Valutazione in vivo del nulla osta mucociliario nei topi

Riepilogo

In questa pubblicazione descriviamo protocolli per la valutazione del gioco mucociliare delle vie aeree (MCC) nei topi in vivo utilizzando l'imaging a radionuclide a doppia modalità. Questo protocollo è progettato per una singola tomografia computerizzata ad emissione di fotoni (SPECT) e un protocollo di acquisizione della tomografia computerizzata (CT) utilizzando collimatori a tutto il corpo del mouse (MWB) in un doppio sistema SPECT/CT.

Abstract

Le ciglia traslittele respiratorie, organelli specializzati della cellula, fiancheggiano la superficie apicale delle cellule epiteliali che rivestono le vie respiratorie. Battendo in modo metacronale, sincronale, questi organelli multipli, motili, a base di actina generano un flusso di fluidi cefalodi che cancella le vie respiratorie da inquinanti e agenti patogeni inalati. Con l'aumento dell'inquinamento ambientale, nuovi agenti patogeni virali e batteri emergenti resistenti a più farmaci, la clearance mucocilia generata dalle ciglia (MCC) è essenziale per mantenere la salute dei polmoni. McC è anche depresso in molteplici disturbi congeniti come la discinesia ciliare primaria, la fibrosi cistica e disturbi acquisiti come la broncopneumopatia cronica ostruttiva. Tutti questi disturbi hanno stabilito, in alcuni casi multipli, modelli di topo. In questa pubblicazione, dettagliamo un metodo utilizzando una piccola quantità di radioattività e imaging SPECT/CT a doppia modalità per misurare in modo accurato e riproducibile MCC nei topi in vivo. Il metodo consente il recupero dei topi dopo l'imaging, rendendo possibili le misurazioni seriali e testando longitudinalmente potenziali terapie nel tempo. I dati nei topi di tipo selvatico dimostrano la riproducibilità della misurazione MCC purché venga prestata un'adeguata attenzione ai dettagli e il protocollo rigorosamente rispettato.

Introduzione

Le ciglia sono organelli cellulari a base di microtubuli conservati nella storia evolutiva dalle alghe agli esseri umani. Emanano dalle superfici cellulari e hanno una serie di^{funzioni 1,}che vanno dal riconoscimento dei segnali sensoriali ambientali locali alla motilità, funzioni che possono essere fatte risalire dall'uomo ai primi organismi eucarioti unicellulari^2,3. Cilia può essere non mobili e singola servendo come antenna specializzata di una cellula per elaborare segnali ambientali; o mobili e multipli, battendo in onde metacronali sincronizzate per generare flusso di fluido, come nel rivestimento delle tube di Falloppio e delle vie aeree superiori e inferiori, ad eccezione dei bronchioli terminali che portano agli alveoli^1,2.

L'estesa superficie epiteliale delle vie respiratorie è esposta a una costante raffica di contaminazione sotto forma di una varietà di inquinanti e agenti patogeni inalati potenzialmente pericolosi, che richiedono una difesa. Un meccanismo chiave di difesa è l'apparato mucociliare dell'albero tracheobronchiale, dove un flusso continuo di muco secreto viene trasportato meccanicamente fuori dalle vie aeree dal battito di più ciglia motili che rivestono le superfici apicali delle cellule epiteliali tracheo-bronchiali. Questi funzionano per intrappolare i contaminanti inalati e, attraverso il loro battito continuo e sincronale, trasportarli cefalad^4,5.

Cilia ha dimostrato di avere ruoli chiave come nello sviluppo del patterning sinistra-destra nello sviluppo di embrioni, dove le ciglia mobile al nodo embrionale rompono^{la simmetria 6}. Mutazioni nei geni correlati alle ciglia sono state collegate a malattie come la cardiopatica congenita (CHD) a causa della struttura asimmetrica del cuore⁶. Recenti studi hanno riportato un'elevata incidenza di disfunzione ciliare nelle vie respiratorie dei pazienti con CHD, nonché una maggiore prevalenza di complicanze respiratorie post-operatorie e sintomi cronici delle vie respiratorie nelle vie aeree superiori e^{inferiori 7,8,9,10}. I pazienti con CHD e disfunzione ciliaria, con o senza eterotassia, hanno dimostrato di avere un aumento del rischio di complicanze respiratorie e esiti respiratori negativi post-operatoriamente^5,8,10. Al di là del loro ruolo nella segnalazione e nello sviluppo, l'importanza delle ciglia delle vie aeree è stata dimostrata dalle ciliopatie, di cui un primo esempio è la discinesia ciliare primaria (PCD). La PCD è un disturbo congenito derivante da una serie di mutazioni che colpiscono le ciglia respiratorie motili, portando a infezioni polmonari ricorrenti, bronchectasi e potenzialmente la necessità di trapianto polmonare¹¹. Inoltre, anche se le ciglia sono normali nella fibrosi cistica (CF), disturbo congenito più comune nella popolazione caucasica, l'MCC è compromesso a causa di muco spesso e viscoso derivante da mutazioni nel gene CFTR¹². Esistono più modelli di mouse di PCD e CF, oltre a un numero sempre crescente di modelli di CHD. In definitiva le ciglia sono strutture versatili con molti ruoli chiave e un metodo per valutare la funzione delle ciglia respiratorie mobile in vivo può essere prezioso per lo studio pre-clinico e la valutazione degli effetti delle mutazioni e dei farmaci sulla clearance mucociliare (MCC)¹³. Il metodo sarebbe utile anche per valutare gli effetti di nuovi farmaci, terapia genica o interventi su MCC in questi modelli di topo.

Ci sono molti modelli diversi che sono stati utilizzati per valutare MCC. Un metodo degno di nota prevede l'uso di colorante blu metilene che è stato instillato nel bronco, con gioco misurato mediante misurazione fiberottica del movimento del colorante¹⁴. Questo metodo è limitato dalla capacità di osservare il movimento del colorante, che è più routine nell'uomo che nei modelli precli clinici del topo. Un altro metodo degno di nota è l'imaging a raggi X synchrotron phase-contrast (PCXI), che può essere usato per tracciare singole particelle in una via aerea. Questo metodo è relativamente nuovo e non ampiamente accessibile¹⁵. Esistono numerosi metodi ex vivo per valutare le vie aeree mediante l'accisa di una trachea per la video-microscopia, tuttavia questi modelli forniscono poca utilità nei pazienti umani¹⁶. Le tecniche ad alta risoluzione per l'imaging delle ciglia come la tomografia a coerenza ottica sono limitate allo stesso^{modo 17}.

In questo articolo, presentiamo un metodo riproducibile per misurare MCC in vivo che è stato utilizzato per misurare le clearance polmonari in una miriade di modelli animali, nonché studiare MCC nella broncopneumopatia cronica ostruttiva e valutare gli effetti dei farmaci immunosoppressivi^18,19. Questo metodo tiene traccia della clearance del colloide radiofarmaceutico ^99mtecnezio-zolfo (^99mTc-Sc), un radiotracciante particolato insolubile, dopo l'instillazione nei polmoni. Il radionuclide può quindi essere tracciato utilizzando una tomografia computerizzata a emissione di fotoni singola (SPECT)^18,20. Abbiamo ulteriormente perfezionato questa tecnica per misurare MCC utilizzando la doppia modalità SPECT e l'imaging di tomografia computerizzata (CT) con co-localizzazione del conteggio dei radioisotopi ai polmoni e misurando la diminuzione di questi conteggi su 6 ore. L'imaging a doppia modalità, con la co-registrazione delle immagini CT e SPECT, consente una localizzazione accurata del conteggio delle radiazioni per la nostra regione di interesse, i polmoni. Sebbene descriviamo in dettaglio il metodo per la misurazione MCC nei topi, il protocollo può essere regolato per studiare MCC nei ratti. I collimatori dovrebbero essere regolati così come la dose di radiazioni. A nostro avviso, le scansioni MCC del topo sono più tecnicamente impegnative a causa delle piccole dimensioni degli animali, ma più utili dei ratti a causa del gran numero di modelli di topi consolidati di una serie di disturbi umani. Inoltre, a causa del loro minor costo e costo di manutenzione nelle colonie animali, una dimensione del campione più grande è più fattibile nei topi.

Protocollo

Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Pittsburgh ha approvato tutti i protocolli sugli animali specificati nella presente pubblicazione prima di intraprendere uno di questi esperimenti sugli animali.

NOTA: Questo protocollo descrive in dettaglio come eseguire studi di clearance mucociliari in vivo utilizzando l'imaging di radionuclidi con uno scanner SPECT/CT a doppia modalità. Le tecniche dimostrate sono l'esecuzione di calibrazioni del sistema, l'anestesia dei topi, l'intubazione tracheale dei topi, l'instillamento dell'isotopo nei polmoni, l'imaging a doppia modalità, la co-registrazione di queste immagini e l'analisi.

1. Configurazione del sistema SPECT/CT

1. Progettare un flusso di lavoro appropriato e configurare prima di eseguire esperimenti utilizzando animali viventi.
   1. Utilizzare un'acquisizione SPECT composta da 60 proiezioni con una dimensione del passo di 6^{o tra le proiezioni} con un raggio di rotazione di 40 cm. L'acquisizione di CT è costituita da 220 proiezioni con un angolo di 1,6^o tra le proiezioni.
2. Assicurarsi che il sistema abbia in atto i collimatori MWB corretti per i topi e l'imaging SPECT. Se vengono installati collimatori inappropriati, utilizzare la procedura guidata collimatore per installare quelli corretti.
3. Eseguire le calibrazioni di sistema necessarie per preparare il sistema per l'uso.
   NOTA: I componenti SPECT e CT dello scanner necessitano di calibrazione. Calibrare i componenti CT utilizzando un condizionamento della sorgente e una calibrazione Dark/Light (D/L) una volta al giorno, una calibrazione Center Offset (COS) ogni 2 settimane e valutare l'hardware a raggi-X ogni mese. I componenti SPECT devono essere calibrati una volta all'anno.
   1. Per valutare l'hardware a raggi-X, selezionare la casella Valuta hardware a raggi X durante le calibrazioni CT(Menu di calibrazione CT supplementare).
   2. Per eseguire il condizionamento della sorgente, selezionare la casella Esegui condizionamento sorgente durante le calibrazioni CT(Menu di calibrazione CT supplementare).
   3. Per eseguire una calibrazione D/L, selezionare la casella D/L accanto al protocollo di acquisizione CT utilizzato durante gli esperimenti durante le calibrazioni CT. Deselezionare tutti gli altri protocolli(Menu di calibrazione CT supplementare).
   4. Per eseguire una calibrazione COS, sostituire il letto con lo strumento anello di calibrazione, regolare le impostazioni del tipo di letto in modo che corrispondano alle impostazioni di controllo del movimento e selezionare la casella COS accanto al protocollo di acquisizione CT utilizzato durante gli esperimenti durante le calibrazioni CT. Deselezionare tutti gli altri protocolli(menu di calibrazione CT supplementare, anello di calibrazione supplementare).

2. Intubazione e instillazione del topo

1. Pesare i topi da scansionare. Se si scansionano più topi, fare attenzione a contrassegnare i topi a scopo di identificazione utilizzando metodi come la punzonatura dell'orecchio o la marcatura della coda.
2. Anestetizzare un topo usando l'1,5% di isoflurane con un flusso di gas di 2 L/min O₂ in una camera a gas per ~5 minuti per produrre anestesia di profondità sufficiente, fino a quando la respirazione rallenta a ~ 55-65 respiri al minuto ¹⁶ (Figura 1A).
3. Rimuovere il mouse dalla camera e sospendere con gli incisivi anteriori su un supporto di intubazione a 45^o pendenza. Dotare il supporto di intubazione di un cono del naso per assicurarsi che il mouse sia anestetizzato durante l'intubazione (Figura 1B).
4. Collegare un'estremità di un filo in fibra ottica da 50 μm a una sorgente luminosa e infilare una cannula calibro 20 su di essa utilizzando il filo per fungere da guida (Figura 1C).
5. Aprire la bocca del mouse e tirare la lingua in avanti usando forcep smussate. Illuminare il filo guida e utilizzarlo per visualizzare le corde vocali (Figura 1D).
6. Passare il filo guida attraverso le corde vocali in modo che il filo sia appena oltre le corde vocali e riposare nella trachea superiore. Far scorrere la cannula da 1 pollice in avanti lungo il filo per intubare il mouse, passando la cannula abbastanza in profondità in modo che il suo fulcro sia contro gli incisivi dell'animale (Figura 1E). Rimuovere il filo lasciando la cannula in posizione.
7. Testare l'intubazione collegando brevemente la cannula con un dito e controllando i cambiamenti nella respirazione. La respirazione interrotta o la respirazione tesa durante la tappatura e la respirazione accelerata al momento del rilascio sono segni di corretta intubazione tracheale. Se non vi è alcun cambiamento nei modelli respiratori al momento dell' tappatura della cannula, quest'ultima è probabile nell'esofago.
8. Preparare 0,2 mCi di colloide tecnezio-zolfo da ⁹⁹m^(99mTc-Sc) in un volume di 10 μL e pipetta nella cannula. Lasciare che il topo lo inali spontaneamente nei polmoni per oltre 1-2 min(Figura 1F). Rimuovere la cannula prima di trasferire il mouse sul pallet dello scanner.
   NOTA: Il radionuclide è stato preparato e filtrato da Cardinal Health.

3. Imaging SPECT/CT

1. Trasferire il mouse su un pallet da 25 mm con un cono del naso e fissare con nastro adesivo, facendo attenzione a non rastremare troppo strettamente il torace e l'addome per evitare di compromettere la respirazione. Fare attenzione a rimuovere eventuali auricolari metallici attaccati al mouse.
2. Preparare un fantasma radioattivo costituito da 0,05 mCi in 200 μL e posizionare questa quantità in un tubo PCR da 0,2 ml. Posizionare il tubo toccando il pallet sotto l'addome inferiore del mouse, evitando sovrapposizioni con i polmoni.
   NOTA: Il fantasma viene utilizzato allo scopo di co-registrare le immagini CT e SPECT, nonché un controllo negativo per la clearance.
3. Inserire il mouse nel sistema SPECT/CT, selezionare il flusso di lavoro di imaging ed eseguire setup.
4. Impostare il posizionamento dei rilevatori sul mouse ed eseguire il flusso di lavoro di imaging.
5. Preparare una gabbia per topi che hanno ricevuto la post-procedura di radioattività, con accesso illimitato a cibo e acqua e etichettatura chiara utilizzando un adesivo di sicurezza per le radiazioni.
6. Al termine del flusso di lavoro, rimuovere il mouse dal pallet di imaging e consentirgli di recuperare nella gabbia preparata per una durata di 6 ore tra le scansioni (fine scansione 1 fino all'inizio della scansione 2) con accesso ad libitum a cibo e acqua. 6 h è stato scelto in quanto corrisponde al periodo di tempo in cui il gioco lineare a seconda della funzione ciglia sta avvienendo con pochissima distanza alveolare.
7. Dopo 6 ore, riaestestizzare il mouse e scansionare, insieme al fantasma, utilizzando lo stesso flusso di lavoro per misurare la quantità di isotopo cancellata dalle vie aeree.
   NOTA: È fondamentale consentire al mouse di riprendersi poiché l'anestesia ininterrotta con isoflurana per 6 ore porterà a un significativo effetto depressivo delle ciglia, con conseguente zero clearance mucociliari.

4. Analisi

1. Dopo l'imaging, esegui la post-elaborazione per ricostruire le immagini complete dello stack 3D.
   1. Istogramma le immagini SPECT utilizzando le impostazioni standard di fabbrica ^{per 99m}Tc, quindi ricostruire utilizzando un algoritmo MAP3D e la ricostruzione della funzione di diffusione del punto (PSF).
      NOTA: la ricostruzione è stata eseguita utilizzando 8 iterazioni e 6 sottoinsiemi. Una ricostruzione efficace richiede un rapporto tra sottoinsiemi e proiezioni a 1:10 o dividersi uniformemente nel numero di proiezioni, quindi 6 sottoinsiemi sono stati utilizzati a causa dell'acquisizione utilizzando 60 proiezioni.
   2. Ricostruire le immagini CT utilizzando l'algoritmo Feldkamp e un filtro Shepp-Logan.
      NOTA: La ricostruzione è stata eseguita utilizzando 4 iterazioni.
2. Elaborare le immagini CT e SPECT in FIJI ImageJ^{21 utilizzando} lo strumento reslice per generare immagini di visualizzazione coronale dalle immagini assiali predefinite. Quindi eseguire una proiezione di somma z-stack sull'immagine SPECT per aggiungere i dati di conteggio da ogni sezione e generare una singola immagine per facilitare l'analisi.
3. Ridimensionare e co-registrare le immagini CT e SPECT utilizzando il tubo Eppendorf fantasma come riferimento (Figura 2A,B). Tenere traccia e utilizzare misurazioni di ridimensionamento coerenti in tutti gli esempi.
4. Binarizzare l'immagine CT utilizzando la soglia automatica, seguita dall'inversione dello stack e dall'esecuzione di una proiezione di somma z-stack per generare un contorno dei polmoni per l'analisi (Figura 2C).
5. Ruotare le immagini CT e SPECT e unire l'immagine utilizzando gli strumenti del canale. Calcolare MCC disegnando un ROI attorno al polmone destro e misurando (Figura 2D).
   NOTA: Questa misurazione sarà del conteggio totale nel polmone destro per i punti di tempo di 0 e 6 ore, con le immagini di 6 ore corrette per il decadimento radioattivo usando la formula: N(t) = N₀e^−t. ^99m Tc-Sc ha una costante di decadimento di 3,21e⁻⁵ al secondo con un'emidità di ~6 ore. Questi valori possono quindi essere utilizzati per calcolare una percentuale di gioco.
   NOTA: Il polmone destro viene scelto per il prelievo e la misurazione del ROI poiché l'autorizzazione mucociliaria trasporterà il radioisotopo dai polmoni alla faringe da dove verrà inghiottito e finirà nello stomaco. Abbastanza spesso, i conteggi possono essere visti nello stomaco che possono sovrapporsi al polmone sinistro e quindi produrre conteggi erronei. Questa confusione può essere evitata misurando i conteggi solo nel polmone destro.

Risultati

Utilizzando questo protocollo, abbiamo anestetizzato i topi in una camera isoflurana (Figura 1A). Dopo aver raggiunto un livello adeguato di anestesia, i topi sono stati posizionati su supporti verticali (Figura 1B) e le corde vocali sono state visualizzate utilizzando un filo guida illuminato(Figura 1C-1D). I topi sono stati intubati e instillati con 0,2 mCi ^99mTc-Sc in volumi di 10 μL attraverso una cannula e topi hanno permesso di inalare spontaneamente nei polmoni (Figura 1E-1F). Dopo l'acquisizione e l'elaborazione delle immagini, le immagini CT e SPECT sono state colocalizzate (Figura 2A) utilizzando il tubo fantasma come punto di riferimento (Figura 2B). Le maschere dei polmoni sono state generate dall'immagine CT (Figura 2C) e utilizzate per disegnare ROM attorno al polmone destro per l'analisi a 0 (Figura 2D) e 6 ore(Figura 2E-2F). Per testare la riproducibilità del protocollo, un totale di 8 topi sono stati scansionati due volte in giorni diversi con condizioni sperimentali identiche, con analisi che utilizzano un test t accoppiato che non mostra alcuna differenza significativa tra le scansioni ripetute (p-value=0.9904) (Figura 3A). Altri 2 topi sono stati scansionati tre volte in giorni diversi con condizioni sperimentali identiche, con un'analisi che utilizza ANOVA unidirezione che mostra una corrispondenza significativa tra le scansioni ripetute (valore p di 0,0041) (Figura 3B). In totale sono stati scansionati 8 topi e sono state visualizzate due immagini rappresentative(figura 4).

Figura 1: Intubazione del mouse e instillazione dell'isotopo. Immagini dei passaggi necessari per intubare e infondere isotopo nelle vie aeree. A) Il mouse viene anestetizzato in una camera. B) Il mouse anestetizzato è posto su un supporto verticale, sospeso dagli incisivi anteriori. C)Un filo in fibra ottica illuminato da 0,5 mm che funge da filo guida viene preparato facendolo passare attraverso una cannula da 20 G. D) La bocca del mouse viene aperta con le forcelle e illuminata utilizzando il filo guida illuminato per visualizzare le corde vocali. E) La cannula viene spinta attraverso le corde vocali e il filo guida viene rimosso. F)L'isotopo solubile viene instillato nella cannula utilizzando una pipetta e il topo può inalare spontaneamente l'isotopo nei polmoni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini SPECT/CT di una scansione MCC. A) Un'immagine SPECT che è stata co-localizzata con un'immagine CT. B)Un'immagine CT con un tubo fantasma visibile utilizzato per la co-localizzazione. C) Una maschera delle vie aeree derivata binarizzando l'immagine CT ed eseguendo una proiezione di somma z-stack. D) La maschera CT co-localizzata con l'immagine SPECT. Un ROI per l'analisi è stato disegnato intorno al polmone destro. E)Una maschera delle vie aeree a 6 ore. F)Un'immagine co-localizzata CT e SPECT delle vie aeree a 6 ore con un ROI per l'analisi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Misurazioni di gioco degli stessi topi su più scansioni. A)Sono state misurate due autorizzazioni di ripetizione individuali per 8 topi senza variazioni nelle condizioni sperimentali. Un test t accoppiato ha mostrato che non c'era alcuna differenza significativa tra le scansioni ripetute con un valore p di 0,9904. B)Sono state misurate tre singole autorizzazioni di ripetizione per due topi senza variazioni nelle condizioni sperimentali. Un ANOVA uni-way ha mostrato che c'era una corrispondenza significativa tra le scansioni ripetute con un valore p di 0,0041. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Immagini SPECT/CT colocalizzate delle vie aeree di 0 e 6 ore in 2 topi con ROM disegnate a 0 e 6 ore che delineano il polmone destro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Un video delle corde vocali illuminato da un filo in fibra ottica con l'effetto della respirazione visualizzato. Clicca qui per scaricare questa cifra.

File supplementari. Clicca qui per scaricare questi file.

Discussione

Il ruolo delle ciglia respiratorie motili sia nella malattia che nello sviluppo continua ad evolversi ed essere meglio apprezzato. Il battito sincrono e metacronale di ciglia multiple motile sulla superficie apicale delle cellule che rivestono l'albero tracheobronchiale genera un flusso di cefalodi che produce spazio mucociliario o MCC. MCC è compromessa in ciliopatie come PCD²², malattie acquisite come COPD¹⁸, e la sua importanza viene riconosciuta nei CHD, non tradizionalmente considerati ciliopatie. Dati recenti hanno mostrato disfunzione ciliaria respiratoria sia in CHD con eterotaxy²³ che senza eterotassia⁷. Tale disfunzione della ciglia mobile ha dimostrato di tradursi in sintomi^{respiratori maggiori 9} e in una maggiore morbilità post-operatoria⁸. La maggior parte, se non tutte, di queste malattie, hanno modelli di topi disponibili e il nostro protocollo per misurare MCC nei topi è uno strumento prezioso che può essere utilizzato per testare potenziali terapie.

I modelli animali forniscono utilità per la comprensione delle malattie e lo sviluppo di terapie. L'imaging animale in vivo fornisce ulteriore utilità con la capacità di acquisire più punti dati dagli stessi animali, senza la necessità di sacrificare gli animali, consentendo agli investigatori di seguire il decorso longitudinale della malattia e di studiare la durata degli effetti del trattamento. Il modello di topo di MCC è stato sviluppato nel corso di decenni da più investigatori, inizialmente eseguito su cani beagle utilizzando la scintigrafia planare, una tecnica di imaging nucleare bidimensionale²⁴. La tecnica è stata adattata per l'uso nei topi un decennio dopo, seguita dall'adattamento all'imaging SPECT^{un decennio dopo quel 25,26}. Lo sviluppo di questa tecnica nei modelli di topo è stato uno sviluppo importante nella pertinenza di questa tecnica, a causa della disponibilità di più modelli di topi di malattie umane come la PCD in cui la funzione ciliaria è significativamente alterata. McC è stato valutato in modelli di topo di denervazione polmonare e immunosoppressione, e ha il potenziale per essere utilizzato in combinazione con altri^{modelli 19,26}. Sono stati condotti studi di misurazione MCC su pazienti umani con malattie delle vie aeree come CF, asma, PCD e ciliopatie associate alla CHD e hanno dato risultati che la tecnica può aiutare sia gli studi di fisiologia polmonare che l'efficacia^{terapeutica 13}.

Una parte importante di questo protocollo è l'impostazione di acquisizioni con i parametri di imaging corretti per acquisire immagini accurate per la quantificazione. Una serie di fattori sono fondamentali quando si progettano le impostazioni di acquisizione SPECT, tra cui quali collimatori vengono utilizzati, il numero di proiezioni da acquisire per rivoluzione e la dimensione del passo di rotazione. La selezione del collimatore è un fattore importante nella sensibilità e nella risoluzione dell'acquisizione e potrebbe essere necessario adattare le impostazioni di acquisizione al collimatore^{utilizzato 27}. In alternativa, quando si utilizzano animali più grandi come i ratti, i collimatori dovrebbero essere regolati. I collimatori a foro stenopeica multipli, ad esempio, sono più sensibili, ma è necessario prestare attenzione quando si seleziona una dimensione del passo al fine di evitare proiezioni sovrapposte e causare multiplexing indesiderato, che può aumentare ulteriormente la sensibilità dell'acquisizione a scapito di alcune ambiguità dell'immagine che possono causare artefatti di^{ricostruzione 25}. La configurazione della ricostruzione è anche la chiave per generare immagini quantificabili. MAP3D è un algoritmo di ricostruzione iterativa comunemente usato, e PSF è un modello di ricostruzione comune. Entrambi sono affidabili per la ricostruzione delle immagini, ma è necessario prestare attenzione quando si imposta il numero di iterazioni e sottoinsiemi. Un numero maggiore di iterazioni aumenterà il tempo computazionale necessario per la ricostruzione e aumenterà la qualità della ricostruzione con rendimenti decrescenti con un ulteriore aumento.

Per quantificare le immagini in ImageJ, lo strumento di misurazione ideale da utilizzare è RawIntDen, che restituisce il valore di somma dei pixel in una selezione. Quando si quantificano i dati SPECT tra ROI polmonari di dimensioni diverse, l'uso di RawIntDen fornisce una misura assoluta dei conteggi ed evita di regolare la misurazione nell'area del ROI, come farebbe la misurazione media²¹.

Questa tecnica ha una serie di fonti di errore associate di cui lo sperimentatore dovrebbe essere consapevole quando applica questa tecnica. Un importante confondatore è l'uso di agenti anestetici. L'isoflurane è un anestetico ad azione rapida e inalato da cui i topi si riprendono rapidamente dopo il completamento di un'acquisizione. Tuttavia, si dovrebbe fare attenzione a fornire ai topi tutto il tempo per riprendersi nelle loro gabbie e non tenere anestetizzato più a lungo del necessario. Nella nostra esperienza personale (dati inediti) i topi che venivano tenuti anestetizzati continuamente utilizzando isoflurane inalato tra il momento di 0 e 6 ore mostravano una distanza trascurabile. Allo stesso modo, è necessaria anche una dose controllata di anestetico per garantire un rapido recupero. Quando si fissa l'animale al pallet per l'imaging, il tubo fantasma utilizzato per la co-registrazione deve essere tenuto basso sullo stomaco per evitare che gli artefatti si sovrappongano ai polmoni. Allo stesso modo, per garantire un'immagine CT di qualità, fare attenzione a rimuovere eventuali tag metallici dal mouse per evitare artefatti dallo scattering a raggi X.

L'attuale protocollo MCC può essere applicato a una miriade di modelli animali. Questa tecnica ha un effetto trascurabile sulla salute dell'animale scansionato, è ben tollerata dai topi e per questo motivo può essere utilizzata con modelli di malattia senza rischiare la salute di topi già delicati. La forza di questa metodologia deriva dal fatto che si tratta di una tecnica in vivo, che consente l'acquisizione di misurazioni coerenti e ripetibili della funzione delle vie aeree senza il sacrificio degli animali alle trachee di accisa per la video-microscopia, che i modelli ex vivo^{richiedono 26}. La coerenza di questa tecnica nella produzione di misurazioni ripetibili su più scansioni degli stessi animali consente di trattare lo stesso animale con agenti diversi o potenziali terapie e confronti statistici effettuati tra lo stesso animale per ridurre la variabilità biologica inerente a qualsiasi modello animale, riducendo così le dimensioni del campione necessarie per mostrare differenze statisticamente significative.

La valutazione della funzione delle vie aeree utilizzando la tecnica MCC può essere regolata su una varietà di modelli animali e applicata a molti diversi modelli di salute delle vie aeree, oltre a testare nuove terapie. Le vie aeree dei modelli di mouse di PCD possono essere valutate utilizzando questa tecnica, così come i modelli di BPCO. Il nostro metodo può anche essere utilizzato per studiare gli effetti differenziali di vari anestetici su MCC che sono di uso clinico comune. Infine, anche gli effetti degli agenti terapeutici sulle vie aeree possono essere valutati utilizzando questo modello. Come detto in precedenza, ma porta ripetizione, in quanto è una misurazione in vivo consente di ripetere le valutazioni MCC nel corso di una malattia, nonché i benefici di prova degli interventi terapeutici nel tempo. Inoltre, i topi sono gli animali da laboratorio più comuni utilizzati per imitare / studiare le malattie umane, con, in alcuni casi, più modelli di topi transgenici di malattie umane disponibili tra cui scegliere.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
500 µm Unjacketed Fiber Optic Wire	Edmund Optics	02-532
99mTechnecium-Sulfur Colloid	Cardinal Health
Anesthesia Vaporizer	Vetland Medical	A13480
Durmont #5 Forceps	Fine Science Tools	99150-20
FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software
Introcan Safety Catheters 20G 1inch	Fisher Scientific	NC1534477
Isoflurane	Henry Schein	118-2097
Mouse Intubation Stand	Kent Scientific	ETI-MSE-01
Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT	Siemens
Single Channel Anesthesia Stand	Summit Anesthesia Solutions	22860