長した継代または倍増の数を追跡します。初代ヒト皮膚線維芽細胞には、継代数が15未満の線維芽細胞を使用します。.マウス胚性線維芽細胞には、継代数が9未満の線維芽細胞を使用します。線維芽細胞は、コンフルエントになると変化します。線維芽細胞が約90%コンフルエントになったらトリプシン処理します。線維芽細胞は、培養方法によって異なる性質を持ちます。多くの科学者は、組織様環境をより効果的に捕捉する3Dコラーゲンマトリックスなどの組織培養プレートよりも生理学的に関連性のある基質での培養を促進しています^23、24、25。

1. セクション2.1の式を使用して、線維芽細胞の増殖速度を決定します。
2. セクション2.2の式を使用して、線維芽細胞を拡張するのに必要な日数を決定します。
3. セクション2.3で説明されているように、適切な日に適切な培地を使用して線維芽細胞をプレート化し、癌細胞と線維芽細胞が同じ日に注射の準備ができていることを確認します。
4. 適切な培地で線維芽細胞を拡張して、セクション2.4で説明されている手順に従って必要な十分な数の線維芽細胞を生成します。

4.マウスを剃って注射用のマウスを準備する

注意: マウスを扱うときは、白衣、ヘアネット、靴カバー、手袋を着用してください。

1. 注射の1〜2日前に、施設動物管理委員会の規則に従って、マウスに麻酔をかける。麻酔にイソフルランを使用する場合は、イソフルランとO₂の混合物を使用してください。マウスを麻酔室に入れ、イソフルラン(5%)/ O₂ 混合物を導入して麻酔を誘発します。次に、麻酔をかけた動物にノーズコーンを置き、イソフルラン(2%)/ O₂ 混合物の一定の流れで麻酔の手術面を維持します。
2. マウスのつま先をつまんでマウスが動かないことを確認し、動物をチェックして、適切な麻酔の手術面にいることを確認します。
3. 外科用ブレード#40を備えた動物バリカンを使用して、毛皮が除去されるまで動物バリカンを皮膚に複数回通して、マウスの側面の適切な位置から毛皮をそっと取り除きます。
4. マウスが麻酔から回復するまでマウスを監視します。

5.注射用の癌細胞と線維芽細胞を準備します

注:がん細胞と線維芽細胞は、採取後できるだけ早く、できれば30分以内に注射する必要があります。注射の朝に、組織培養プレートとは別に癌細胞と線維芽細胞を採取します。セルの種類ごとに、次の手順を実行します。

1. 組織培養プレートから培地を穏やかに滅菌吸引するか、培地をピペッティングして除去します。
2. 細胞を破壊することなく、5 mLのPBSを穏やかにピペットで行います。PBSを回転させます。PBSを吸引またはピペットで静かに吸引します。
3. PBS中のトリプシン-EDTA5 mLを細胞層上に穏やかにピペットし、37°Cで5分間インキュベートします。
4. 穏やかなタップでプレートから細胞を取り除き、細胞を取り除きます。10 mLピペットで細胞を数回ピペットし、10%FBSを含むDMEMを含むコニカルチューブに細胞を移します。
5. 円錐管を180 x gで5分間遠心分離します。
6. 上清を穏やかに注ぎ、細胞ペレットを保持して取り除きます。セルペレットをPBSで2回洗浄します。毎回、10 mLのPBSを細胞にピペットで貼り付けます。p1000ピペットで静かに混ぜます。
7. ステップ5.5のように細胞を遠心分離します。ピペットでPBSをそっと取り外し、繰り返します。
8. 洗浄したペレット化した細胞をp1000を含む1 mLのPBSに再懸濁します。
9. 血球計算盤のスライドをアルコールできれいにして乾かします。
10. 100 μLの細胞混合物をチューブにピペットし、0.4%トリパンブルーを400 μL加えて、最終トリパンブルー濃度を0.32%にします。
11. チャンバーがいっぱいになるまで細胞混合物をピペッティングすることにより、カバーガラスの下にあるガラス血球計算盤のチャンバーをそっと満たします。
12. 顕微鏡を使用して、10倍の対物レンズのグリッド線に焦点を合わせます。
13. 生きている、染色されていない細胞と青い細胞を16個の正方形の1セットで数えます。
14. 16個の正方形の4セットすべてを数えます。
15. 16個の正方形の4セットのクリアセルとブルーセルのセル数を平均し、10,000を掛けます。5を掛けて、トリパンブルーからの1:5希釈を補正します。
16. 最終的なカウントは、生細胞と死細胞の細胞/ mLの濃度です。体積を掛けて、癌細胞と線維芽細胞の総数を決定します。生菌の割合が>80%であることを確認します。
17. 注射中にサンプルが少なくとも20%失われると仮定して、計画されたすべての注射に十分な数の黒色腫細胞と線維芽細胞があることを確認します。
18. 必要な数の細胞を新しいコニカルチューブに移し、遠心分離(180 x gで5分間)によって細胞をペレット化します。
19. 10 mLピペットで上清を除去します。
20. 適切な量の米国薬局方(USP)グレードのPBS(皮内注射の場合は腫瘍あたり50 μL、皮下注射の場合は腫瘍あたり100 μL)に必要な濃度でペレットを再懸濁します。.

6.がん細胞と線維芽細胞をマウスに注入する

注:施設の動物管理委員会によって承認された場合は、各マウスに2つの腫瘍を注入し、各脇腹に1つずつ注入します。どのマウスが左右の側面にどの注射を受けるかをランダム化します。注射するマウスの数に応じて、マウスに麻酔をかけ、がん細胞と線維芽細胞をバッチでマウスに注入します。

1. がん細胞の皮下注射用
   1. セクション4.1に記載されているようにマウスを麻酔します。
   2. 剃った皮膚をアルコール綿棒で拭きます。
   3. 滅菌シリンジに希望の量の細胞または細胞混合物を満たし、シリンジを27ゲージの針でキャップします。
      注意: 気泡がないことを確認してください。必要に応じてシリンジをフリックして気泡を取り除きます。細胞がシリンジに導入されたら、凝集を防ぐためにシリンジを連続的に反転させて、シリンジ内の細胞をよく混合してください。
   4. マウスの脇腹の皮下領域に針を挿入し、細胞をマウスに静かに注入します。皮下注射には腫瘍あたり100 μLの細胞懸濁液を使用します(注射あたり100 μLを超える容量を使用することは推奨されません)。
   5. マウスが麻酔から回復するまでマウスを監視します。必要に応じて、マウスが完全に回復するのを助けるために、小屋や加熱パッドなどの追加の断熱材をマウスに提供します。
2. がん細胞の皮内注射用
   1. セクション4.1に記載されているようにマウスを麻酔します。
   2. 剃った皮膚をアルコール綿棒で拭きます。
   3. 滅菌シリンジに希望の量の細胞または細胞混合物を満たし、シリンジを27ゲージの針でキャップします。
      注意: 気泡がないことを確認してください。必要に応じてシリンジをフリックして気泡を取り除きます。細胞がシリンジに導入されたら、凝集を防ぐためにシリンジを連続的に反転させて、シリンジ内の細胞をよく混合してください。
   4. マウスの脇腹の皮膚の皮内領域に27ゲージの針を挿入し、マウスの皮内領域に細胞を静かに注入します。皮内注射には腫瘍あたり50μLの細胞懸濁液を使用します(注射あたり50μLを超える容量を使用することは推奨されません)。
   5. マウスが麻酔から回復するまでマウスを監視します。マウスが苦しんでいる兆候がある場合は、獣医師に相談してください。必要に応じて、マウスが完全に回復するのを助けるために、小屋や加熱パッドなどの追加の断熱材をマウスに提供します。

7.腫瘍の成長中にマウスを監視する

1. 痛みや苦痛の兆候(猫背姿勢、身もだえ、発声、ケージに沿って伸びる、腹部をケージの床の底に押し付ける、ケージの周りを移動するのをためらう)または膿瘍の形成がないかマウスを毎日監視します。マウスが苦しんでいる兆候がある場合は、獣医師に相談してください。
2. 腫瘍が形成されたら、約2〜3日ごとに腫瘍の量を測定します。ノギスで腫瘍の長さ(最長辺)と幅(長さに垂直)を測定します。
   注:ベストプラクティスは、データのばらつきを減らすために、実験全体で同じ人がこれらの測定を実行することです。測定のために、セクション4.1で説明されているようにマウスを麻酔します
3. 式で腫瘍体積を計算します 体積= 0.5 x(長さx幅²)。

8.腫瘍を採取し、腫瘍重量を測定する

1. 腫瘍の成長が施設動物管理委員会によって確立された実験エンドポイントに達したときにマウスを安楽死させます。マウスをチャンバーに入れ、呼吸停止後1分間、圧縮されたCO₂ でチャンバー空気をゆっくりと(毎分20〜30%)置換して安楽死させる。
2. マウスに頸椎脱臼を行います。げっ歯類をしっかりした平らな面に拘束します。頭蓋骨の付け根の首の後ろに頑丈なペンまたは他の物を置きます。尻尾の付け根を持つ手で後方に引っ張りながら、頭を拘束している物体で素早く前後に押します。脊髄が切断されていることを触診で確認します。
   注意: 頸部脱臼は、経験豊富なラボ担当者が行う必要があります。
3. 実験の各マウスについて、呼吸、心拍、つま先のつまみに対する反応がないことを確認して、マウスが生きていないことを確認します。
4. 滅菌メスと外科用ハサミを使用して、マウスから腫瘍全体を切除します。外科用ハサミで、腫瘍から非腫瘍組織を切り取ります。
5. 分析天秤で腫瘍の重さを量り、腫瘍の重さを記録します。

9.腫瘍体積と腫瘍重量の統計分析

1. 反復測定分散分析(ANOVA)を使用して、各グループの腫瘍体積を経時的に比較します。マウスごとに2つの腫瘍を注射した場合、対応のある分析を実行します。
2. 両側検定を使用して、ANOVAのグループ間の腫瘍重量を比較します。次に、Tukeyの事後検定を使用して、どのグループが互いに有意に異なるかを判断できます。マウスごとに2つの腫瘍を注射した場合、対応のある分析を実行します。

結果

A2058ヒト黒色腫細胞および初代ヒト皮膚線維芽細胞を無菌条件下で培養した。細胞を回収し、PBSで3回洗浄した。免疫不全マウス(NU/J-Foxn1ヌード系統)を25万個のA2058メラノーマ細胞のみで片側腹部に皮下注射した。もう一方の側面では、マウスに25万個のA2058メラノーマ細胞と75万個の線維芽細胞の混合物を注射した。細胞を12匹の免疫不全マウスに注射した。左右の脇腹?...

ディスカッション

図1の実験では、ヒト皮膚線維芽細胞をヒトA2058メラノーマ細胞と同時導入すると、線維芽細胞を同時注入せずにメラノーマ細胞を導入した場合よりも大きな腫瘍が生じました。この差は、腫瘍の体積と腫瘍の重量に基づいて簡単に検出できます。結果は、癌関連線維芽細胞が腫瘍増殖を促進できるという複数の報告と一致しています⁵、⁶

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
26G Needles	Fisher Scientific	14-826-10
Alcohol swabs	Fisher Scientific	326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40	WAHL Professional	8787-450A
Athymic nude mice (NU/J)	The Jackson labs	002019	These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells	ATCC	ATCC® CRL-11147™	This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks	Fisher Scientific	14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g	Fisher Scientific	14-432-22
Countess Cell Counting Chamber	Fisher Scientific	C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	11965-118
Fetal bovine serum	Fisher Scientific	MT35010CV
Fibroblasts	ATCC	PCS-201-012	We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice	Fisher Scientific	50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet	Celltreat	667210B
Sterile 5 ml serological pipet	Celltreat	229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns	Fisher Scientific	09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	15400054
Sterile tissue-culture grade PBS	Fisher Scientific	50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet	Celltreat	667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes	Genesee Scientific	25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes	Genesee Scientific	25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes	Genesee Scientific	25-260
Trypan blue	Fisher Scientific	C10228