מודל עכברי לחקר התפקיד של פיברובלסטים הקשורים לסרטן בצמיחת הגידול

Summary

ניתן פרוטוקול להזרקה משותפת של תאים סרטניים ופיברובלסטים ולמעקב אחר צמיחת הגידול לאורך זמן. פרוטוקול זה יכול לשמש להבנת הבסיס המולקולרי לתפקידם של פיברובלסטים כמווסתים של צמיחת גידולים.

Abstract

פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) יכולים למלא תפקיד חשוב בצמיחת הגידול על ידי יצירת מיקרו-סביבה המקדמת גידולים. מודלים לחקר התפקיד של CAFs במיקרו-סביבה של הגידול יכולים להיות מועילים להבנת החשיבות התפקודית של פיברובלסטים, פיברובלסטים מרקמות שונות וגורמים גנטיים ספציפיים בפיברובלסטים. מודלים של עכברים חיוניים להבנת התורמים לצמיחת הגידול ולהתקדמות בהקשר in vivo. כאן, פרוטוקול שבו תאים סרטניים מעורבבים עם פיברובלסטים ומוכנסים לעכברים לפתח גידולים מסופקים. גודל הגידול לאורך זמן ומשקלי הגידול הסופיים נקבעים ומושווים בין קבוצות. הפרוטוקול המתואר יכול לספק תובנה נוספת לגבי התפקיד התפקודי של CAFs בגדילה ובהתקדמות של גידולים.

Introduction

בתוך המיקרו-סביבה של הגידול, אחד מסוגי התאים הבולטים ביותר הוא הפיברובלסט הקשור לסרטן (CAF)¹. פיברובלסטים אלה הקשורים לקרצינומה יכולים למלא תפקיד מדכא גידול ^2,3. לדוגמה, פיברובלסטים המבטאים S100A מפרישים קולגנים שיכולים לעטוף חומרים מסרטנים ולהגן מפני היווצרות קרצינומה⁴. יתר על כן, דלדול של שריר α חלק אקטין (SMA) חיובי myofibroblasts בסרטן הלבלב גורם לדיכוי חיסוני ומאיץ את התקדמות סרטן הלבלב². CAFs יכולים גם להתפתח יחד עם תאים סרטניים ולקדם את התקדמות הגידול 5,6,7,8. פיברובלסטים יכולים לסנתז ולהפריש חלבוני מטריצה חוץ-תאיים היוצרים סביבה מקדמת גידול⁸. חלבוני מטריצה חוץ-תאיים אלה יכולים לגרום להתקשות מכנית של הרקמה, אשר קשורה להתקדמות הגידול ^9,10. המטריצה החוץ-תאית השוקעת יכולה לשמש כמחסום פיזי המעכב חדירה חיסונית¹¹. שקיעת מטריקס על ידי CAFs נקשרה גם לפלישת גידולים מכיוון שפיברונקטין שנוצר על ידי CAFs הוכח כמקדם פלישה לגידול¹². CAFs מקדמים אנגיוגנזה ומגייסים תאים מדכאי חיסון למיקרו-סביבה של הגידול על ידי הפרשת גורם גדילה-β (TGF-β), גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF), אינטרלוקין-6 (IL-6) וליגנד CXC-כימוקין 12 (CXCL12)^13,14,15. בגלל תפקידם המרכזי בקידום צמיחת הגידול, פיברובלסטים הקשורים לסרטן הם יעד מתפתח לטיפול אנטי סרטני 6,16,17,18.

הפרוטוקול שלהלן מתאר שיטה לבדיקת האופן שבו פיברובלסטים משפיעים על צמיחת גידולים במודל עכברי מבוסס ונפוץ של צמיחת גידולים. על מנת להבין את חשיבותם של פיברובלסטים במיקרו-סביבה של הגידול, שונה הפרוטוקול הסטנדרטי להחדרת תאים סרטניים לעכברים כדי לעקוב אחר גדילתם כך שיכלול פיברובלסטים עם החדרת התאים הסרטניים. התאים הסרטניים יכולים להיות הציג תת עורית או intradermally. החדרה תוך עורית תגרום לגידולים הנובעים מהעור עצמו. Xenografts שבו תאים סרטניים ופיברובלסטים מוזרקים במשותף לעכברים מייצגים כלי מתודולוגי חשוב לניתוח התפקיד של פיברובלסטים, תת-אוכלוסיות של פיברובלסטים וגורמי חלבון ביכולת לקדם צמיחת סרטן 19,20,21. פרוטוקול מפורט להזרקה משותפת של תאים סרטניים ופיברובלסטים לעכברים מסופק. שיטה זו יכולה לשמש להשוואת נוכחות או היעדר פיברובלסטים, להשוואת פיברובלסטים ממקורות שונים²⁰, או להשוואת פיברובלסטים עם וללא ביטוי של חלבונים ספציפיים¹⁹. לאחר החדרת התאים הסרטניים והפיברובלסטים, ניתן לעקוב אחר גודל הגידול לאורך זמן. בתום הניסויים ניתן לנתח ולשקול גידולים. על ידי מעקב אחר צמיחת הגידול לאורך זמן, ניתן לנתח את חשיבותם של גורמים שונים.

ישנן גישות חלופיות אפשריות לחקר תפקידם של פיברובלסטים בצמיחת גידולים. לדוגמה, ישנם מודלים מבוססי Cre-loxed המספקים נוקאאוט ספציפי לרקמות של גנים עם מניעים המתבטאים באופן מועדף בפיברובלסטים. גישות כאלה מספקות גם הזדמנויות לחקור את תפקידם של גנים ומסלולים ספציפיים בפיברובלסטים להתקדמות הגידול. בהשוואה לגישות מבוססות Cre-lox, הפרוטוקול שסופק ייצג גישה מהירה יותר באופן משמעותי לניטור תפקידם של פיברובלסטים מכיוון שצמיחת הגידול תנוטר במשך מספר שבועות בלבד. הגישה המסופקת היא גם זולה משמעותית מכיוון שהיא אינה דורשת ייצור ושיכון מושבות של עכברים מהונדסים גנטית. הפרוטוקול המסופק יכול לשמש לבדיקה מהירה של ההשפעה של הפלת גנים שונים באמצעות shRNA במקום צורך לפתח מושבות עכברים. הגישה המסופקת היא גם גמישה יותר מכיוון שהיא תאפשר השוואה של מספרים שונים של פיברובלסטים, יחסים שונים של תאים סרטניים ופיברובלסטים, הפלת גנים שונים, ואפילו השוואה של פיברובלסטים מאתרי רקמות או מינים שונים. לגישת Cre-lox יהיה יתרון בכך שהפיברובלסטים נמצאים בתוך העכברים בהקשר פיזיולוגי יותר.

הפרוטוקול המדווח כאן יהיה בעל ערך עבור מדענים המבקשים לעקוב אחר ההשפעות של פיברובלסטים על צמיחת הגידול במהירות ובאופן חסכוני. פרוטוקול זה חשוב במיוחד עבור מדענים החוקרים תת-קבוצות שונות של פיברובלסטים או פיברובלסטים ממקורות שונים על צמיחת הגידול על צמיחת הגידול. אם חשוב שהתחלת הגידול תתרחש בהקשר פיזיולוגי, יש לשקול מודלים של עכברים מהונדסים גנטית.

ישנן מספר גישות אפשריות לביצוע ניסויים אלה. עכברים בעלי כשירות חיסונית יכולים לשמש כפונדקאים, מה שיאפשר חקירה של אינטראקציות פיברובלסטיות-חיסוניות בין תאים. עבור מודלים של עכברים בעלי כשירות חיסונית, יש להזריק תאי סרטן עכבר ופיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs). השימוש ב-MEFs גם מאפשר לחוקר לנצל את המגוון הרחב של זני עכברי נוקאאוט כדי לבדוק את נוכחותו או היעדרו של גן מעניין. לחלופין, ניתן להשתמש בעכברים עם חסר חיסוני כדי לבחון את תפקידם של פיברובלסטים אנושיים בקידום הצמיחה של גידולים בעכברים שמקורם בתאים סרטניים אנושיים. החדרת התאים הסרטניים יכולה להתבצע באופן תת עורי או אורתוטופי. עבור מלנומה, כפי שיתואר להלן, ניתן להזריק את תערובת הגידול-פיברובלסטים תוך עורית להזרקה אורתוטופית המדמה באופן הדוק יותר את המיקום בתוך העור שבו תתפתח מלנומה.

Protocol

כל הניסויים המתוארים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס.

הערה: בחר תאים סרטניים ופיברובלסטים המתאימים לעכברים המארחים עבור זן עכבר. בחר תאים סרטניים ופיברובלסטים המתאימים למין העכבר המארח. להשיג עכברים ממושבות רבייה או לרכוש אותם מספקים מכובדים. הכניסו גידולים לעכברים בני ~8-10 שבועות. עכברים עם פרווה יהיו בשלב הטלוגן או המנוחה של מחזור זקיק השערה. תכננו יחס של 0.5 עד 3 פיברובלסטים לתאים סרטניים.

1. לקבוע את המספר המתאים של עכברים שישמשו לניסויים

1. לפני ביצוע המחקרים, בצע ניתוח כוח כדי לקבוע את המספר המתאים של עכברים לשימוש במחקרים. השתמש בנוסחה הבאה כדי לקבוע את גודל הדגימה עבור ניסוי בעוצמה שצוינה:
   n = (Z(_1-α/2)+Z_(1-β)/ES₎₂
   אם α היא רמת המשמעות שנבחרה (בדרך כלל 0.05), אז 1-α/2 = 0.975 ו- Z=1.960.
   β הוא הכוח ואם רוצים 80% כוח, אז Z=0.84.
   
   ES, גודל האפקט = \μ_{1-μ 0}\/σ
   כאשר μ 0 הוא הממוצע תחת השערה H₀, μ 1 הוא הממוצע תחת השערה H₁, ו- σ הוא סטיית התקן של תוצאת הריבית²².
   הערה: מידע נוסף על חישוב גודל מדגם^{ניתן למצוא 22}.

2. ליצור תאים סרטניים להזרקה

1. קבע את קצב הצמיחה הרלוונטי באמצעות המשוואה הבאה:
   Gr = (ln (N(t)/N(0)))/t
   
   הערה: מוצגת דוגמה עבור תאים המכפילים את עצמם תוך 24 שעות
   זמן הכפלה = ln(2)/קצב צמיחה
   24 שעות = ln(2)/קצב צמיחה
   24*קצב צמיחה = 0.693
   קצב צמיחה = .693/24= .028875
2. לקבוע את מספר התאים הסרטניים צלחת ואת כמות הזמן התאים צריך להיות גדל לפני ההזרקה.
   הערה: 0.25-1 מיליון תאים סרטניים מוזרקים עבור כל גידול שנוצר.
3. חישוב מספר הימים הדרושים ליצירת מספר מספיק של תאים בהתאם למשוואה
   N(t)=N(0)e^gr*t
   כאשר N(t) הוא מספר התאים בזמן t, N(0) הוא מספר התאים בזמן 0, gr הוא קצב הצמיחה ו- t הוא הזמן.
   הערה: דוגמה לחישובים אלה לגידול 500,000 תאים כדי לייצר 10⁶ תאים לכל אחד מ-12 גידולים. בהתבסס על חישובים אלה, 5 ימים מספיק כדי להגדיל את המספר הדרוש של תאים:
   N(t)=N(0)e^gr*t
   12 x 10⁶ = 500,000e^(gr*t)
   12 x 10⁶=500,000e^(.028875*t)
   24=e^(.028875*x)
   ln(24)=0.028875x
   3.178=0.028875x
   X=110 שעות= 4.59 ימים
   אפשר זמן נוסף לתאים להיצמד לצלחת ולתאים שאבדו במהלך האיסוף.
4. תאי סרטן צלחת.
   הערה: יש ללבוש כפפות ומעילי מעבדה בעת עבודה עם תאים בתרבית.
   הערה: בצע מניפולציות תאים במכסה מנוע של זרימה למינרית כדי למזער את החדרת המיקרובים מהאוויר לדגימות. יש לטפל בתרבית הרקמה באור אולטרה סגול לפני השימוש. השתמש בטכניקה סטרילית ורק בכלי פלסטיק ובחומרים מתכלים בתרבית תאים סטרילית כגון צלחות המטופלות בתרבית רקמות, פיפטים ושפופרות חרוטיות.
   1. חשב את המספר והגודל הנכונים של לוחות תרבית רקמה בהתבסס על מספר התאים בבקבוקון וריכוז התאים הרצוי לאחר הציפוי.
   2. תייגו צלחות תרבית רקמות.
   3. הכינו אמבט מים עם מים ב 37 °C (77 °F).
   4. Aliquot בינוני לתוך צינורות חרוטי ומניחים באמבט מים ב 37 °C (77 °F). ניתן לגדל תאים סרטניים רבים במדיום הנשר המעובד (DMEM) של דולבקו בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS).
   5. הסר את המספר הנדרש של בקבוקונים של תאים קפואים ממקפיא חנקן נוזלי.
      הערה: יש להשתמש בכפפות הקפאה בעת טיפול בתאים במקפיא חנקן נוזלי.
   6. הפשירו במהירות את בקבוקוני התא באמבט המים תוך כדי ניעור עדין.
      הערה: יש להוסיף אתנול לכפפות בזמן הטיפול בבקבוקונים כדי לשמור על סטריליות.
   7. באמצעות טכניקה סטרילית במכסה מנוע תרבית רקמה, צינורות את התאים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של DMEM + 10% FBS.
   8. צנטריפוגה את תערובת התאים ב 180 x גרם במשך 5 דקות.
   9. מוציאים בעדינות את הסופרנאטנט עם יניקה סטרילית או פיפט סטרילי של 10 מ"ל.
   10. בעדינות להשעות את התאים בגלולה לתוך 1 מ"ל של DMEM + 10% FBS.
   11. יש להצמיד את התאים המרחפים מחדש לצלחת תרבית רקמה מסומנת עם p1000 סטרילי.
   12. בעזרת פיפטים סטריליים של 10 מ"ל, מזרימים מדיום עם סרום לתוך צלחות תרבית רקמות.
   13. לדגור על צלחות תרבית רקמה באינקובטור תרבית רקמה ב 37 ° C עם 5% CO₂.
5. להרחיב תאים סרטניים כדי לייצר מספיק תאים סרטניים להזרקה.
   הערה: נטר תאים באמצעות מיקרוסקופ אור למפגש. טריפסינזה כל יומיים-שלושה או לפי הצורך כדי למנוע מהתאים להגיע למפגש של 100%. אם נדרש מספר גדול של תאים, השתמש בהיפר-צלוחיות (טבלה של חומרים) כדי לגדל מספר גדול של תאים בצורה יעילה במרחב וביעילות בינונית. בכל פעם שיש צורך להעביר את התאים, בצע הליך זה:
   1. מוציאים את המדיום מהצלחת עם יניקה סטרילית או פיפט סטרילי של 10 מ"ל.
   2. שטפו בעדינות את הצלחת על ידי פיפט על מלח חם חוצץ פוספט (PBS). לאחר מכן הסר את PBS עם יניקה סטרילית או פיפט.
   3. Pipet 5 מ"ל של 1x חומצה טריפסין-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ב PBS עבור צלחת 10 ס"מ על התאים לדגור במשך 5 דקות ב 37 ° C.
   4. הוציאו תאים מהצלחת בברזים עדינים כדי לעקור את התאים מהצלחת.
   5. באמצעות פיפט סטרילי של 10 מ"ל, לאסוף את התאים לתוך DMEM עם סרום FBS 10% בצינורות חרוטיים.
   6. צינורות חרוטיים צנטריפוגות ב 180 x גרם במשך 5 דקות.
   7. מוציאים את הסופרנאטנט על ידי שפיכתו. גלולת התא צריכה להיות גלויה. צפה בו כדי לוודא שהוא נשאר בצינור.
   8. להשעות מחדש את התאים גלולות על ידי הוספת 1 מ"ל של DMEM + 10% FBS ו pipeting למעלה ולמטה בעדינות.
   9. Aliquot תאים מושעה מחדש על לוחות תרבית רקמה חדשים בגודל המתאים עם DMEM + 10% FBS (10 מ"ל של מדיה מתאים צלחת תרבית רקמה 10 ס"מ).

3. לייצר פיברובלסטים להזרקה

הערה: פיברובלסטים ראשוניים יזדקנו לאחר יותר מדי הכפלות/מעברים. חשוב להשתמש בפיברובלסטים ראשוניים לאחר מספר מוגבל של מעברים או הכפלות. עקוב אחר מספר המעברים או ההכפלות שהפיברובלסטים גדלו מהעכבר או מעור האדם. השתמש פיברובלסטים עם פחות מ -15 מעברים עבור פיברובלסטים עוריים אנושיים ראשוניים. השתמש fibroblasts עם פחות מ 9 מעברים עבור פיברובלסטים עובריים עכבר. פיברובלסטים משתנים כאשר הם מתמזגים. טריפסיניזציה של הפיברובלסטים כאשר הם כ 90% confluent. לפיברובלסטים יהיו תכונות שונות בהתאם לאופן שבו הם מתורבתים. מדענים רבים מקדמים גידול על מצעים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית מאשר לוחות תרבית רקמות, כגון מטריצות קולגן תלת-ממדיות, אשר לוכדות ביעילות רבה יותר סביבות דמויות רקמה^23,24,25.

1. השתמש במשוואה בסעיף 2.1 כדי לקבוע את קצב הגידול של תאי הפיברובלסט.
2. השתמש במשוואה בסעיף 2.2 כדי לקבוע את מספר הימים הדרושים להרחבת הפיברובלסטים.
3. צלחת את הפיברובלסטים כמתואר בסעיף 2.3 באמצעות המדיום המתאים ביום המתאים כדי להבטיח שתאים סרטניים ופיברובלסטים יהיו מוכנים להזרקה באותו יום.
4. הרחב את הפיברובלסטים בתווך המתאים כדי ליצור מספר מספיק של פיברובלסטים הדרושים בהתאם להליכים המתוארים בסעיף 2.4.

4. לגלח עכברים כדי להכין עכברים להזרקה

הערה: יש ללבוש מעילי מעבדה, רשתות שיער, כיסויי נעליים וכפפות בעת עבודה עם עכברים.

1. יום עד יומיים לפני ההזרקה, בהתאם לכללי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים, מרדימים את העכברים. אם משתמשים באיזופלורן להרדמה, יש להשתמש בתערובת של איזופלורן ו-O₂. הכניסו את העכברים לתא הרדמה והכניסו תערובת איזופלורן (5%)/ O₂ להשראת הרדמה. לאחר מכן, הניחו את חרוט האף על בעל החיים המורדם כדי לשמור על מישור ההרדמה הכירורגי עם זרימה קבועה של תערובת איזופלורן (2%)/O₂ .
2. בדוק את בעלי החיים כדי לוודא שהם נמצאים במישור הכירורגי המתאים של הרדמה על ידי צביטת בוהן העכבר ואישור העכבר אינו זז.
3. באמצעות קוצץ בעלי חיים עם להב כירורגי #40, להסיר בעדינות את הפרווה מן המיקומים המתאימים על צידי העכברים על ידי העברת קוצץ החיות על העור מספר פעמים עד הפרווה מוסרת.
4. עקוב אחר העכברים עד שהם מתאוששים מההרדמה.

5. הכינו תאים סרטניים ופיברובלסטים להזרקה

הערה: יש להזריק תאים סרטניים ופיברובלסטים בהקדם האפשרי לאחר האיסוף, רצוי תוך 30 דקות. בבוקר ההזרקה, קצרו את התאים הסרטניים והפיברובלסטים בנפרד מצולחות תרבית הרקמה. עבור כל סוג תא, בצע את השלבים הבאים:

1. מוציאים את המדיום מצלחת תרבית הרקמה עם יניקה סטרילית עדינה או על ידי פיפטוף מהמדיום.
2. צינור בעדינות על 5 מ"ל של PBS מבלי להפריע לתאים. מערבלים את PBS. שאפו בעדינות את PBS עם יניקה או צינור מה-PBS.
3. יש לצנרת בעדינות 5 מ"ל של טריפסין-EDTA ב-PBS על שכבת התאים ולדגור במשך 5 דקות ב-37°C.
4. הסר תאים מהצלחת בהקשות עדינות כדי לעקור את התאים. Pipet את התאים מספר פעמים עם צינור 10 מ"ל ולהעביר את התאים לצינור חרוטי המכיל DMEM עם 10% FBS.
5. צנטריפוגה את צינורות חרוט ב 180 x גרם במשך 5 דקות.
6. הסר את supernatant על ידי מזיגה עדינה אותו, שמירה על גלולת התא. שטפו את גלולת התא פעמיים עם PBS. בכל פעם, צינור 10 מ"ל של PBS על התאים. מערבבים בעדינות עם פיפט p1000.
7. צנטריפוגה את התאים כמו בשלב 5.5. הסר בעדינות את PBS עם פיפטה וחזור על הפעולה.
8. להשעות מחדש את התאים שטופים, גלולה ב 1 מ"ל של PBS עם p1000.
9. נקו מגלשת המוציטומטר עם אלכוהול וייבשו.
10. Pipet 100 μL של תערובת התאים לתוך צינור ולהוסיף 400 μL של 0.4% Trypan כחול עבור ריכוז סופי Trypan כחול של 0.32%.
11. ממלאים בעדינות את התאים של המוציטומטר זכוכית מתחת למכסה על ידי פיפטציה של תערובת התאים עד שהחדר מלא.
12. באמצעות מיקרוסקופ, התמקדו בקווי הרשת של מטרה פי 10.
13. ספור את התאים החיים, הלא מוכתמים והתאים הכחולים בקבוצה אחת של 16 ריבועים.
14. ספרו את כל 4 הסטים של 16 ריבועים.
15. ממוצע של ספירת התאים עבור התאים השקופים והכחולים מתוך 4 קבוצות של 16 ריבועים והכפל ב- 10,000. מכפילים ב-5 כדי לתקן את הדילול של 1:5 מכחול טריפאן.
16. הספירות הסופיות הן הריכוז בתאים/מ"ל עבור התאים החיים והמתים. הכפל בנפח כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים סרטניים ופיברובלסטים. אשר כי חלק התאים כי הם קיימא הוא >80%.
17. ודא שיש מספר מספיק של תאי מלנומה ופיברובלסטים לכל הזריקות המתוכננות, בהנחה של אובדן דגימה של לפחות 20% במהלך הזריקות.
18. מעבירים את מספר התאים הנדרש לצינור חרוטי חדש ומטילים את התאים בצנטריפוגה (180 x גרם למשך 5 דקות).
19. מוציאים את supernatant עם pipet 10 מ"ל.
20. יש להשהות מחדש את הגלולה בריכוז הנדרש בכמות המתאימה של PBS בדרגת פרמקופיאה אמריקאית (50 מיקרוליטר לגידול להזרקה תוך עורית ו-100 מיקרוליטר לגידול להזרקה תת-עורית).

6. הזריקו תאים סרטניים ופיברובלסטים לעכברים

הערה: אם אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים, הזריקו שני גידולים לכל עכבר, אחד בכל צד. אקראי איזה עכבר יקבל איזו זריקה בצד ימין ושמאל. בהתאם למספר העכברים שיש להזריק, מרדימים את העכברים ומזריקים תאים סרטניים ופיברובלסטים לעכברים בקבוצות.

1. להזרקה תת עורית של תאים סרטניים
   1. מרדימים עכברים כמתואר בסעיף 4.1.
   2. נגבו את העור המגולח במקלוני אלכוהול.
   3. ממלאים מזרק סטרילי בנפח הרצוי של תאים או תערובת תאים ומכסים את המזרק במחט של 27 מד.
      הערה: ודא שאין בועות אוויר. יש להעיף את המזרק לפי הצורך כדי להסיר בועות. לאחר הכנסת התאים למזרק, יש לשמור על התאים בתוך המזרקים מעורבבים היטב על ידי היפוך רציף של המזרקים כדי למנוע התגבשות.
   4. הכנס את המחט לאזור התת עורי בצלע העכבר והזריק בעדינות את התאים לעכבר. יש להשתמש בתרחיף תאים של 100 μL לכל גידול להזרקה תת עורית (לא מומלץ להשתמש בנפח מעל 100 μL לכל הזרקה).
   5. עקוב אחר העכברים עד שהם מתאוששים מההרדמה. במידת הצורך, ספקו לעכברים חומרי בידוד נוספים כמו בקתות ו / או כריות חימום כדי לעזור לעכברים להחלים לחלוטין.
2. עבור זריקות intradermal של תאים סרטניים
   1. מרדימים עכברים כמתואר בסעיף 4.1.
   2. נגבו את העור המגולח במקלוני אלכוהול.
   3. ממלאים מזרק סטרילי בנפח הרצוי של תאים או תערובת תאים ומכסים את המזרק במחט של 27 מד.
      הערה: ודא שאין בועות אוויר. יש להעיף את המזרק לפי הצורך כדי להסיר בועות. לאחר הכנסת התאים למזרק, יש לשמור על התאים בתוך המזרקים מעורבבים היטב על ידי היפוך רציף של המזרקים כדי למנוע התגבשות.
   4. הכנס מחט באורך 27 מד לאזור התוך-עורי של העור בצלע העכבר והזריק בעדינות את התאים לאזור התוך-עורי בעכבר. יש להשתמש בתרחיף תאים של 50μL לכל גידול להזרקה תוך עורית (לא מומלץ להשתמש בנפח העולה על 50 μL לכל הזרקה).
   5. עקוב אחר העכברים עד שהם מתאוששים מההרדמה. אם יש סימנים לכך שהעכברים נמצאים במצוקה, יש להתייעץ עם וטרינר. במידת הצורך, ספקו לעכברים חומרי בידוד נוספים כמו בקתות ו / או כריות חימום כדי לעזור לעכברים להחלים לחלוטין.

7. עקוב אחר עכברים במהלך צמיחת הגידול

1. עקבו אחר עכברים מדי יום לאיתור סימני כאב או מצוקה (יציבה כפופה, התפתלויות, השמעת קולות, התמתחות לאורך הכלוב, הצמדת הבטן לתחתית רצפת הכלוב או חוסר רצון לנוע בכלוב) או היווצרות מורסה. אם יש סימנים לכך שהעכברים נמצאים במצוקה, יש להתייעץ עם וטרינר.
2. לאחר היווצרות הגידולים, מדדו את נפח הגידול בערך כל יומיים-שלושה. מדדו את אורך הגידול (הצד הארוך ביותר) ואת רוחבו (בניצב לאורך) בעזרת קליפרים.
   הערה: שיטות עבודה מומלצות הן שאותו אדם יבצע מדידות אלה במהלך הניסוי כדי להפחית את השונות בנתונים. לצורך מדידות, יש להרדים עכברים כמתואר בסעיף 4.1
3. חשב נפחי גידול באמצעות הנוסחה נפח = 0.5 x (אורך x רוחב²).

8. קצירת גידולים ומדידת משקלי הגידול

1. המתת חסד של עכברים כאשר הגידול מגיע לנקודת קצה ניסיונית שהוקמה על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של המוסד. הניחו עכברים בתא והרדימו אותם עם תזוזה איטית (20-30% לדקה) של אוויר התא עם CO₂ דחוס למשך דקה אחת לאחר הפסקת הנשימה.
2. לבצע נקע צוואר הרחם על העכברים. יש לרסן את המכרסם על משטח יציב ושטוח. הניחו עט קשיח או חפץ אחר על העורף בבסיס הגולגולת. דחפו במהירות קדימה ולמטה כשהאובייקט מרסן את הראש תוך משיכה לאחור כשהיד אוחזת בבסיס הזנב. אשר במישוש כי חוט השדרה נקטע.
   הערה: פריקת צוואר הרחם צריכה להתבצע על ידי אנשי מעבדה מנוסים.
3. עבור כל עכבר בניסוי, ודא שהעכבר כבר אינו בחיים על ידי בדיקה שאין נשימה, אין דופק ואין תגובה לצביטת בוהן.
4. באמצעות אזמל סטרילי ומספריים כירורגיים, להוציא את הגידול כולו מן העכבר. בעזרת מספריים כירורגיים, חותכים רקמה שאינה גידולית מהגידול.
5. לשקול את הגידול על איזון אנליטי ולרשום את משקל הגידול.

9. ניתוח סטטיסטי של נפחי הגידול ומשקלי הגידול

1. השווה את נפחי הגידול לאורך זמן בכל קבוצה עם ניתוח מדדים חוזרים ונשנים של שונות (ANOVA). בצע ניתוח זוגי אם הוזרקו שני גידולים לכל עכבר.
2. השווה את משקלי הגידול בין הקבוצות עם ANOVA באמצעות בדיקה דו-זנבית. לאחר מכן ניתן להשתמש במבחן הפוסט-הוק של טוקי כדי לקבוע אילו קבוצות שונות זו מזו באופן משמעותי. בצע ניתוח זוגי אם הוזרקו שני גידולים לכל עכבר.

תוצאות

תאי מלנומה אנושיים A2058 ופיברובלסטים עוריים אנושיים ראשוניים גודלו בתרבית בתנאים סטריליים. התאים נאספו ונשטפו שלוש פעמים עם PBS. עכברים מדוכאי חיסון (NU/J - Foxn1 nude strain) הוזרקו תת עורית על צד אחד עם 0.25 מיליון תאי מלנומה A2058 בלבד. בצד השני הוזרקה לעכברים תערובת של 0.25 מיליון תאי מלנ...

Discussion

בניסוי באיור 1, החדרה משותפת של פיברובלסטים עוריים אנושיים עם תאי מלנומה אנושיים מסוג A2058 הביאה לגידולים גדולים יותר מאשר כאשר תאי המלנומה הוצגו ללא פיברובלסטים בהזרקה משותפת. הבדל זה יכול להיות מזוהה בקלות על סמך נפח הגידול ומשקל הגידול. התוצאות עולות בקנה אחד עם דיווחים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
26G Needles	Fisher Scientific	14-826-10
Alcohol swabs	Fisher Scientific	326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40	WAHL Professional	8787-450A
Athymic nude mice (NU/J)	The Jackson labs	002019	These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells	ATCC	ATCC® CRL-11147™	This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks	Fisher Scientific	14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g	Fisher Scientific	14-432-22
Countess Cell Counting Chamber	Fisher Scientific	C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	11965-118
Fetal bovine serum	Fisher Scientific	MT35010CV
Fibroblasts	ATCC	PCS-201-012	We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice	Fisher Scientific	50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet	Celltreat	667210B
Sterile 5 ml serological pipet	Celltreat	229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns	Fisher Scientific	09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	15400054
Sterile tissue-culture grade PBS	Fisher Scientific	50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet	Celltreat	667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes	Genesee Scientific	25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes	Genesee Scientific	25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes	Genesee Scientific	25-260
Trypan blue	Fisher Scientific	C10228