في تقييم vivo من إزالة المخاطية في الفئران

Summary

في هذا المنشور، نحن وصف بروتوكولات لتقييم إزالة مخاطية مجرى الهواء (MCC) في الفئران في الجسم الحي باستخدام طريقة مزدوجة النويدات المشعة التصوير. تم تصميم هذا البروتوكول لانبعاثات الفوتون واحد التصوير المقطعي (SPECT) والتصوير المقطعي المحوسب (CT) بروتوكول اقتناء باستخدام الماوس كله الجسم (MWB) collimators في نظام مزدوج SPECT / CT.

Abstract

الأهداب المتحركة التنفسية، العضيات المتخصصة في الخلية، خط سطح الظهارية للخلايا الظهارية بطانة الجهاز التنفسي. من خلال الضرب بطريقة الميثاكرونا، المتزامن، هذه العضيات المتعددة، المتحركة، القائمة على actin تولد تدفق سائل سيبالاد تطهير الجهاز التنفسي من الملوثات المستنشقة ومسببات الأمراض. مع زيادة التلوث البيئي، ومسببات الأمراض الفيروسية الجديدة والبكتيريا الناشئة المقاومة للأدوية المتعددة، أهداب ولدت إزالة المخاطية (MCC) أمر ضروري للحفاظ على صحة الرئة. كما تعاني مؤسسة تحدي الألفية من الاكتئاب في العديد من الاضطرابات الخلقية مثل خلل التنسج الأولي والتليف الكيسي وكذلك الاضطرابات المكتسبة مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن. وقد أنشأت كل هذه الاضطرابات، في بعض الحالات نماذج متعددة، الماوس. في هذا المنشور، نحن بالتفصيل طريقة باستخدام كمية صغيرة من النشاط الإشعاعي والطرائق المزدوجة SPECT / التصوير المقطعي لقياس بدقة وتكرار قياس MCC في الفئران في الجسم الحي. تسمح هذه الطريقة باسترداد الفئران بعد التصوير ، مما يجعل القياسات التسلسلية ممكنة ، واختبار العلاجات المحتملة طولياً مع مرور الوقت. وتوضح البيانات في الفئران البرية إمكانية استنساخ قياس مؤسسة تحدي الألفية ما دام يتم إيلاء الاهتمام الكافي بالتفاصيل، والالتزام الصارم بالبروتوكول.

Introduction

أهدا هي microtubule القائم على الأجهزة الخلوية المحفوظة عبر التاريخ التطوري من الطحالب إلى البشر. وهي تنبثق من أسطح الخلايا ولها عدد من الوظائف¹، تتراوح من التعرف على الإشارات الحسية البيئية المحلية إلى الحركة ، والوظائف التي يمكن إرجاعها من البشر إلى الكائنات أحادية الخلية أحادية الخلية^2،3. ويمكن أن تكون الإهداب غير مُلَلَّة وفردية تعمل كهوائي متخصص في الخلية لمعالجة الإشارات البيئية؛ أو العليل ومتعدد، الضرب في موجات متزامنة، ميتاكرونال لتوليد تدفق السوائل، مثل بطانة قناة فالوب والسلال العلوية والسفلية، باستثناء القصبات الطرفية المؤدية إلى الحويصلات الهوائية^1،2.

يتعرض السطح الظهاري الواسع لجهاز التنفس لوابل مستمر من التلوث في شكل مجموعة متنوعة من الملوثات والمسببات المسببة للعدوى التي يمكن أن تكون خطرة، مما يستلزم الدفاع. آلية الدفاع الرئيسية هي الجهاز المخاطي لشجرة القصبة الهوائية ، حيث يتم نقل تدفق مستمر للمخاط المفرز ميكانيكيًا من مجرى الهواء عن طريق ضرب الإهداب المتحركة المتعددة التي تبطن الأسطح الطلية للخلايا الظهارية القصبية. هذه الوظيفة إلى الملوثات المستنشقة استنشاق، ومن خلال استمرارها، والضرب المتزامن، ونقلها cephalad^4،5.

وقد ثبت أن الإهداب لها أدوار رئيسية مثل في تطوير النقش بين اليسار واليمين في تطوير الأجنة، حيث الأهداب في العقدة الجنينية كسر التماثل⁶. وقد تم ربط الطفرات في الجينات المرتبطة أهداب لأمراض مثل أمراض القلب الخلقية (CHD) بسبب الهيكل غير المتماثل للقلب⁶. وقد أفادت الدراسات الحديثة وجود نسبة عالية من الخلل في الجهاز التنفسي في الجهاز التنفسي للمرضى الذين يعانون من أمراض القلب و العقوبة القلبية، فضلا عن زيادة انتشار مضاعفات الجهاز التنفسي بعد العملية والأعراض المزمنة في الجهاز التنفسي في الشعب الهوائية العليا والسفلى^7,8,9,10. المرضى الذين يعانون من مرض الاضطرابات التنفسية الحادة والخلل الوظيفي، مع أو بدون heterotaxy، وقد ثبت أن لديها زيادة خطر مضاعفات الجهاز التنفسي والنتائج السلبية في الجهاز التنفسي بعد العملية^{الجراحية 5,8,10}. وإلى جانب أدوارها في الإشارات والتنمية، فإن أهمية أهداب الهواء قد تجلت من خلال اعتلالات الطرق الهوائية، التي من الأمثلة الرئيسية على ذلك خلل التنسيل الأولي. PCD هو اضطراب خلقي ناتج عن عدد من الطفرات التي تؤثر على أهداب الجهاز التنفسي المتحرك ، مما يؤدي إلى التهابات الرئة المتكررة ، والتهاب القصبات ، وربما الحاجة إلى زرع الرئة¹¹. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن أهداب طبيعية في التليف الكيسي (CF)، الاضطرابات الخلقية الأكثر شيوعا في السكان القوقازيين، MCC هو ضعف بسبب سميكة، والمخاط اللزج الناتجة عن الطفرات في الجينات CFTR¹². هناك نماذج متعددة من الماوس من PCD وCF، فضلا عن عدد متزايد من نماذج CHD. في نهاية المطاف أهداب هي هياكل متعددة مع العديد من الأدوار الرئيسية، وطريقة لتقييم وظيفة الأهداب الجهاز التنفسي في الجسم الحي يمكن أن تكون ذات قيمة للدراسة قبل السريرية، وتقييم آثار الطفرات وكذلك الأدوية على إزالة المخاطية (MCC)¹³. وستكون هذه الطريقة أيضاً قيّمة في تقييم آثار الأدوية الجديدة أو العلاج الجيني أو التدخلات على مركز تحدي الألفية في نماذج الماوس هذه.

هناك العديد من النماذج المختلفة التي تم استخدامها لتقييم مؤسسة تحدي الألفية. أحد الطرق البارزة ينطوي على استخدام الصبغة الزرقاء الميثيلين التي تم غرسها في قصبات، مع إزالة تقاس قياس الألياف لحركة^{صبغ 14}. هذه الطريقة محدودة من خلال القدرة على مراقبة حركة الصبغة ، والتي هي أكثر روتينية في البشر مما كانت عليه في نماذج الماوس قبل السريرية. طريقة بارزة أخرى هي التصوير بالأشعة السينية على النقيض من الطور السنكروترون (PCXI) ، والتي يمكن استخدامها لتتبع الجسيمات الفردية في مجرى الهواء. هذا الأسلوب هو جديد نسبيا وليس من الممكن الوصول^15. هناك العديد من الطرق السابقة vivo لتقييم مجرى الهواء عن طريق استئصال القصبة الهوائية لتصوير الفيديو، ولكن هذه النماذج توفر فائدة تذكر في المرضى الإنسان¹⁶. تقنيات عالية الدقة للتصوير أهداب مثل التصوير المقطعي التناسق البصري محدودة بنفس الطريقة¹⁷.

في هذه المقالة، نقدم طريقة استنساخها لقياس MCC في الجسم الحي الذي تم استخدامه لقياس عمليات إزالة الرئة في نماذج حيوانية لا تعد ولا تحصى، وكذلك دراسة مؤسسة تحدي الألفية في مرض الانسداد الرئوي المزمن وتقييم آثار الأدوية المثبطة للمناعة^18،19. هذه الطريقة تتعقب إزالة المستحضرات الصيدلانية الإشعاعية ^99mالتكنيتيوم والكبريت الغروانية^(99mTc-Sc)، وهو جهاز جسيمات غير قابل للذوبان، بعد تقطير في الرئتين. ويمكن بعد ذلك تعقب النويدات المشعة باستخدام الفوتون واحد الانبعاثات التصوير المقطعي المحسوبة (SPECT)^18،20. لقد قمنا بزيادة صقل هذه التقنية لقياس MCC باستخدام تقنية مزدوجة SPECT والتصوير المقطعي المحوسب (CT) مع التعريب المشترك لأحصاء النظائر المشعة إلى الرئتين وقياس الانخفاض في هذه العد على مدى 6 ساعات. التصوير المزدوج الطريقة، مع التسجيل المشترك للصور CT وSPECT يسمح بتعريب دقيق من تعداد الإشعاع إلى منطقتنا من الاهتمام، الرئتين. على الرغم من أننا وصفنا بالتفصيل طريقة قياس MCC في الفئران ، يمكن تعديل البروتوكول لدراسة MCC في الفئران. سوف تحتاج إلى تعديل collimators فضلا عن جرعة الإشعاع. في رأينا ، فإن مسح الماوس MCC أكثر صعوبة من الناحية الفنية بسبب صغر حجم الحيوان ، ولكنه أكثر فائدة من الفئران بسبب العدد الكبير من نماذج الماوس الراسخة لعدد من الاضطرابات البشرية. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لانخفاض تكلفتها وتكلفة صيانتها في مستعمرات الحيوانات ، فإن حجم العينة الأكبر هو أكثر جدوى في الفئران.

Protocol

وافقت لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها التابعة لجامعة بيتسبرغ على جميع البروتوكولات الحيوانية المحددة في هذا المنشور قبل إجراء أي من هذه التجارب الحيوانية.

ملاحظة: هذا البروتوكول تفاصيل كيفية تنفيذ في دراسات إزالة المخاطية الجسمية باستخدام التصوير النويدية المشعة مع جهاز مزدوج الطرائق SPECT / CT الماسح الضوئي. التقنيات التي أظهرت هي معايرة النظام تشغيل، الفئران تخدير، التنبيب القصبي من الفئران، غرس النظائر في الرئتين، والتصوير مزدوجة الطريقة، والتسجيل المشترك لهذه الصور، والتحليل.

1. SPECT / CT نظام الإعداد

1. تصميم سير عمل مناسب وإعداد قبل تشغيل التجارب باستخدام الحيوانات الحية.
   1. استخدام اقتناء SPECT يتكون من 60 إسقاطاً بحجم خطوة 6^س بين الإسقاطات مع دائرة نصف قطرها 40 سم من الدوران. وتتألف عملية اقتناء التصوير المقطعي من 220 إسقاطات بزاوية 1.6^س بين الإسقاطات.
2. تأكد من أن النظام يحتوي على التكريمات MWB الصحيحة للفئران والتصوير SPECT في المكان. إذا تم تثبيت collimators غير مناسب استخدام معالج الcollimator لتثبيت تلك الصحيحة.
3. قم بتشغيل معايرات النظام الضرورية لإعداد النظام للاستخدام.
   ملاحظة: تحتاج مكونات SPECT و CT الخاصة بالماسح الضوئي إلى المعايرة. معايرة مكونات التصوير المقطعي باستخدام تكييف المصدر ومعايرة الظلام/ الضوء (D/L) مرة واحدة في اليوم، معايرة إزاحة المركز (COS) كل أسبوعين، وتقييم أجهزة الأشعة السينية كل شهر. مكونات SPECT تحتاج إلى معايرة مرة واحدة في السنة.
   1. لتقييم أجهزة الأشعة السينية، تحقق من مربع تقييم أجهزة الأشعة السينية أثناء معايرات الأشعة المقطعية(قائمة معايرة CT تكميلية).
   2. لتنفيذ تكييف المصدر، تحقق من مربع تهيئة المصدر "تنفيذ" أثناء معايرات CT(قائمة معايرة CT تكميلية).
   3. لإجراء معايرة D/L، تحقق من المربع D/L بجوار بروتوكول اقتناء الأشعة المقطعية المستخدم أثناء التجارب أثناء معايرة الأشعة المقطعية. ألغ تحديد جميع البروتوكولات الأخرى(قائمة معايرة CT تكميلية).
   4. لإجراء معايرة COS، استبدل السرير بأداة حلقة المعايرة، واضبط إعدادات نوع السرير لتطابق إعدادات التحكم في الحركة، وتحقق من مربع COS بجوار بروتوكول اقتناء الأشعة المقطعية المستخدم أثناء التجارب أثناء معايرات الأشعة المقطعية. ألغِ تحديد جميع البروتوكولات الأخرى(قائمة معايرة CT التكميلية، حلقة المعايرة التكميلية).

2. الزرع الماوس وتقطير

1. وزن الفئران ليتم مسحها ضوئيا. إذا كان المسح الضوئي ماوس متعددة، والعناية لوضع علامة على الفئران لأغراض تحديد الهوية باستخدام أساليب مثل لكم الأذن أو وضع علامات على الذيل.
2. تخدير الماوس باستخدام 1.5٪ isoflurane مع تدفق الغاز من 2 L / min O₂ في غرفة الغاز لمدة 5 دقائق لإنتاج التخدير من عمق كاف، حتى التنفس يبطئ إلى ~ 55-65 نفسا في الدقيقة ¹⁶ (الشكل 1A).
3. إزالة الماوس من الغرفة وتعليق من قبل القناطع الأمامية على موقف الاحتضان في 45^س المنحدر. تجهيز موقف الاحتضان مع مخروط الأنف لضمان تخدير الماوس أثناء النوبات (الشكل 1B).
4. ربط نهاية واحدة من سلك الألياف البصرية 50 ميكرومتر إلى مصدر الضوء والخيط 20- قياس كانينولا أكثر من ذلك باستخدام الأسلاك لتكون بمثابة دليل (الشكل 1C).
5. افتح فم الفأر واسحب اللسان إلى الأمام باستخدام ملقط حادة. إلقاء الضوء على سلك دليل واستخدامها لتصور الحبال الصوتية (الشكل 1D).
6. تمرير سلك دليل من خلال الحبال الصوتية بحيث السلك هو فقط وراء الحبال الصوتية ويستريح في القصبة الهوائية العليا. حرك 1 بوصة cannula إلى الأمام على طول السلك لntubate الماوس، وتمرير القنية عميقة بما فيه الكفاية بحيث محور منه هو ضد القطاعات الحيوانية (الشكل 1E). إزالة السلك ترك القنية في مكانها.
7. اختبار النوبلة عن طريق توصيل لفترة وجيزة كانولا مع إصبع والتحقق من وجود تغييرات في التنفس. توقف التنفس أو التنفس المتوتر أثناء توصيل والسرعة في التنفس عند الإفراج هي علامات على النوبات القصبية المناسبة. إذا لم يكن هناك أي تغيير في أنماط الجهاز التنفسي عند سد القنية، فإن هذا الأخير من المرجح في المريء.
8. إعداد 0.2 mCi من ^99mالكنيتيوم الكبريت الغروانية^(99mTc-Sc) في حجم 10 ميكرولتر، والميصة في القنية. السماح للماوس إلى استنشاقه تلقائيا في الرئتين أكثر من 1-2 دقيقة (الشكل 1F). إزالة كانولا قبل نقل الماوس إلى منصة الماسح الضوئي.
   ملاحظة: أعد النويدات المشعة وتصفيةها الكاردينال هيلث.

3. SPECT / التصوير المقطعي

1. نقل الماوس إلى البليت 25 مم مع مخروط الأنف وآمنة مع الشريط، مع الحرص على عدم الشريط الصدر والبطن بإحكام جدا لتجنب إضعاف التنفس. الحرص على إزالة أي علامات الأذن المعدنية المرفقة الماوس.
2. إعداد شبح مشع يتكون من 0.05 mCi في 200 ميكرولتر ووضع هذه الكمية في أنبوب PCR 0.2 مل. ضع الأنبوب عن طريق التسجيل على البليت تحت أسفل البطن من الماوس ، وتجنب التداخل مع الرئتين.
   ملاحظة: يستخدم الشبح لغرض المشاركة في تسجيل الصور CT وSPECT، فضلا عن التحكم السلبي لإزالة.
3. أدخل الماوس في نظام SPECT/CT، وحدد سير عمل التصوير، وقم بتشغيل الإعداد.
4. قم بإعداد تحديد موضع أجهزة الكشف على الماوس، وتشغيل سير عمل التصوير.
5. إعداد قفص للفئران التي تلقت النشاط الإشعاعي بعد العملية، مع وصول غير مقيد إلى الغذاء والماء، ووضع علامات واضحة باستخدام ملصق أمان الإشعاع.
6. عند الانتهاء من سير العمل، وإزالة الماوس من منصة التصوير، والسماح لها لاسترداد في القفص المعد لمدة 6 ساعات بين عمليات المسح (نهاية المسح 1 إلى بداية المسح 2) مع الإعلان libitum الوصول إلى الطعام والماء. 6 ح تم اختياره لأنه يتوافق مع الفترة الزمنية التي إزالة الخطية اعتمادا على وظيفة أهداب يجري مع إزالة القليل جدا من السنخية.
7. بعد 6 ساعات، إعادة تخدير الماوس والمسح الضوئي، جنبا إلى جنب مع الوهمية، وذلك باستخدام نفس سير العمل لقياس كمية النظائر مسح من الشعب الهوائية.
   ملاحظة: من الأهمية بمكان السماح للماوس بالتعافي كتخدير غير متقطع مع isoflurane لمدة 6 ساعات سيؤدي إلى تأثير كبير للإهداب الاكتئاب، مما يؤدي إلى ما يقرب من الصفر التصاريح المخاطية.

4- التحليل

1. بعد التصوير، قم بإجراء المعالجة اللاحقة لإعادة إنشاء صور مكدس ثلاثية الأبعاد كاملة.
   1. مخطط الرسم البياني الصور SPECT باستخدام إعدادات المصنع القياسية ^ل99mTc، ومن ثم إعادة بناء باستخدام خوارزمية MAP3D ووظيفة انتشار نقطة (PSF) إعادة الإعمار.
      ملاحظة: إعادة إنشاء تم تنفيذ باستخدام 8 التكرارات و 6 مجموعات فرعية. وتحتاج عملية إعادة البناء الفعالة إلى نسبة من المجموعات الفرعية إلى الإسقاطات عند 1:10 أو أن تقسم بالتساوي إلى عدد الإسقاطات، لذلك تم استخدام 6 مجموعات فرعية بسبب الاقتناء باستخدام 60 إسقاطات.
   2. إعادة بناء الصور CT باستخدام خوارزمية Feldkamp و Filter Shepp-Logan.
      ملاحظة: إعادة إنشاء تم تنفيذ باستخدام 4 التكرارات.
2. معالجة الصور CT و SPECT في FIJI ImageJ²¹ باستخدام أداة إعادة النسخ لإنشاء صور عرض الإكليلي من الصور المحورية الافتراضية. ثم قم بإجراء إسقاط مجموع الرصينات z على صورة SPECT لإضافة بيانات العد من كل شريحة وإنشاء صورة واحدة لتسهيل التحليل.
3. تغيير حجم وشارك في تسجيل الصور CT وSPECT باستخدام أنبوب Eppendorf الوهمية كمرجع(الشكل 2A, B). تتبع واستخدام القياسات تغيير الحجم متسقة عبر جميع العينات.
4. Binarize صورة CT باستخدام العتبة التلقائية، تليها عكس المكدس، وتنفيذ إسقاط مجموع z-المكدس لتوليد مخطط تفصيلي للرئتين للتحليل (الشكل 2C).
5. قم بتدوير صور CT وSPECT ودمج الصورة باستخدام أدوات القناة. حساب مؤسسة تحدي الألفية عن طريق رسم عائد الاستثمار حول الرئة اليمنى وقياس (الشكل 2D).
   ملاحظة: سيكون هذا القياس من إجمالي عدد في الرئة اليمنى لنقاط الوقت 0 و 6 ساعات، مع تصحيح الصور لمدة 6 ساعات للتحلل الإشعاعي باستخدام الصيغة: N(t)= N₀e^−t. ^{99 متر} Tc-Sc لديه ثابت اضمحلال 3.21e⁻⁵ في الثانية مع نصف عمر من ~ 6 ساعات. يمكن استخدام هذه القيم ثم لحساب إزالة النسبة المئوية.
   ملاحظة: يتم اختيار الرئة اليمنى لرسم العائد على الاستثمار وقياس التهم كما إزالة المخاطية سوف تنقل النظائر المشعة من الرئتين إلى البلعوم من حيث سيتم ابتلاعها وينتهي في المعدة. في كثير من الأحيان ، يمكن رؤية العد في المعدة التي قد تتداخل مع الرئة اليسرى وبالتالي تنتج تعدادات خاطئة. ويمكن تجنب هذا الخلط من خلال قياس عدد في الرئة اليمنى فقط.

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول، نحن الفئران تخدير في غرفة isoflurane (الشكل 1A). بعد تحقيق مستوى كاف من التخدير، وضعت الفئران على دعامات عمودية (الشكل 1B) وتخيلت الحبال الصوتية باستخدام سلك دليل مضيئة (الشكل 1C-1D). تم تقطير الفئران وغرست مع 0.2 mCi ^99mTC-Sc في مجلدات من 10 ميكرولتر من خلال قنية والفئران يسمح لها بالاستنشاق تلقائيا في الرئتين (الشكل 1E-1F). بعد الحصول على الصور ومعالجتها ، تم كولوكاليد الصور CT و SPECT (الشكل 2A) باستخدام أنبوب وهمي كمعلم (الشكل 2B). تم توليد أقنعة الرئتين من صورة CT(الشكل 2C)واستخدمت لرسم ROIs حول الرئة اليمنى للتحليل في 0 (الشكل 2D) و 6 ساعات (الشكل 2E-2F). لاختبار إعادة إنتاج البروتوكول، تم مسح ما مجموعه 8 فئران مرتين في أيام مختلفة مع ظروف تجريبية متطابقة، مع تحليل باستخدام اختبار t الاقتران تظهر لا فرق كبير بين عمليات المسح المتكرر (p-value=0.9904) (الشكل 3A). تم مسح 2 ماوس إضافية ثلاث مرات في أيام مختلفة مع ظروف تجريبية متطابقة ، مع تحليل باستخدام ANOVA في اتجاه واحد يظهر مطابقة كبيرة بين عمليات المسح المتكرر (قيمة p 0.0041) (الشكل 3B). تم مسح ما مجموعه 8 فئران وتم عرض صورتين تمثيليتين(الشكل 4).

الشكل 1: الزرع الماوس وغرس النظائر. صور للخطوات اللازمة لتلقين النظائر وغرسها في مجرى الهواء. A)يتم تخدير الماوس في غرفة. ب) يتم وضع الماوس المُجَدَّد على دعم رأسي، معلّق من قِبل المُقَدّر الأمامي. ج) يتم إعداد سلك ألياف ضوئية مضاءة 0.5 مم بمثابة سلك دليل من خلال تشغيله من خلال قنية 20 غ. D)يتم فتح فم الماوس باستخدام ملقط ومضاءة باستخدام أسلاك المرشد المضاءة لتصور الحبال الصوتية. E)يتم دفع القنية عبر الحبال الصوتية ويتم إزالة سلك الدليل. و) يتم غرس النظائر القابلة للذوبان في القنية باستخدام ماصة والفأر المسموح به لاستنشاق النظائر تلقائياً في الرئتين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: صور SPECT/CT لمسح MCC. A)صورة SPECT تم ترجمتها بشكل مشترك مع صورة CT. ب) صورة CT مع أنبوب وهمي مرئي تم استخدامه للتوطين المشترك. C) قناع مجرى الهواء مشتق من خلال تحجيم صورة CT وإجراء إسقاط مجموع الرزمة z. D)قناع CT شارك في ترجمة مع صورة SPECT. وقد تم رسم عائد الاستثمار للتحليل حول الرئة اليمنى. ه) قناع مجرى الهواء في 6 ساعات. F)صورة مقطعية مقطعية وSPECT مترجمة مشتركًا للمجرى الهوائي في 6 ساعات مع عائد الاستثمار للتحليل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: قياسات إزالة نفس الفئران عبر عمليات مسح متعددة. A)تم قياس اثنين من إزالة تكرار الفردية ل 8 فئران مع عدم وجود تغييرات في الظروف التجريبية. وأظهر اختبار t المقترن أنه لم يكن هناك فرق كبير بين عمليات المسح المتكررة بقيمة p 0.9904. ب) تم قياس ثلاثة مقاصات تكرار فردية لاثنين من الفئران دون أي تغييرات في الظروف التجريبية. وأظهر ANOVA ذات اتجاه واحد أن هناك تطابق كبير بين عمليات المسح المتكررة بقيمة p 0.0041. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: صور SPECT/CT ذات الطابع المحلي المشترك للمجرى الهوائي لمدة 0 و 6 ساعات في 2 فئران مع ROIs مرسومة في 0 و 6 ساعات تحدد الرئة اليمنى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تكميلية الشكل 1: شريط فيديو من الحبال الصوتية مضيئة بواسطة سلك الألياف البصرية مع تأثير التنفس تصور. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

ملفات تكميلية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذه الملفات.

Discussion

دور الأهداب التنفسية في كل من المرض والتنمية لا يزال يتطور ويقدر بشكل أفضل. متزامن، الضرب الميتاكرونا من العديد من الكره المتحركة على السطح apical من الخلايا بطانة شجرة tracheobronchial توليد تدفق cephalad إنتاج إزالة المخاطية أو MCC. هو للخطر MCC في سيليوباثيس مثل PCD²², المكتسبة من الأمراض مثل مرض الانسداد الرئوي والإيدز¹⁸, ويجري الاعتراف أهميتها في أمراض القلب والأمراض المنقولة عن طريق الامراض, لا تعتبر تقليديا أن ciliopathies. وقد أظهرت البيانات الأخيرة ضعف الجهاز التنفسي في كل من CHD مع heterotaxy²³ ودون heterotaxy⁷. وقد تبين أن هذا الخلل في الإداب المتحركة يترجم إلى أعراض تنفسية أكبر⁹ بالإضافة إلى اعتلال أكبر بعد الجراحة⁸. معظم، إن لم يكن كل، من هذه الأمراض، ونماذج الماوس المتاحة وبروتوكولنا لقياس MCC في الفئران هو أداة قيمة التي يمكن استخدامها لاختبار العلاجات المحتملة.

توفر النماذج الحيوانية فائدة لفهم الأمراض وتطوير العلاجات. في التصوير الحيواني في الجسم الحي يوفر فائدة إضافية مع القدرة على الحصول على نقاط بيانات متعددة من الحيوانات نفسها، دون الحاجة إلى التضحية بالحيوانات، مما يسمح للمحققين لمتابعة مسار طولي للمرض، فضلا عن دراسة مدة العلاج الآثار. وقد تم تطوير نموذج الماوس من مؤسسة تحدي الألفية على مدى عقود من قبل العديد من المحققين، ويجري في البداية على الكلاب beagle باستخدام scintigraphy planar، وتقنية التصوير النووي²⁴الأبعاد ثنائية الأبعاد . تم تكييف هذه التقنية للاستخدام في الفئران بعد عقد من الزمان ، تليها التكيف مع التصوير SPECT بعد عقد من الزمان^25،26. وكان تطوير هذه التقنية في نماذج الماوس تطورا رئيسيا في أهمية هذه التقنية، نظرا لتوافر نماذج متعددة من الماوس من الأمراض البشرية مثل PCD التي يتم فيها تغيير وظيفة الهدبي بشكل كبير. وقد تم تقييم مؤسسة تحدي الألفية في نماذج الماوس من denervation الرئة والمناعة، ولديه القدرة على أن تستخدم جنبا إلى جنب مع نماذج أخرى^19،26. وقد أجريت دراسات القياس MCC في المرضى الذين يعانون من أمراض مجرى الهواء مثل CF, الربو, PCD, وciliopathies المرتبطة CHD, وقد أسفرت عن نتائج أن هذه التقنية يمكن أن تساعد على حد سواء دراسات فيزيولوجيا الرئة والفعالية العلاجية¹³.

جزء مهم من هذا البروتوكول هو إعداد عمليات الاستحواذ مع المعلمات التصوير الصحيح للحصول على صور دقيقة لتحديد كم. وهناك عدد من العوامل الرئيسية عند تصميم إعدادات اقتناء SPECT ، بما في ذلك التكريمات التي تستخدم ، وعدد التوقعات للحصول على كل ثورة ، وحجم الخطوة التناوب. اختيار ال Collimator هو عامل رئيسي في حساسية ودقة الاقتناء ، وقد تحتاج إعدادات الاكتساب إلى أن تكون مصممة خصيصًا للcollimator المستخدم²⁷. بالتناوب، عند استخدام الحيوانات أكبر مثل الفئران، سوف تحتاج إلى تعديل collimators. الكولماتورس متعددة الثقب على سبيل المثال هي أكثر حساسية، ولكن ينبغي توخي الحذر عند اختيار حجم خطوة من أجل تجنب تداخل الإسقاطات والتسبب في تعدد غير مرغوب فيه، والتي يمكن أن تزيد من زيادة حساسية اقتناء على حساب بعض الغموض صورة التي يمكن أن تسبب القطع الأثرية إعادة الإعمار²⁵. يعد إعداد إعادة الإعمار أيضًا مفتاحًا لإنشاء صور قابلة للقياس الكمي. MAP3D هو خوارزمية إعادة بناء متكررة شائعة الاستخدام، و PSF هو نموذج إعادة الإعمار الشائعة. كلاهما موثوق به لإعادة بناء الصور، ولكن يجب توخي الحذر عند تعيين عدد التكرارات و المجموعات الفرعية. زيادة عدد التكرارات زيادة الوقت الحسابي المطلوب لإعادة الإعمار، وزيادة نوعية إعادة الإعمار مع تناقص العوائد عند زيادة أخرى.

من أجل قياس الصور في ImageJ ، أداة القياس المثالية لاستخدام RawIntDen ، الذي يخرج قيمة مجموع بكسل في التحديد. عند قياس بيانات SPECT عبر مختلف أحجام الرئة ROIs، واستخدام RawIntDen يوفر مقياسا مطلقا من عدد ويتجنب ضبط القياس إلى منطقة العائد على الاستثمار، مثل القياس المتوسط من شأنه^{أن 21}.

هذه التقنية لديها عدد من مصادر الخطأ المرتبطة التي ينبغي أن يكون المحقق على علم عند تطبيق هذه التقنية. ومن الحيرة البارزة هو استخدام وكلاء التخدير. ايزوفلوران هو سريع التمثيل، استنشاق مخدر أن الفئران استرداد من بسرعة بعد الانتهاء من عملية الاستحواذ. ومع ذلك ، ينبغي توخي الحذر لتزويد الفئران مع متسع من الوقت للتعافي في أقفاصها ، وليس أبقى تخدير أي أطول من اللازم. في تجربتنا الشخصية (البيانات غير المنشورة) الفئران التي تم الاحتفاظ بها تخدير مستمر باستخدام ايزوفلوران المستنشق بين 0 و 6 ساعة الوقت نقطة أظهرت إزالة لا تذكر. وبالمثل، فإن جرعة من المخدر خاضعة للرقابة ضرورية أيضا لضمان الشفاء السريع. عند تأمين الحيوان إلى البليت للتصوير، ينبغي أن تبقى أنبوب وهمية تستخدم للتسجيل المشترك منخفضة على المعدة لتجنب القطع الأثرية من تداخل مع الرئتين. وبالمثل، لضمان جودة صورة CT، الحرص على إزالة أي علامات معدنية من الماوس لتجنب القطع الأثرية من تشتت الأشعة السينية.

يمكن تطبيق بروتوكول مؤسسة تحدي الألفية الحالي على عدد لا يحصى من النماذج الحيوانية. هذه التقنية لها تأثير لا يذكر على صحة الحيوان الممسوحة ضوئيا، ويتم تحمل جيد من قبل الفئران، وبسبب هذا يمكن استخدامه مع نماذج المرض دون المخاطرة بصحة الفئران الحساسة بالفعل. قوة هذه المنهجية يأتي من كونها تقنية في vivo، والذي يسمح للحصول على قياسات متسقة وقابلة للتكرار من وظيفة مجرى الهواء دون التضحية من الحيوانات لاستخراج القصبات الهوائية لتصوير الفيديو المجهري، أن نماذج الجسم الحي السابق تتطلب²⁶. إن اتساق هذه التقنية في إنتاج قياسات قابلة للتكرار عبر عمليات مسح متعددة لنفس الحيوانات، يسمح بمعاملة نفس الحيوان بعوامل مختلفة أو علاجات محتملة، ومقارنات إحصائية بين نفس الحيوان للحد من التقلبات البيولوجية الكامنة في أي نموذج حيواني، وبالتالي تقليل حجم العينة اللازم لإظهار الاختلافات ذات الأهمية الإحصائية.

يمكن تعديل تقييم وظيفة مجرى الهواء باستخدام تقنية MCC وفقًا لمجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية وتطبيقه على العديد من النماذج المختلفة لصحة مجرى الهواء ، بالإضافة إلى اختبار علاجات جديدة. يمكن تقييم الخطوط الجوية لنماذج الماوس من PCD باستخدام هذه التقنية، وكذلك نماذج من الانسداد الرئوي الرئوي. ويمكن أيضا استخدام طريقتنا لدراسة الآثار التفاضلية لمختلف التخدير على MCC التي هي في الاستخدام السريري المشترك. وأخيراً، يمكن أيضاً تقييم آثار العوامل العلاجية على مجرى الهواء باستخدام هذا النموذج. كما ذكر سابقا ولكن يحمل التكرار، كما هو قياس في الجسم الحي فإنه يسمح لتكرار تقييمات MCC على مدى المرض، فضلا عن فوائد الاختبار من التدخلات العلاجية على مر الزمن. بالإضافة إلى ذلك، الفئران هي المختبر الأكثر شيوعا المستخدمة لتقليد / دراسة الأمراض البشرية، مع، في بعض الحالات، نماذج متعددة الماوس المعدلة وراثيا من الأمراض البشرية المتاحة للاختيار من بينها.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
500 µm Unjacketed Fiber Optic Wire	Edmund Optics	02-532
99mTechnecium-Sulfur Colloid	Cardinal Health
Anesthesia Vaporizer	Vetland Medical	A13480
Durmont #5 Forceps	Fine Science Tools	99150-20
FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software
Introcan Safety Catheters 20G 1inch	Fisher Scientific	NC1534477
Isoflurane	Henry Schein	118-2097
Mouse Intubation Stand	Kent Scientific	ETI-MSE-01
Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT	Siemens
Single Channel Anesthesia Stand	Summit Anesthesia Solutions	22860