JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

لقد طورنا بروتوكولا لنقل الخلايا الظهارية الصبغية البشرية الأولية عن طريق التثقيب الكهربائي باستخدام عامل مشتق من ظهارة الصباغ المشفر للجين (PEDF) باستخدام نظام ترانسبوزون Sleeping Beauty (SB). تم إثبات النقل الناجح من خلال تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) ، والنشاف المناعي ، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).

Abstract

يؤدي مجتمعنا المسن بشكل متزايد إلى تزايد حالات الأمراض التنكسية العصبية. حتى الآن ، لا يتم فهم الآليات المرضية بشكل كاف ، مما يعوق إنشاء علاجات محددة. تعتبر العلاجات الجينية المضافة القائمة على الخلايا لزيادة التعبير عن عامل وقائي خيارا واعدا لعلاج الأمراض التنكسية العصبية ، مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD). لقد طورنا طريقة للتعبير المستقر للعامل المشتق من ظهارة الصباغ المشفر للجين (PEDF) ، والذي يتميز بأنه بروتين وقائي عصبي ومضاد لتولد الأوعية في الجهاز العصبي ، في جينوم الخلايا الظهارية الصباغية البشرية الأولية (PE) باستخدام نظام ترانسبوزون الجمال النائم (SB). تم عزل خلايا PE الأولية من عيون المتبرعين البشريين والحفاظ عليها في الثقافة. بعد الوصول إلى نقطة التقاء ، تم تعليق 1 × 104 خلايا في 11 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق ودمجها مع 2 ميكرولتر من محلول نقي يحتوي على 30 نانوغرام من بلازميد ترانسبوزاز SB (SB100X) مفرط النشاط و 470 نانوغرام من بلازميد ترانسبوزون PEDF. تم إجراء التعديل الوراثي باستخدام نظام التثقيب الكهربائي الشعري باستخدام المعلمات التالية: نبضتان بجهد 1100 فولت وعرض 20 مللي ثانية. تم نقل الخلايا المنقولة إلى ألواح استزراع تحتوي على وسط مكمل بمصل بقري جنيني. تمت إضافة المضادات الحيوية ومضادات الميكروبات مع أول تبادل متوسط. تم إثبات النقل الناجح في التجارب التي أجريت بشكل مستقل. أظهر تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) زيادة التعبير عن جين التحوير PEDF. كان إفراز PEDF مرتفعا بشكل ملحوظ وظل مستقرا ، كما تم تقييمه بواسطة النشاف المناعي ، وتم قياسه كميا بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). سمح النقل بوساطة SB100X بتكامل جين PEDF مستقر في جينوم خلايا PE وضمن الإفراز المستمر ل PEDF ، وهو أمر بالغ الأهمية لتطوير علاج إضافة الجينات القائم على الخلايا لعلاج AMD أو الأمراض التنكسية الأخرى في شبكية العين. علاوة على ذلك ، أشار تحليل ملف تعريف تكامل ترانسبوزون PEDF في خلايا PE البشرية إلى توزيع جينومي عشوائي تقريبا.

Introduction

يوصف التقدم في العمر بأنه الخطر الرئيسي للأمراض التنكسية العصبية. التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو مرض متعدد الجينات يؤدي إلى فقدان البصر الشديد لدى المرضى الذين تزيد أعمارهم عن 60 عاما ، ينتمي إلى الأسباب الأربعة الأكثر شيوعا للعمى وضعف البصر1 ومن المتوقع أن يرتفع إلى 288 مليون شخص في عام 20402. تساهم اختلالات ظهارة الصباغ الشبكية (RPE) ، وهي طبقة واحدة من الخلايا المعبأة بإحكام تقع بين المشيمية والمستقبلات الضوئية للشبكية ، في التسبب في AMD. يؤدي RPE مهام متعددة ضرورية لوظيفة الشبكية الطبيعية3 ويفرز مجموعة متنوعة من عوامل النمو والعوامل الأساسية للحفاظ على السلامة الهيكلية للشبكية والمشيمية الشعرية ، وبالتالي دعم بقاء المستقبلات الضوئية وتوفير أساس للدورة الدموية وإمدادات المواد الغذائية.

في العيون السليمة ، العامل المشتق من ظهارة الصباغ (PEDF) مسؤول عن موازنة تأثيرات عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) ويحمي الخلايا العصبية من موت الخلايا المبرمج ، ويمنع تكاثر الخلايا البطانية ، ويثبت البطانة الشعرية. ترتبط نسبة VEGF إلى PEDF المتغيرة بالأوعية الدموية الجديدة للعين ، والتي لوحظت في النماذج الحيوانية 4,5 وكذلك في عينات من المرضى الذين يعانون من الأوعية الدموية المشيمية (CNV) بسبب AMD واعتلال الشبكية السكري التكاثري6،7،8،9،10 . تركيز VEGF المعزز هو الهدف للعلاج القياسي الحالي. تعمل الأدوية المضادة ل VEGF بيفاسيزوماب ورانيبيزوماب وأفليبيرسيبت ومؤخرا برولوسيزوماب على تحسين حدة البصر في حوالي ثلث مرضى CNV أو بالأحرى تثبيت الرؤية في 90٪ من الحالات11،12،13. ومع ذلك ، فإن الحقن داخل الجسم الزجاجي المتكررة ، وغالبا ما تكون شهرية ، تحمل مخاطر الأحداث الضائرة14 ، وتضعف امتثال المريض ، وتمثل عبئا اقتصاديا كبيرا على أنظمة الرعاية الصحية15. علاوة على ذلك ، فإن نسبة معينة من المرضى (2٪ -20٪) لا يستجيبون أو يتفاعلون بشكل سيئ فقط مع العلاج المضاد ل VEGF16،17،18،19. تتطلب هذه المصاحبة السلبية تطوير علاجات بديلة ، على سبيل المثال ، الغرسات داخل العين ، والنهج العلاجية الخلوية و / أو الجينية.

تطور العلاج الجيني كعلاج واعد للأمراض الوراثية وغير الوراثية ويهدف إلى استعادة تسلسل الجينات غير الوظيفية أو قمع التسلسلات المعطلة. بالنسبة للأمراض متعددة الجينات ، حيث يصعب تحديد العوامل المسببة واستبدالها ، تهدف الاستراتيجيات إلى التسليم المستمر لعامل الحماية. في حالة AMD ، تم تطوير العديد من العلاجات المضافة ، مثل التعبير المستقر عن الإندوستاتين والأنجيوستاتين 20 ، ومضاد VEGF القابل للذوبان مثل التيروزين كيناز -1 (sFLT-1) 21،22 ، ومجموعة البروتين التنظيمية التكميلية للتمايز 59 (CD59) 23 أو PEDF24,25 . تعد العين ، وخاصة شبكية العين ، هدفا ممتازا للأدوية القائمة على الجينات بسبب البنية المغلقة ، وسهولة الوصول ، وصغر حجمها ، وامتيازها المناعي ، مما يسمح بالتسليم الموضعي لجرعات علاجية منخفضة ويجعل عمليات الزرع أقل عرضة للرفض. علاوة على ذلك ، تتيح العين المراقبة غير الغازية ، ويمكن فحص شبكية العين بواسطة تقنيات تصوير مختلفة.

النواقل الفيروسية هي ، بسبب كفاءتها العالية في النقل ، الوسيلة الرئيسية لتوصيل الجينات العلاجية إلى الخلايا المستهدفة. ومع ذلك ، اعتمادا على الناقل الفيروسي المستخدم ، تم وصف ردود فعل سلبية مختلفة ، مثل الاستجابات المناعية والالتهابية26 ، والتأثيرات المطفرة والمسرطنة 27,28 ، أو الانتشار في الأنسجة الأخرى29. تشمل القيود العملية حجم العبوةالمقيد 30 بالإضافة إلى الصعوبات والتكاليف المرتبطة بإنتاج مجموعات الصفالسريري 31,32. وقد عززت هذه العيوب زيادة تطوير النواقل غير الفيروسية القائمة على البلازميد التي يتم نقلها عن طريق ليبو-/بوليبلكس، الموجات فوق الصوتية أو التثقيب الكهربائي. ومع ذلك ، لا يتم عادة تعزيز التكامل الجيني للجين المحوري في الجينوم المضيف مع ناقلات البلازميد ، مما يؤدي إلى تعبير عابر.

الترانسبوزونات هي شظايا الحمض النووي التي تحدث بشكل طبيعي والتي تغير موقعها داخل الجينوم ، وهي خاصية تم تبنيها للعلاج الجيني. نظرا لآلية التكامل النشطة ، تسمح أنظمة النواقل القائمة على الترانسبوزون بالتعبير المستمر والمستمر عن جين التحوير المدرج. إن ترانسبوزون الجمال النائم (SB) ، الذي أعيد تشكيله من ترانسبوزون قديم من نوع Tc1 / مارينر موجود في الأسماك33 وتم تحسينه بشكل أكبر من خلال التطور الجزيئي مما أدى إلى متغير فرط النشاط SB100X34 ، مكن من النقل الفعال في الخلايا الأولية المختلفة واستخدم لتصحيح النمط الظاهري في نماذج الأمراض المختلفة35. في الوقت الحاضر ، تم بدء 13 تجربة سريرية باستخدام نظام SB transposon. يتكون نظام الترانسبوزون SB100X من مكونين: الترانسبوزون ، الذي يتألف من الجين محل الاهتمام المحاط بالتكرارات المقلوبة الطرفية (TIRs) ، والترانسبوزاز ، الذي يحشد الترانسبوزون. بعد توصيل الحمض النووي البلازميد إلى الخلايا ، يربط الترانسبوزاز TIRs ويحفز استئصال ودمج الترانسبوزون في جينوم الخلية.

لقد قمنا بتطوير علاج مضاف غير فيروسي قائم على الخلايا لعلاج AMD الوعائي الجديد. يشتمل النهج على إدخال جين PEDF القائم على التثقيب الكهربائي في الخلايا الظهارية الصبغية الأولية (PE) عن طريق نظام ترانسبوزون SB100X 36،37،38. يتم توفير المعلومات الوراثية ل transposase و PEDF على بلازميدات منفصلة ، مما يتيح تعديل نسبة الترانسبوزون SB100X إلى PEDF المثالية. يتم إجراء التثقيب الكهربائي باستخدام نظام نقل شعري قائم على الماصة يتميز بحجم فجوة كبير بين الأقطاب الكهربائية مع تقليل مساحة سطحها. وقد تبين أن الجهاز يحقق معدلات نقل ممتازة في مجموعة واسعة من خلايا الثدييات39،40،41. توفر مساحة سطح القطب الصغير مجالا كهربائيا موحدا وتقلل من الآثار الجانبية المختلفة للتحليل الكهربائي42.

تم عرض الوظيفة المضادة لتولد الأوعية الدموية ل PEDF التي تفرزها الخلايا الظهارية الصبغية المنقولة في تجارب مختلفة في المختبر تحلل نبتة وهجرة وموت الخلايا المبرمج للخلايا البطانية الوريدية السرية البشرية43. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر زرع الخلايا المنقولة PEDF في نموذج أرنب من الأوعية الدموية القرنية44 بالإضافة إلى نموذج الفئران من CNV43،45،46 انخفاضا في الأوعية الدموية الجديدة.

هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا للإدخال المستقر لجين PEDF في خلايا RPE البشرية الأولية عبر نظام transposon SB100X باستخدام نظام نقل الشعيرات الدموية. تم الاحتفاظ بالخلايا المنقولة في المزرعة لمدة 21 يوما وتم تحليلها لاحقا من حيث التعبير الجيني PEDF عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) ومن حيث إفراز بروتين PEDF عن طريق النشاف المناعي ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA ، الشكل 1).

Protocol

تم الحصول على عيون متبرع بشري من بنك آخن للقرنية التابع لقسم طب العيون (مستشفى جامعة RWTH آخن) بعد الحصول على موافقة مستنيرة وفقا لبروتوكولات إعلان هلسنكي. تمت الموافقة على إجراءات جمع واستخدام العينات البشرية من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية.

1. عزل خلايا RPE البشرية الأولية

  1. وضع الملابس والقفازات واقية معقمة. ضع ستارة معقمة تحت تدفق رقائقي.
  2. ضع أدوات التحضير المعقمة وغيرها من المعدات المعقمة الضرورية تحت التدفق الرقائقي.
  3. سجل استلام كرات العين ، وبداية التحضير وكذلك التشوهات المحتملة. تسجيل عمر المتبرع وجنسه وسبب الوفاة والفترة بين وقت الوفاة وإزالة العين.
  4. ضع كرة العين في ضغط شاش معقم وأمسكها بيد واحدة.
  5. افصل الجزء الأمامي عن الجزء الخلفي عن طريق قطع محيطي حوالي 3.5 مم من الخلف إلى الحافة باستخدام مشرط ومقص عين مدبب دقيق للغاية.
  6. بعد إمالة الجزء الخلفي لأسفل ، قم بإزالة الجسم الزجاجي والشبكية بعناية باستخدام ملقط كوليبري.
  7. أعد ترتيب مجمع RPE / choroidea المنهار بتكتم باستخدام ملقط قزحية مستقيم ثم ثبته في موضعه باستخدام ملقط قزحية منحني.
  8. املأ كوب العين الخلفي ب 1 مل من خليط المغذيات F-12 من Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Ham's F-12 (DMEM / F12) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) و 80 وحدة / مل بنسلين و 80 ميكروغرام / مل ستربتومايسين (Pen / Strep) و 2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B (AmphoB).
    ملاحظة: على عكس عزل خلايا RPE الأولية من عيون الخنازير أو الأبقار36,37 ، لا يلزم ملء كوب العين الخلفي وتحضينه بالتريبسين.
  9. احصد خلايا RPE عن طريق تنظيف ظهارة صبغة الشبكية برفق من العصب البصري باتجاه الحافة باستخدام ماصة باستور الزجاجية المنحنية المصقولة بالنار ، مع تثبيت مجمع RPE / choroidea في النسيان باستخدام ملقط كوليبري. نقل تعليق الخلية إلى طبق بتري.
  10. كرر الخطوتين 1.8 و 1.9 واجمع كل الخلايا في طبق بتري. أعد تعليق تعليق الخلية بعناية عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة أحادية القناة (100-1000 ميكرولتر).
  11. قم بزرع معلق خلية RPE لكل كرة عين في ثلاثة آبار من صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا واملأها حتى 1 مل باستخدام DMEM / F12 المكمل ب FBS و Pen / Strep و AmphoB.
  12. حافظ على مزارع خلايا RPE عند 37 درجة مئوية في جو مرطب من 95٪ هواء و 5٪ CO2 حتى يتم الوصول إلى التقاء. تغيير وسط ثقافة الخلية مرتين في الأسبوع.

2. التثقيب الكهربائي لخلايا RPE البشرية الأولية

  1. تحضير خليط بلازميد الترانسبوزون SB100X / PEDF
    1. تنقية SB100X transposase و PEDF transposon plasmid DNA باستخدام مجموعات تنقية البلازميد العرفية ، والتي تم تحديدها لتكون مناسبة للاستخدام في تطبيقات مثل transfection ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    2. تحديد محتويات الحمض النووي البلازميد باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير الحجم وضبطها على تركيز 250 نانوغرام / ميكرولتر مع 10 mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 8.5).
    3. امزج جزءا واحدا من 250 نانوغرام / ميكرولتر SB100X transposase plasmid DNA (على سبيل المثال ، 2.5 ميكرولتر) مع 16 جزءا من 250 نانوغرام / ميكرولتر PEDF transposon plasmid DNA (على سبيل المثال ، 40 ميكرولتر). يمكن تخزين خليط البلازميد المتبقي عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة المتعددة لخليط البلازميد.
    4. ضع 2 ميكرولتر من خليط بلازميد ترانسبوزون SB100X / PEDF transposon ، الذي يحتوي على 29.4 نانوغرام من بلازميد ترانسبوزاز SB100X و 470.6 نانوغرام من بلازميد ترانسبوزون PEDF ، في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل آمن. يحفظ على الثلج حتى يختلط بالخلايا.
  2. إعداد نظام نقل الشعيرات الدموية
    ملاحظة: تم إجراء التثقيب الكهربائي لخلايا RPE البشرية الأولية عبر نظام نقل شعري باستخدام مجموعة 10 ميكرولتر وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. يتكون النظام من جهاز النقل ، وماصة النقل ، ومحطة الماصة. تحتوي المجموعة على 10 ميكرولتر من أطراف النقل ، وأنابيب عازلة ، ومخزن كهربائي E (المخزن المؤقت E) ، ومخزن إعادة التعليق R (المخزن المؤقت R).
    1. قم بتوصيل محطة الماصة بجهاز النقل.
    2. املأ أنبوبا عازلا ب 3 مل من المخزن المؤقت E وأدخله في محطة الماصة حتى يسمع صوت نقرة.
      ملاحظة: تأكد من توصيل القطب الجانبي للأنبوب العازل بالمكبس الكروي الجانبي لمحطة الماصة.
    3. للتثقيب الكهربائي لخلايا RPE البشرية الأولية ، اضبط شروط النبض التالية على جهاز النقل: 1100 فولت (جهد النبض) ، 20 مللي ثانية (عرض النبضة) ، نبضتان (رقم النبضة).
  3. تحضير خلايا RPE البشرية الأولية المزروعة
    1. توثيق شكل ومورفولوجيا مزارع خلايا RPE الأولية عبر الفحص المجهري لتباين الطور. خذ صورا مجهرية منخفضة التكبير لإثبات نمو خلايا RPE إلى طبقة أحادية متقاربة ومتكاملة بالإضافة إلى صور مجهرية مكبرة أعلى للإشارة إلى مورفولوجيا الحصى النموذجية لخلايا RPE.
    2. نضح وسط زراعة الخلية وغسل الخلايا مرتين مع 1 مل محلول ملحي فوسفات مخزن (PBS ، درجة الحموضة 7.4).
    3. التربسينات خلايا RPE البشرية الأولية مع 0.5 مل 0.05٪ تربسين-EDTA عند 37 درجة مئوية في جو مرطب من 95٪ هواء و 5٪ CO2 لمدة 7-15 دقيقة (كحد أقصى). تحقق من انفصال الخلية مجهريا.
    4. أوقف التربسين مع 1 مل من DMEM / F12 المكمل ب FBS. خذ حصة 20 ميكرولتر لعد الخلايا باستخدام مقياس الدم. جهاز طرد مركزي لنظام تعليق خلية RPE عند 106 × جم لمدة 10 دقائق.
    5. امزج القسمة 20 ميكرولتر مع محلول تريبان أزرق 20 ميكرولتر. ماصة 10 ميكرولتر في كل نصف من مقياس الدم وعد الخلايا تحت مجهر تباين الطور.
    6. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق حبيبات خلية RPE في 1 مل من PBS.
    7. خذ 10000-100000 خلية RPE لكل تفاعل نقل وطرد مركزي لها عند 106 × جم لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: بجانب تفاعلات النقل مع تطبيق المجال الكهربائي وإضافة الحمض النووي البلازميد ، يتضمن كل نهج أيضا ثقافتين مختلفتين للتحكم: (1) بدون تطبيق المجال الكهربائي وبدون الحمض النووي البلازميد. (2) مع تطبيق المجال الكهربائي ، ولكن بدون الحمض النووي البلازميد.
    8. أعد تعليق حبيبات الخلية في 11 ميكرولتر من المخزن المؤقت R وادمجها مع 2 ميكرولتر من خليط بلازميد ترانسبوزون SB100X transposase / PEDF (انظر الخطوة 2.1.4).
      ملاحظة: بعد إعادة التعليق في المخزن المؤقت R ، يجب معالجة الخلايا في غضون 15 دقيقة لتجنب انخفاض صلاحية الخلية وكفاءة النقل.
    9. أدخل رأس ماصة النقل في طرف النقل 10 ميكرولتر حتى يلتقط المشبك جذع التثبيت للمكبس بالكامل. ارسم محلول الخلية / البلازميد في طرف النقل.
      ملاحظة: تجنب توليد فقاعات الهواء وشفطها في طرف النقل.
    10. قم بتوفير 1 مل من DMEM / F12 المكمل ب FBS ، ولكن بدون Pen / Strep وبدون AmphoB ، في العدد المطلوب من الآبار للوحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا.
  4. عملية التثقيب الكهربائي
    1. أدخل ماصة النقل في الأنبوب العازل الموجود في محطة الماصة (انظر الخطوة 2.2.2) حتى يسمع صوت نقرة.
      ملاحظة: تأكد من توصيل الرأس المعدني لماصة النقل بالمكبس الكروي داخل محطة الماصة والأنبوب العازل.
    2. اضغط على ابدأ على شاشة اللمس لجهاز النقل. قبل تطبيق النبضة الكهربائية ، يتحقق الجهاز تلقائيا مما إذا كان الأنبوب العازل وماصة النقل قد تم إدخالهما بشكل صحيح. بعد توصيل النبضات الكهربائية ، يتم عرض Complete على شاشة اللمس.
    3. قم بإزالة ماصة النقل بعناية من محطة الماصة وحرر الخلايا المكهربة على الفور من طرف النقل 10 ميكرولتر عن طريق سحب محلول الخلية / البلازميد في الآبار المحضرة للوحة زراعة الخلايا (انظر الخطوة 2.3.10).
    4. الحفاظ على مزارع خلايا RPE المنقولة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 95٪ هواء و 5٪ CO2. أضف القلم / العقدية و AmphoB مع أول تبادل متوسط بعد 3 أيام من التثقيب الكهربائي.

3. تحليلات خلايا RPE البشرية الأولية المنقولة

  1. إعداد العينة
    1. بعد وقت زراعة مدته 3 أسابيع ، قم في النهاية باحتضان مزارع خلايا RPE بحجم محدد يبلغ 1.0 مل DMEM / F12 مع FBS و Pen / Strep و AmphoB لفترة محددة تبلغ 24 ساعة.
    2. خذ طاف زراعة الخلايا وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة في وقت قريب أو عند -80 درجة مئوية للعينات غير المستقرة حراريا والتخزين طويل الأجل.
    3. قم بالتريبسين بزراعة خلايا RPE المنقولة مع 0.5 مل من 0.05٪ تربسين-EDTA عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 95٪ هواء و 5٪ CO2 لمدة 10 دقائق.
    4. أوقف التربسين مع 1 مل من DMEM / F12 المكمل ب FBS. خذ حصصا صغيرة لعد الخلايا باستخدام مقياس الدم (انظر الخطوة 2.3.5). جهاز طرد مركزي لنظام تعليق خلية RPE عند 106 × جم لمدة 10 دقائق.
    5. قم بتخزين كريات خلية RPE عند -80 درجة مئوية حتى تتم المعالجة الإضافية.
  2. تقييم إفراز PEDF عن طريق النشاف الغربي
    ملاحظة: لإجراء تقييم نوعي، يتم تحليل المواد الطافية لزراعة الخلايا (انظر الخطوة 3.1.2) عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الصوديوم (SDS-PAGE) والنشاف الغربي اللاحق. اعتمادا على PEDF الحمض النووي البلازميد transposon المستخدمة ، يجب معالجة المواد الطافية بشكل مختلف.
    1. تنقية بروتينات اندماج PEDF الموسومة من طاف زراعة الخلايا
      1. خذ ملاط حمض النيكل والنيتريلوتريسيتيك (Ni-NTA) 30 ميكرولتر لكل عينة باستخدام طرف مقطوع شطبة وحبيبات راتنج Ni-NTA عن طريق الطرد المركزي (2,660 × جم لمدة 30 ثانية).
      2. أعد تعليق راتنج Ni-NTA بعناية باستخدام 200 ميكرولتر من مخزن الحضانة 1x (50 mM NaH 2 PO4 ، 300 mM NaCl ، 10 mM imidazole ، pH 8.0) وحبيباته بالطرد المركزي (2,660 × جم لمدة 30 ثانية).
      3. كرر الخطوة السابقة.
      4. أعد تعليق راتنج Ni-NTA بعناية باستخدام مخزن حضانة 40 ميكرولتر 4x (200 mM NaH 2 PO4 ،1.2M NaCl ، 40 mM imidazole ، درجة حموضة 8.0) لكل عينة.
      5. امزج 900 ميكرولتر من طافي زراعة الخلايا مع 260 ميكرولتر من محلول الحضانة 4x و 55 ميكرولتر من ملاط Ni-NTA المعالج مسبقا (انظر الخطوة 3.2.1.4).
      6. احتضان الخليط على شاكر هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
      7. بيليه راتنج Ni-NTA عن طريق الطرد المركزي (2660 × جم لمدة 60 ثانية).
      8. أعد تعليق راتنج Ni-NTA بعناية باستخدام 175 ميكرولتر من مخزن الحضانة 1x وراتنج الحبيبات عن طريق الطرد المركزي (2660 × جم لمدة 60 ثانية).
      9. كرر الخطوة السابقة.
      10. أعد تعليق راتنج Ni-NTA بعناية باستخدام 30 ميكرولتر من محلول الشطف (50 mM NaH2PO4 ، 300 mM NaCl ، 250 mM imidazole ، درجة الحموضة 8.0) واحتضان الخليط على شاكر هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
      11. بيليه راتنج Ni-NTA عن طريق الطرد المركزي (2,660 × جم لمدة 30 ثانية).
      12. خذ الطافية بعناية واخلطها مع 2x SDS عينة عازلة47.
      13. سخني الخليط على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وافصلي البروتينات المنقاة Ni-NTA على جل SDS-polyacrylamide بنسبة 10٪.
      14. قم بإجراء النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل Penta-His (الفأر أحادي النسيلة ، 1: 500) والأجسام المضادة المضادة للفأر المترافقة بيروكسيديز الفجل (HRP) (أرنب متعدد النسيلة ، 1: 1,000) كما هو موضح سابقا36,37.
    2. التحليل المباشر لبروتينات PEDF غير الموسومة
      1. خذ 15 ميكرولتر من طاف زراعة الخلايا واخلطه مع 2x SDS عينة عازلة47.
      2. سخني الخليط على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وافصلي البروتينات على جل SDS-polyacrylamide بنسبة 10٪.
      3. قم بإجراء النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة PEDF المضادة للإنسان (أرنب متعدد النسيلة ، 1: 4000) وأجسام مضادة للأرانب مقترنة HRP (الماعز متعدد النسيلة ، 1: 2000) كما هو موضح سابقا38.
    3. القياس الكمي لإفراز PEDF بواسطة ELISA
      1. تحليل طاف زراعة الخلايا (انظر الخطوة 3.1.2) باستخدام مجموعة PEDF ELISA البشرية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      2. اربط كمية PEDF المفرزة بالوقت ورقم الخلية المحددين لكل تفاعل نقل (انظر الخطوة 3.1.4).
    4. تحليل التعبير الجيني PEDF في خلايا RPE المنقولة
      1. عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من كريات خلايا RPE (انظر الخطوة 3.1.5) باستخدام مجموعة متاحة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      2. تحديد محتويات الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير.
      3. قم بإجراء النسخ العكسي على 0.1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي باستخدام نظام النسخ العكسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      4. قم بإجراء qPCR في الوقت الفعلي كما هو موضح سابقا38.
    5. تحليل مواقع إدخال الجينات المحورة في خلايا RPE المنقولة
      1. عزل الحمض النووي الجينومي من كريات خلايا RPE (انظر الخطوة 3.1.5) باستخدام مجموعة متاحة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      2. تحديد محتويات الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير.
      3. قم بإنشاء مكتبات موقع الإدراج باستخدام مخطط PCR الخاص ب hemi بمساعدة الحساب كما هو موضح سابقا38.
      4. إجراء التحليل الحسابي كما هو موضح سابقا38.

النتائج

زراعة خلايا RPE البشرية الأولية والتثقيب الكهربائي لها
لقد أظهرنا أن بذر عدد كاف من خلايا RPE الأولية ذات الأصل الحيواني يسمح بالزراعة والنمو إلى طبقة أحادية متكاملة من الخلايا المصطبغة سداسية الشكل36،37،48. تعكس ...

Discussion

في مشروعنا ، نهدف إلى الإنتاج غير الفيروسي لخلايا RPE البشرية الأولية المعدلة وراثيا والتي تفرط باستمرار في التعبير عن عامل فعال وتفرز من أجل استخدام الخلايا المنقولة كعلاج طويل الأجل لإنشاء بيئة واقية والحفاظ عليها. لقد أنشأنا إدخال الترميز الجيني PEDF ، وهو بروتين متعدد الوظائف يتم التعبي...

Disclosures

زولتان إيفيكس وزسوزانا إيزفاك مخترعان في العديد من براءات الاختراع على تقنية SB transposon

Acknowledgements

وحظي هذا العمل بدعم البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي للبحث والتطوير التكنولوجي والبيان العملي، اتفاق المنحة رقم 305134. تم تمويل Zsuzsanna Izsvák من قبل مجلس البحوث الأوروبي ، ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). يود المؤلفون أن يشكروا آنا دوبياس وأنتجي شيفر (قسم طب العيون ، مستشفى جامعة RWTH آخن) على الدعم الفني الممتاز ، وبنك آخن القرنية (قسم طب العيون ، مستشفى جامعة RWTH آخن) لتوفير عيون المتبرع البشري.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture PlateEppendorf, Hamburg, Germany0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, GermanyA2942
Colibri ForcepsGeuder, Heidelberg, GermanyG-18950
Curved Iris Forceps Geuder, Heidelberg, GermanyG-18856
Disposable Scalpel (No. 11)Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, GermanyP04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor Geuder, Heidelberg, GermanyG-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, GermanyP40-37500
Glass Pasteur PipettesBrand, Wertheim, Germany747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)Merck, Darmstadt, GermanyP0781
Pipette Tips (1000 µL)Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile DrapeLohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress Fink-Walter, Merchweiler, Germany321063
Sterile GlovesSempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)Corning, Corning, NY351007
Sterile Surgical GownHalyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps Geuder, Heidelberg, GermanyG-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture PlateThermo Fisher Scientific, Waltham, MA150628
24-Well Cell Culture PlateEppendorf, Hamburg, Germany0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, GermanyA2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, GermanyP04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, GermanyP40-37500
Inverted MicroscopeLeica Mikrosysteme, Wetzlar, GermanyLeica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAMPK5000
Neon Transfection System 10 µL KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAMPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber)Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+Biochrom, Berlin, GermanyL182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)Merck, Darmstadt, GermanyP0781
Pipette Tips (10 µL)Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi KitQiagen, Hilden, Germany12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue SolutionMerck, Darmstadt, GermanyT8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting MembraneCytiva, Marlborough, MA10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, GermanyA2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)BioProducts, Middletown, MDAB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)Qiagen, Hilden, Germany34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, GermanyP04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) 
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, GermanyP40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber)Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)Agilent Dako, Santa Clara, CAP0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)Abcam, Cambridge, United Kingdomab6721
Human PEDF ELISA Kit BioProducts, Middletown, MDPED613
LAS-3000 Imaging SystemFujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 InstrumentRoche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green IRoche Life Science, Penzberg, Germany12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl)Roche Life Science, Penzberg, Germany4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting ModuleBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gelBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany1658004
Ni-NTA SuperflowQiagen, Hilden, Germany30410
PageRuler Prestained Protein LadderThermo Fisher Scientific, Waltham, MA26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)Merck, Darmstadt, GermanyP0781
Pipette Tips (10 µL)Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power SupplyBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany1645050
QIAamp DNA Mini KitQiagen, Hilden, Germany51304
Reverse Transcription System Promega, Madison, WIA3500
RNase-Free DNase SetQiagen, Hilden, Germany79254
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany74104
Rocking ShakerCole-Parmer, Staffordshire, United KingdomSSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer SystemBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany1704150
Trypan Blue SolutionMerck, Darmstadt, GermanyT8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054

References

  1. James, S. L., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
  2. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  5. Gao, G., et al. Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. FEBS Letters. 489 (2-3), 270-276 (2001).
  6. Bhutto, I. A., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in aged human choroid and eyes with age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 82 (1), 99-110 (2006).
  7. Holekamp, N. M., Bouck, N., Volpert, O. Pigment epithelium-derived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 134 (2), 220-227 (2002).
  8. Kolomeyer, A. M., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Characterization of conditioned media collected from aged versus young human eye cups. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5963-5972 (2011).
  9. Li, X., et al. The significance of the increased expression of phosphorylated MeCP2 in the membranes from patients with proliferative diabetic retinopathy. Scientific Reports. 6, 32850 (2016).
  10. Mohan, N., Monickaraj, F., Balasubramanyam, M., Rema, M., Mohan, V. Imbalanced levels of angiogenic and angiostatic factors in vitreous, plasma and postmortem retinal tissue of patients with proliferative diabetic retinopathy. Journal of Diabetes and its Complications. 26 (5), 435-441 (2012).
  11. Empeslidis, T., et al. How successful is switching from Bevacizumab or Ranibizumab to Aflibercept in Age-Related Macular Degeneration? A systematic overview. Advances in Therapy. 36 (7), 1532-1548 (2019).
  12. Solomon, S. D., Lindsley, K., Vedula, S. S., Krzystolik, M. G., Hawkins, B. S. Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3, (2019).
  13. Dugel, P. U., et al. phase 3, multicenter, randomized, double-masked trials of brolucizumab for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 127 (1), 72-84 (2020).
  14. Falavarjani, K. G., Nguyen, Q. D. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature. Eye. 27 (7), 787-794 (2013).
  15. Jaffe, D. H., Chan, W., Bezlyak, V., Skelly, A. The economic and humanistic burden of patients in receipt of current available therapies for nAMD. Journal of Comparative Effectiveness Research. 7 (11), 1125-1132 (2018).
  16. Eghoj, M. S., Sorensen, T. L. Tachyphylaxis during treatment of exudative age-related macular degeneration with ranibizumab. British Journal of Ophthalmology. 96 (1), 21-23 (2012).
  17. Forooghian, F., Cukras, C., Meyerle, C. B., Chew, E. Y., Wong, W. T. Tachyphylaxis after intravitreal bevacizumab for exudative age-related macular degeneration. Retina - The Journal of Retinal and Vitreous Diseases. 29 (6), 723-731 (2009).
  18. Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology. 7, 1487-1490 (2013).
  19. Zuber-Laskawiec, K., Kubicka-Trzaska, A., Karska-Basta, I., Pociej-Marciak, W., Romanowska-Dixon, B. Non-responsiveness and tachyphylaxis to anti-vascular endothelial growth factor treatment in naive patients with exudative age-related macular degeneration. Journal of Physiology and Pharmacology. 70 (5), (2019).
  20. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28 (1), 99-111 (2017).
  21. Constable, I. J., et al. Phase 2a randomized clinical trial: safety and post hoc analysis of subretinal rAAV.sFLT-1 for wet age-related macular degeneration. EBioMedicine. 14, 168-175 (2016).
  22. Rakoczy, E. P., et al. Three-year follow-up of phase 1 and 2a rAAV.sFLT-1 subretinal gene therapy trials for exudative age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 204, 113-123 (2019).
  23. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - from hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  24. Campochiaro, P. A., et al. Adenoviral vector-delivered pigment epithelium-derived factor for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial. Human Gene Therapy. 17 (2), 167-176 (2006).
  25. Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Human Gene Therapy. 22 (5), 523-529 (2011).
  26. Ahi, Y. S., Bangari, D. S., Mittal, S. K. Adenoviral vector immunity: its implications and circumvention strategies. Current Gene Therapy. 11 (4), 307-320 (2011).
  27. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. New England Journal of Medicine. 363 (4), 355-364 (2010).
  28. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. Journal of Clinical Investigation. 118 (9), 3143-3150 (2008).
  29. Stieger, K., et al. Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain. Molecular Therapy. 16 (5), 916-923 (2008).
  30. Tornabene, P., Trapani, I. Can adeno-associated viral vectors deliver effectively large genes. Human Gene Therapy. 31 (1-2), 47-56 (2020).
  31. Ayuso, E. Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors: new technologies are welcome. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 15049 (2016).
  32. van der Loo, J. C., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25, 42-52 (2016).
  33. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
  34. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  35. Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32 (9), 756-767 (2010).
  36. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17 (2), 181-189 (2010).
  37. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  38. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  39. Abdul Halim, N. S., Fakiruddin, K. S., Ali, S. A., Yahaya, B. H. A comparative study of non-viral gene delivery techniques to human adipose-derived mesenchymal stem cell. International Journal of Molecular Sciences. 15 (9), 15044-15060 (2014).
  40. Ahlemeyer, B., Vogt, J. F., Michel, V., Hahn-Kohlberger, P., Baumgart-Vogt, E. Microporation is an efficient method for siRNA-induced knockdown of PEX5 in HepG2 cells: evaluation of the transfection efficiency, the PEX5 mRNA and protein levels and induction of peroxisomal deficiency. Histochemistry and Cell Biology. 142 (5), 577-591 (2014).
  41. May, R. D., et al. Efficient nonviral transfection of primary intervertebral disc cells by electroporation for tissue engineering application. Tissue Engineering Part C - Methods. 23 (1), 30-37 (2017).
  42. Kim, J. A., et al. A novel electroporation method using a capillary and wire-type electrode. Biosensors & Bioelectronics. 23 (9), 1353-1360 (2008).
  43. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. Biomed Research International. 2015, 863845 (2015).
  44. Kuerten, D., et al. Transplantation of PEDF-transfected pigment epithelial cells inhibits corneal neovascularization in a rabbit model. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (7), 1061-1069 (2015).
  45. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  46. Hernandez, M., et al. Preclinical evaluation of a cell-based gene therapy using the Sleeping Beauty transposon system in choroidal neovascularization. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 403-417 (2019).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Johnen, S., et al. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  49. Gogol-Doring, A., et al. Genome-wide profiling reveals remarkable parallels between insertion site selection properties of the MLV retrovirus and the piggyBac transposon in primary human CD4(+) T cells. Molecular Therapy. 24 (3), 592-606 (2016).
  50. Holstein, M., et al. Efficient non-viral gene delivery into human hematopoietic stem cells by minicircle Sleeping Beauty transposon vectors. Molecular Therapy. 26 (4), 1137-1153 (2018).
  51. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Molecular Therapy. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  52. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Molecular and Cellular Biology. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  53. Grabundzija, I., et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Molecular Therapy. 18 (6), 1200-1209 (2010).
  54. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  55. Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab on a Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
  56. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
  57. Johnen, S., et al. Endogenic regulation of proliferation and zinc transporters by pigment epithelial cells nonvirally transfected with PEDF. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5400-5407 (2011).
  58. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the Sleeping Beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

168 AMD PEDF SB

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved