使用睡美人转座子系统对原代人色素上皮细胞进行基于电穿孔的遗传修饰

摘要

我们开发了一种方案，通过使用 睡美人 （SB）转座子系统，通过编码色素上皮衍生因子（PEDF）的基因电穿孔来转染原代人色素上皮细胞。定量聚合酶链反应（qPCR）、免疫印迹和酶联免疫吸附测定（ELISA）证明了成功的转染。

摘要

我们日益老龄化的社会导致神经退行性疾病的发病率上升。到目前为止，病理机制尚未得到充分了解，从而阻碍了确定的治疗方法的建立。用于增加保护因子表达的基于细胞的添加剂基因疗法被认为是治疗神经退行性疾病（如年龄相关性黄斑变性（AMD））的有前途的选择。我们开发了一种使用 睡美人 （SB）转座子系统将编码色素上皮衍生因子（PEDF）的基因稳定表达到原代人色素上皮（PE）细胞基因组中的方法，该因子的特征是神经系统中的神经保护和抗血管生成蛋白。从人类供体的眼睛中分离原代PE细胞并保持培养。达到汇合后，将1 x 10⁴ 个细胞悬浮在11 μL重悬缓冲液中，并与含有30 ng高活性 SB （SB100X）转座酶质粒和470 ng PEDF 转座子质粒的2 μL纯化溶液合并。使用以下参数使用毛细管电穿孔系统进行基因改造:两个电压为1，100 V，宽度为20 ms的脉冲。将转染的细胞转移到含有补充有胎牛血清的培养基的培养板中;在第一次培养基交换时加入抗生素和抗真菌药。在独立进行的实验中证明了成功的转染。定量聚合酶链反应（qPCR）显示 PEDF 转基因的表达增加。通过免疫印迹评估，并通过酶联免疫吸附测定（ELISA）定量，PEDF分泌显着升高并保持稳定。 SB100X介导的转移允许稳定的PEDF基因整合到PE细胞的基因组中，并确保 PEDF 的连续分泌，这对于开发基于细胞的基因添加疗法以治疗AMD或其他视网膜退行性疾病至关重要。此外，对 PEDF 转座子与人PE细胞的整合谱的分析表明，基因组分布几乎是随机的。

引言

高龄被描述为神经退行性疾病的主要风险。年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种导致60岁以上患者严重视力丧失的多基因疾病，属于失明和视力障碍的四个最常见原因1，预计到2040年将增加到2.88亿人^2。视网膜色素上皮（RPE）功能障碍，即位于绒毛细血管和视网膜光感受器之间的单层紧密堆积的细胞，有助于AMD的发病机制。RPE完成对正常视网^膜功能3至关重要的多项任务，并分泌多种生长因子和维持视网膜和脉络膜毛细血管结构完整性所必需的因子，从而支持光感受器存活并为循环和营养供应提供基础。

在健康的眼睛中，色素上皮衍生因子（PEDF）负责平衡血管内皮生长因子（VEGF）的作用，保护神经元免受细胞凋亡，防止内皮细胞增殖，并稳定毛细血管内皮。VEGF与PEDF比值的转移与眼部新生血管形成有关，在动物模型⁴，⁵以及AMD和增殖性糖尿病视网膜病变引起的脉络膜新生血管（CNV）患者样本中观察到6，⁷，⁸，^9，10.提高的VEGF浓度是当前标准处理的目标。抗VEGF药物贝伐珠单抗，雷珠单抗，阿柏西普以及最近的brolucizumab改善了约三分之一CNV患者的视力，或者更确切地说，在90%的病例中稳定了视力¹¹，^12，13。然而，频繁的玻璃体内注射通常会带来不良事件的风险¹⁴，损害患者的依从性，并对医疗保健系统造成重大的经济负担¹⁵。此外，一定比例的患者（2%-20%）对抗VEGF治疗无反应或反应不佳¹⁶，¹⁷，^18，19。这些阴性伴随因素需要开发替代疗法，例如眼内植入物、细胞和/或基因治疗方法。

基因疗法已经发展成为遗传性和非遗传性疾病的有前途的治疗方法，并打算恢复非功能性基因序列或抑制功能障碍的基因序列。对于几乎不可能识别和替代致病因素的多基因疾病，策略旨在持续提供保护因素。在AMD的情况下，已经开发了各种添加剂疗法，例如内皮抑素和血管抑素²⁰的稳定表达，VEGF拮抗剂可溶性FMS样酪氨酸激酶-1（sFLT-1）21，22，补体调节蛋白簇分化59（CD59）²³或PEDF^24，25.眼睛，尤其是视网膜，是基因药物的绝佳靶标，因为它具有封闭的结构、良好的可及性、小尺寸和免疫特权，因此允许局部递送低治疗剂量并使移植不易产生排斥反应。此外，眼睛可以进行无创监测，并且可以通过不同的成像技术检查视网膜。

由于其高转导效率，病毒载体是将治疗基因递送到靶细胞的主要载体。然而，根据所使用的病毒载体，已经描述了不同的不良反应，例如免疫和炎症反应26，诱变和致癌作用²⁷，28^，或在其他组织中的播散²⁹。实际限制包括包装尺寸限制³⁰以及与生产临床级批次^31，32相关的困难和成本。这些缺点促进了通过脂质体/多链体、超声或电穿孔转移的非病毒、基于质粒的载体的进一步发展。然而，质粒载体通常不会促进转基因与宿主基因组的基因组整合，从而导致瞬时表达。

转座子是天然存在的DNA片段，可以改变它们在基因组中的位置，这一特征已被用于基因治疗。由于具有主动整合机制，基于转座子的载体系统允许插入的转基因的连续和恒定表达。睡美人（SB）转座子由鱼类³³中发现的古代Tc1/mariner型转座子重组而成，并通过分子进化进一步改进，从而产生过度活跃的变体SB100X³⁴，能够在各种原代细胞中实现有效转座，并用于不同疾病模型中的表型校正³⁵。目前，使用SB转座子系统已启动13项临床试验。SB100X转座子系统由两部分组成:转座子，其包含目的基因，两侧是末端倒置重复序列（TIR））和转座酶，其动员转座子。在质粒DNA递送到细胞后，转座酶结合TIR并催化转座子的切除和整合到细胞基因组中。

我们开发了一种基于非病毒细胞的添加剂疗法，用于治疗新生血管性AMD。该方法包括通过SB100X转座子系统³⁶，^37，38将基于电穿孔的PEDF基因插入原代色素上皮（PE）细胞中。转座酶和PEDF的遗传信息在单独的质粒上提供，从而能够调整理想的SB100X与PEDF转座子比。电穿孔使用基于移液器的毛细管转染系统进行，其特点是电极之间的间隙尺寸最大化，同时最小化其表面积。该装置被证明在广泛的哺乳动物细胞中实现了出色的转染率^39，40，41。小电极表面积提供均匀的电场并减少电解的各种副作用⁴²。

转染色素上皮细胞分泌的PEDF的抗血管生成功能在分析人脐静脉内皮细胞发芽，迁移和凋亡的各种体外实验中显示⁴³。此外，在角膜新生血管形成的兔模型⁴⁴和CNV^43，45，46的大鼠模型中移植PEDF转染的细胞显示出新生血管的下降。

在这里，我们描述了使用毛细管转染系统通过SB100X转座子系统将PEDF基因稳定插入原代人RPE细胞的详细方案。将转染的细胞在培养物中保持21天，随后通过定量聚合酶链反应（qPCR）分析PEDF基因表达，并通过免疫印迹和酶联免疫吸附测定分析PEDF蛋白分泌（ELISA，图1）。

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研究方案

根据《赫尔辛基宣言议定书》获得知情同意后，从亚琛工业大学医院眼科亚琛角膜库获得人类供体眼睛。收集和使用人体样本的程序已得到机构伦理委员会的批准。

1. 原代人RPE细胞的分离

1. 摆好无菌防护服和手套。将无菌窗帘置于层流下。
2. 将无菌制备仪器和其他必要的无菌设备置于层流下。
3. 记录眼球的接收，准备的开始以及可能的异常。登记捐赠者的年龄、性别、死因以及死亡时间和摘除眼睛之间的时间。
4. 将眼球放在无菌纱布敷中，并用一只手握住。
5. 使用手术刀和一把超细尖眼剪刀，在角膜缘后方约 3.5 毫米处通过圆周切口将前段与后段分开。
6. 将后段向下倾斜后，使用大肠镊子小心地取出玻璃体和视网膜。
7. 使用直虹膜钳谨慎地重新排列折叠的 RPE/choroidea 复合体，然后用弯曲的虹膜钳将其固定到位。
8. 在后眼杯中填充 1 mL Dulbecco 改良 Eagle's 培养基/火腿 F-12 营养混合物 （DMEM/F12），并补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、80 U/mL 青霉素和 80 μg/mL 链霉素（笔/链球菌）和 2.5 μg/mL 两性霉素 B （AmphoB）。
   注意:与从猪或牛眼中分离原代RPE细胞相反³⁶，^37，后眼杯不必填充并用胰蛋白酶孵育。
9. 通过用火抛光曲面玻璃巴斯德移液管将视神经的视网膜色素上皮轻轻刷向角膜缘来收获 RPE 细胞，同时使用大肠杆菌钳将 RPE/舞蹈复合体固定在角膜缘处。将细胞悬液转移到培养皿中。
10. 重复步骤1.8和1.9并收集培养皿中的所有细胞。使用单通道移液器（100-1，000 μL）上下移液，小心重悬细胞悬液。
11. 将每个眼球的 RPE 细胞悬液接种到 24 孔细胞培养板的三个孔中，并用补充有 FBS、笔/链球菌和 AmphoB 的 DMEM/F12 填充至 1 mL。
12. 将RPE细胞培养物保持在37°C，在95%空气和5%CO₂ 的潮湿气氛中，直到达到汇合。每周更换两次细胞培养基。

2. 原代人RPE细胞的电穿孔

1. SB100X转座酶/PEDF转座子质粒混合物的制备
   1. 根据制造商的方案，使用常规质粒纯化试剂盒纯化 SB100X 转座酶和 PEDF 转座子质粒DNA，这些试剂盒被确定适用于转染等应用。
   2. 使用微量分光光度计定量质粒DNA含量，并用10 mM Tris-HCl（pH 8.5）将其调节至250 ng / μL的浓度。
   3. 将一份 250 ng/μL SB100X 转座酶质粒 DNA（例如 2.5 μL）与 16 份 250 ng/μL PEDF 转座子质粒 DNA（例如 40 μL）混合。残留质粒混合物可储存在-20°C。
      注意:应避免质粒混合物的多次重复冻融循环。
   4. 将 2 μL 含有 29.4 ng SB100X 转座酶质粒和 470.6 ng PEDF 转座子质粒的 SB100X 转座酶/PEDF 转座子质粒混合物放入无菌 1.5 mL 安全锁定微量离心管中。保持冰上，直到与细胞混合。
2. 毛细管转染系统的设置
   注意:原代人RPE细胞的电穿孔已根据制造商的方案使用10μL试剂盒通过毛细管转染系统进行。该系统包括转染装置、转染移液器和移液站。该试剂盒包含 10 μL 转染吸头、缓冲管、电解缓冲液 E（缓冲液 E）和重悬缓冲液 R（缓冲液 R）。
   1. 将移液器站连接到转染设备。
   2. 用 3 mL 缓冲液 E 填充缓冲管，并将其插入移液器站，直到听到咔嗒声。
      注意:确保缓冲管的侧电极连接到移液器站的侧球柱塞。
   3. 对于原代人RPE细胞的电穿孔，在转染设备上设置以下脉冲条件:1，100 V（脉冲电压），20 ms（脉冲宽度），两个脉冲（脉冲数）。
3. 培养的原代人RPE细胞的制备
   1. 通过相差显微镜记录原代RPE细胞培养物的形状和形态。使用低放大倍率显微照片来展示 RPE 细胞向汇合和集成的单层以及更高放大倍率的显微照片来指出 RPE 细胞的典型鹅卵石形态。
   2. 吸出细胞培养基，并用 1 mL 缓冲磷酸盐水 （PBS，pH 7.4） 洗涤细胞两次。
   3. 在95%空气和5%CO₂ 的潮湿气氛中，在37°C下用0.5mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA胰蛋白酶消化原代人RPE细胞7-15分钟（最长）。显微镜检查细胞脱离。
   4. 用补充有FBS的1 mL DMEM/F12停止胰蛋白酶消化。取 20 μL 等分试样使用血细胞计数器进行细胞计数。将RPE细胞悬液以106 x g 离心10分钟。
   5. 将 20 μL 等分试样与 20 μL 台盼蓝溶液混合。在血细胞计数器的每一半中吸取10μL，并在相差显微镜下计数细胞。
   6. 离心后，将RPE细胞沉淀重悬于1 mL PBS中。
   7. 每次转染反应取10，000-100，000个RPE细胞，并以106× g 离心10分钟。
      注意:除了施加电场和添加质粒DNA的转染反应外，每种方法还包括两种不同的对照培养物:（1）无电场应用和无质粒DNA;（2）具有电场应用，但无质粒DNA。
   8. 将细胞沉淀重悬于 11 μL 缓冲液 R 中，并将其与 2 μL SB100X 转座酶/PEDF 转座子质粒混合物混合（参见步骤 2.1.4）。
      注意:在缓冲液R中重悬后，必须在15分钟内处理细胞，以避免细胞活力和转染效率降低。
   9. 将转染移液器的头部插入10 μL转染吸头，直到夹子完全拾取活塞的安装杆。将细胞/质粒溶液抽取到转染尖端中。
      注意:避免产生气泡及其吸入转染尖端。
   10. 将 1 mL 补充有 FBS 的 DMEM/F12 （不含笔/链球菌且不含 AmphoB）放入所需数量的 24 孔细胞培养板中。
4. 电穿孔工艺
   1. 将转染移液器插入移液器站中的缓冲管中（参见步骤2.2.2），直到听到咔嗒声。
      注意:确保转染移液器的金属头连接到移液器站内的球柱塞和缓冲管。
   2. 在转染设备的触摸屏上按 开始 。在施加电脉冲之前，设备会自动检查缓冲管和转染移液器是否正确插入。发送电脉冲后， "完成" 显示在触摸屏上。
   3. 小心地从移液器站上取出转染移液器，并将细胞/质粒溶液移液到细胞培养板的制备孔中，立即从10μL转染吸头中释放电穿孔细胞（参见步骤2.3.10）。
   4. 将转染的RPE细胞培养物保持在37°C的95%空气和5%CO₂的潮湿气氛中。在电穿孔后 3 天加入笔/链球菌和 AmphoB，进行第一次培养基交换。

3. 转染原代人RPE细胞的分析

1. 样品制备
   1. 培养 3 周后，最终将 RPE 细胞培养物在补充有 FBS、笔/链球菌和 AmphoB 的 1.0 mL DMEM/F12 的规定体积中孵育 24 小时。
   2. 取细胞培养上清液并将其储存在-20°C直至进一步接近时间处理或在-80°C下储存用于热不稳定样品和长期储存。
   3. 在95%空气和5%CO₂ 的潮湿气氛中，在37°C下用0.5mL的0.05%胰蛋白酶-EDTA转染的RPE细胞培养物胰蛋白酶消化10分钟。
   4. 用补充有FBS的1 mL DMEM/F12停止胰蛋白酶消化。取小等分试样使用血细胞计数器进行细胞计数（参见步骤2.3.5）。将RPE细胞悬液以106× g 离心10分钟。
   5. 将RPE细胞沉淀储存在-80°C直至进一步处理。
2. 通过蛋白质印迹评估 PEDF 分泌
   注意:为了进行定性评估，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和随后的蛋白质印迹分析细胞培养上清液（参见步骤3.1.2）。取决于 PEDF 使用转座子质粒DNA，上清液必须以不同的方式处理。
   1. 从细胞培养上清液中纯化His标记的PEDF融合蛋白
      1. 使用斜面切割的尖端，每个样品取 30 μL 镍-次氮基三乙酸 （Ni-NTA） 浆液，并通过离心（2，660 x g 30 秒）沉淀 Ni-NTA 树脂。
      2. 用 200 μL 1x 孵育缓冲液（50 mM NaH 2 PO₄、300 mM NaCl、10 mM 咪唑、pH 8.0）小心重悬 Ni-NTA 树脂，并通过离心（₂，660 x g 30 秒）沉淀。
      3. 重复上一步。
      4. 用每个样品的 40 μL 4x 孵育缓冲液（200 mM NaH 2 PO₄、_1.2M NaCl、40 mM 咪唑、pH 8.0）小心重悬 Ni-NTA 树脂。
      5. 将 900 μL 细胞培养上清液与 260 μL 4x 孵育缓冲液和 55 μL 预处理的 Ni-NTA 浆液混合（参见步骤 3.2.1.4）。
      6. 将混合物在室温下在摇床上孵育60分钟。
      7. 通过离心（2660 x g 60秒）沉淀Ni-NTA树脂。
      8. 小心地将Ni-NTA树脂与175μL的1x孵育缓冲液和颗粒树脂离心（2，660 x g 60秒）重悬。
      9. 重复上一步。
      10. 小心地将Ni-NTA树脂与30μL洗脱缓冲液（50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0）重悬，并将混合物在室温下在摇床上孵育20分钟。
      11. 通过离心（2，660 x g 30秒）沉淀Ni-NTA树脂。
      12. 小心地取上清液并将其与2x SDS样品缓冲液⁴⁷混合。
      13. 将混合物在95°C下加热5分钟，并在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离Ni-NTA纯化的蛋白质。
      14. 如前所述，使用抗Penta-His抗体（小鼠单克隆，1:500）和辣根过氧化物酶（HRP）偶联抗小鼠抗体（兔多克隆，1:1，000）进行蛋白质印迹^36，37。
   2. 直接分析未标记的 PEDF 蛋白
      1. 取 15 μL 细胞培养上清液，与 2x SDS 样品缓冲液⁴⁷ 混合。
      2. 将混合物在95°C下加热5分钟，并在10%SDS - 聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质。
      3. 如前所述，使用抗人PEDF抗体（兔多克隆，1:4，000）和HRP偶联抗兔抗体（山羊多克隆，1:2，000）进行蛋白质印迹³⁸。
   3. 通过酶联免疫吸附法定量 PEDF 分泌
      1. 根据制造商的方案，使用人PEDF ELISA试剂盒分析细胞培养上清液（参见步骤3.1.2）。
      2. 将分泌的PEDF量与每次转染反应确定的时间和细胞数相关联（参见步骤3.1.4）。
   4. 转染RPE细胞中 PEDF 基因表达的分析
      1. 根据制造商的方案，使用市售试剂盒从RPE细胞沉淀中分离总RNA（参见步骤3.1.5）。
      2. 使用微量分光光度计定量RNA含量。
      3. 根据制造商的方案，使用逆转录系统对 0.1 μg RNA 进行逆转录。
      4. 如前所述执行实时 qPCR³⁸。
   5. 转染RPE细胞中转基因插入位点的分析
      1. 根据制造商的方案，使用市售试剂盒从RPE细胞沉淀中分离基因组DNA（参见步骤3.1.5）。
      2. 使用微量分光光度计定量DNA内容。
      3. 如前所述，使用计算辅助的半特异性PCR方案生成插入位点库³⁸。
      4. 如前所述执行计算分析³⁸.

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结果

原代人RPE细胞的培养和电穿孔
我们已经表明，接种足够数量的动物源性原代RPE细胞可以培养和生长到色素沉着的六角形细胞的集成单层³⁶，^37，48。它们在体外形成紧密连接、表现出吞噬活性和表达特异性标记基因的能力⁴⁸ 反映了体内视网膜色素上皮的实质性任务。从人...

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讨论

在我们的项目中，我们的目标是非病毒生产转基因原代人类RPE细胞，这些细胞不断过表达并分泌有效因子，以便将转染的细胞用作建立和维持保护环境的长期治疗药物。我们已经建立了编码PEDF的基因的引入，PEDF是一种普遍表达的多功能蛋白质，具有抗血管生成和神经保护功能。此处描述的方案可用于使用 SB100X 转座子系统稳定且可重复地转染原代人RPE细胞。DNA递送和引入RPE细胞是使用基于...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Colibri Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18950
Curved Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18856
Disposable Scalpel (No. 11)	Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor	Geuder, Heidelberg, Germany	G-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Glass Pasteur Pipettes	Brand, Wertheim, Germany	747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile Drape	Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress	Fink-Walter, Merchweiler, Germany	321063
Sterile Gloves	Sempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)	Corning, Corning, NY	351007
Sterile Surgical Gown	Halyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	150628
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Inverted Microscope	Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany	Leica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+	Biochrom, Berlin, Germany	L182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi Kit	Qiagen, Hilden, Germany	12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane	Cytiva, Marlborough, MA	10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)	BioProducts, Middletown, MD	AB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)	Qiagen, Hilden, Germany	34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)	Agilent Dako, Santa Clara, CA	P0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab6721
Human PEDF ELISA Kit	BioProducts, Middletown, MD	PED613
LAS-3000 Imaging System	Fujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 Instrument	Roche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I	Roche Life Science, Penzberg, Germany	12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl)	Roche Life Science, Penzberg, Germany	4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658004
Ni-NTA Superflow	Qiagen, Hilden, Germany	30410
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1645050
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	51304
Reverse Transcription System	Promega, Madison, WI	A3500
RNase-Free DNase Set	Qiagen, Hilden, Germany	79254
RNeasy Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Rocking Shaker	Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom	SSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer System	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1704150
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054