كامل الدماغ تنشيط 3D ورسم خرائط الاتصال الوظيفي في الفئران باستخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية وظيفية عبر الجمجمة

Summary

يصف هذا البروتوكول القياس الكمي للتغيرات الدموية الدماغية الحجمية في دماغ الماوس باستخدام الموجات فوق الصوتية الوظيفية (fUS). يتم توفير إجراءات خريطة التنشيط الوظيفي ثلاثي الأبعاد بعد التحفيز الحسي وكذلك الاتصال الوظيفي لحالة الراحة كأمثلة توضيحية ، في الفئران المخدرة والمستيقظة.

Abstract

التصوير بالموجات فوق الصوتية الوظيفية (fUS) هو طريقة جديدة لتصوير الدماغ تعتمد على مقياس الحساسية العالية لحجم الدم الدماغي الذي تحققه تصوير الأوعية دوبلر فائق السرعة. كما يرتبط بقوة تغلغل الدماغ إلى نشاط الخلايا العصبية المحلية, هذه التقنية تسمح لرسم الخرائط ثلاثية الأبعاد الدماغ كله من التنشيط الإقليمي الناجم عن المهمة، فضلا عن الراحة الدولة الاتصال الوظيفي, غير الغازية, مع دقة لا مثيل لها spatio الزمنية والبساطة التشغيلية. بالمقارنة مع التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي) ، تتمثل الميزة الرئيسية للتصوير بالفوس في تمكين التوافق الكامل مع التجارب الحيوانية المستيقظة والمتصرفة. وعلاوة على ذلك، لا يزال رسم خرائط الدماغ بالرنين المجهري في الفئران، وهو النموذج الأكثر استخداما قبل السريرية في علم الأعصاب، يشكل تحديا تقنيا بسبب صغر حجم الدماغ وصعوبة الحفاظ على ظروف فسيولوجية مستقرة. هنا نقدم بروتوكول بسيط وموثوق وقوي للتصوير بالحواس الخارجية للدماغ كله في الفئران المخدرة والمستيقظة باستخدام نظام fUS تجاري جاهز للاستخدام مع محول خطي مزود بمحرك ، مما يؤدي إلى تنشيط قشري كبير بعد التحفيز الحسي بالإضافة إلى نمط اتصال وظيفي ثلاثي الأبعاد قابل للاستنساخ لتحديد الشبكة.

Introduction

على مدى العقدين الماضيين، أصبح التصوير العصبي أداة مهمة لدراسة وظائف الدماغ وتنظيمه، مما مكن الباحثين من تحقيق اكتشافات مهمة في مجال علم الأعصاب. اليوم، أصبح التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (fMRI) تقنية التصوير العصبي السريري القياسية الذهبية لتقييم المهمة أو تنشيط الدماغ الذي يثيره الدواء وخريطة الاتصال الوظيفي في الراحة. في حين أن الإنسان fMRI لديه موثوقية عالية والحساسية، فأرة fMRI لا يزال تحديا من الناحية الفنية لأسباب عديدة¹. أولا، إن دقة ال FMRI ضعيفة المكانية والزمنية. الحجم الصغير لدماغ الفأر يتطلب استخدام حقول مغناطيسية قوية باستخدام الماسحات الضوئية باهظة الثمن لتحقيق دقة مكانية معقولة. ثانيا، الحفاظ على المعلمات الفسيولوجية مستقرة ضمن النطاق الضيق السماح اقتران العصبي والأوعية الدموية كفاءة من الصعب جدا في الفئران تخدير. وأخيرا، فإن إشارة مستوى الأكسجين في الدم التي تعتمد عليها دراسات ال fMRI لديها حساسية ضعيفة نسبيا، مما يؤدي إلى انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء عند تطبيقها على الفئران وغالبا ما يتطلب عرض تحفيز متكرر على مدى فترة طويلة للكشف عن الاختلافات الصغيرة. الماوس كونه النموذج الحيواني الأكثر استخداما على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية قبل السريرية، وهذه القيود هي المسؤولة جزئيا عن الفجوة التحويلية في الطب النفسي العصبي، مما يعوق الأهداف العلاجية الواعدة الجديدة على مقاعد البدلاء ليتم نقلها إلى علاجات فعالة على السرير.

الموجات فوق الصوتية الوظيفية (fUS) هي تقنية تصوير عصبي تم تطويرها مؤخرا استنادا إلى دوبلر^{فائق السرعة 2}. من خلال أخذ عينات مباشرة من حجم الدم الدماغي ، تسمح هذه التقنية بالتحقيق في نشاط الدماغ في الوقت الفعلي من خلال اقتران الأوعية الدموية العصبية. بالمقارنة مع تقنيات التصوير العصبي الأخرى، تنتج fUS دقة مكانية تبلغ 100 ميكرومتر ودقة زمنية بعشرات المللي ثانية. تسمح هذه التقنية بتصوير الدماغ بالكامل للأقسام التاجية الكاملة لدماغ الماوس ، بشكل غير جراحي تماما. وعلاوة على ذلك، فإنه متوافق تماما مع الحيوانات واعية وتتصرف^3،4،5. واحدة من القيود الحالية الرئيسية لfUS هو ميزة 2D، مما يسمح لتسجيل طائرة تاجية واحدة في نفس الوقت. في حين أن وحدة التخزين 3D fUS باستخدام محولات مصفوفة مصفوفة 2D قد ثبت بالفعل بنجاح في الفئران⁶ وأكد في الفئران⁷، وعدم الحساسية الحالية يتطلب استئصال الجمجمة الكامل ، فضلا عن متوسط عدد كبير من التجارب للكشف عن تغيير طفيف في النشاط. بدلا من ذلك، يمكن أن يخطو محولات الخطية عبر مواقف متعددة وأداء التصوير الوظيفي الطائرة بالطائرة لتغطية الدماغ كله. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنية العديد من التكرار التجريبي للنموذج وعلى هذا النحو أوقات الاستحواذ الطويلة (3-4 ساعات لدماغ الماوس)^8،9.

في العمل الحالي ، نصف منصة تجريبية قوية بما في ذلك ماسح ضوئي وظيفي متاح تجاريا بالموجات فوق الصوتية ومحول خطي سريع لتحويل الطائرة مع إجراءات للحصول على بيانات fUS ثلاثية الأبعاد في الفئران المخدرة والمستيقظة ، مما يسمح برسم خرائط وظيفية الحجمية وعبر الجمجمة لدماغ الماوس ، دون الغازية ، دون عامل تباين وخلال أوقات الاستحواذ القصيرة. نوضح هذه الميزة من خلال رسم خرائط تنشيط القشرة الحسية سوماتوسوري بعد تحفيز شعيرات فضلا عن الراحة الدولة الاتصال الوظيفي. وبصرف النظر عن إعداد الحيوانات وجمع البيانات، ونحن أيضا وصف إجراءات التصور، وتسجيل أطلس وتحليل إشارات fUS في الوقت الحقيقي.

Protocol

وقد أجريت جميع الإجراءات المعروضة هنا بالاتفاق مع توجيه مجلس الجماعة الأوروبية الصادر في 22 أيلول/سبتمبر 2010 (010/63/UE) ولجنة الأخلاقيات المحلية التابعة لنا (Comité d'éthique en matière d'expérementation animale number 59، 'مركز باريس وسود'، المشروع رقم 2017-23). الفئران البالغة (ذكر C57BL/6 Rj، سن 2-3 أشهر، 20-30 غرام، من مختبرات جانفييه، فرنسا) كانت تؤوي 4 لكل قفص مع دورة خفيفة / داكنة 12h، ودرجة حرارة ثابتة عند 22 درجة مئوية والغذاء والماء libitum الإعلانية. قبل بداية التجارب، تعطى الحيوانات فترة تأقلم لا تقل عن أسبوع واحد لظروف السكن.

1. إعداد الحيوان لتصوير fUS مخدر

1. تخدير
   1. وزن الماوس.
   2. إعداد خليط من الكيتامين والإكسيلازين في 10 ملغم / مل و 2 ملغ / مل، على التوالي، في المالحة المعقمة. إدارة 0.2 مل من محلول الكيتامين / xylazine intraperitoneally باستخدام إبرة قياس 26 وحقنة 1 مل المتاح. بعد بضع دقائق، ضع الحيوان على الإطار المجسم، مع التأكد من أن الرأس مسطح.
   3. إعطاء حجم ثان من التخدير للوصول إلى جرعة إجمالية قدرها 100 ملغم / كجم كيتامين و 20 ملغ / كغ xylazine (مع أخذ الجرعة الأولية في الاعتبار).
      ملاحظة: يجب أن يستمر التخدير لمدة ساعة واحدة. للحفاظ على التخدير المطرد لفترة أطول، حقن 0.05 مل من خليط الكيتامين / إكسيلازين كل 30 دقيقة intraperitoneally.
2. إعداد الحيوان لجلسة التصوير المخدر
   1. تطبيق بعض مرهم العين (على سبيل المثال، Ocry-Gel) على عيون الماوس لتجنب أي تشكيل إعتام عدسة العين أثناء جلسة التصوير. حلق رأس الماوس باستخدام أداة التشذيب. ضعي بعض الكريمة مزيلة الشعر وشطفيها بعد بضع دقائق. كرر حتى تتم إزالة الشعر تماما.
   2. أدخل دبابيس تحت الجلد في الأطراف لتسجيل تخطيط القلب (ECG). ضع جل الموجات فوق الصوتية الطرد المركزي (1500 دورة في الدقيقة، 5 دقائق) على الرأس.
   3. مراقبة عمق التخدير خلال المدة الكاملة للتجارب (وشملت تحريض التخدير). الحفاظ على درجة حرارة الحيوانات عند 37 درجة مئوية باستخدام بطانية التدفئة مقرونة بمسبار المستقيم.
   4. رصد المعلمات الفسيولوجية التالية التي هي مؤشرات غير مباشرة لعمق التخدير: معدل ضربات القلب (220-250 نبضة في الدقيقة - رصدها من خلال الأقطاب الكهربائية رقيقة تخطيط القلب زرعت تحت الجلد)، ومعدل الجهاز التنفسي (130-140 نفسا في الدقيقة الواحدة - رصدها باستخدام مقياس التنفس متصلة نظام اقتناء تخطيط القلب).
      ملاحظة: وصف الإعداد التجريبي هو مبين في الشكل 1.

الشكل 1:الإعداد التجريبي لتجارب fUS المخدرة. وصف الإعداد التجريبي الذي يظهر جميع المعدات العلمية اللازمة أثناء تجربة تخدير. 1. المراقبة الفسيولوجية : عرض حي لكل من الترددات التنفسية والقلبية. 2. أربعة محاور وحدة المحرك (ثلاث ترجمات ودوران واحد) رصدها Iconeus نظام واحد (9) والسماح لأداء المسح المقطعي ثلاثي الأبعاد عبر الجمجمة أو 4D الاستحواذ. 3a. سيرفو موتور يقود محفز شعيرات (3b.) يتم التحكم في محرك سيرفو بواسطة بطاقة أونو أردوينو الذي هو واجهة مع نظام Iconeus واحد (9) من أجل مزامنة أنماط التحفيز مع تسلسل التصوير. 4.أ. وحدة تحكم مضخة حقنة. 4.b. حامل حقنة. 5.أ. مراقبة لوحة درجة الحرارة التحكم في لوحة التدفئة. 5.b. لوحة التدفئة وميزان الحرارة المستقيم واجهة مع رصد لوحة درجة الحرارة (5.a.). 6. هلام الموجات فوق الصوتية وضعت بين رأس الحيوان والتحقيق بالموجات فوق الصوتية، وتوفير اقتران الصوتية بينهما. 7. 15 ميجاهرتز مسبار الموجات فوق الصوتية. 8. حامل التحقيق ربط التحقيق (7) إلى وحدة المحرك (2). 9. Iconeus واحد المعدات والبرمجيات ، مما يسمح برمجة مختلفة تسلسل التصوير والسيطرة على وحدة المحركات (2) يقود التحقيق (7). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. إعداد الحيوان لتجارب الفئران مستيقظا رئيس ثابت

1. جراحة اللوحة الرأسية
   1. ضع الحيوان المخدر (الخطوات 1.1-1.2) في الإطار المجسم على لوحة تدفئة (37 درجة مئوية). تطبيق هلام واقية للعيون وإدارة الليدوكائين ق.c. (0.2 مل، 2٪) تحت الجلد فروة الرأس باستخدام إبرة قياس 26 وانتظر بضع دقائق.
      ملاحظة: مراقبة مستوى التخدير كل 10-30 دقيقة عن طريق الاستجابة (غياب) لقرصة إصبع القدم شركة.
   2. إجراء شق بعد خياطة القوس من وراء عظم القذالي إلى بداية عظم الأنف. باستخدام مقص الجراحية، استئصال الجلد على نصفي الكرة الأرضية.
   3. تنظيف الجمجمة مع محلول اليود 1٪ وإزالة أي بيريوستيوم المتبقية. باستخدام لوحة الرأس كقالب، حفر اثنين من الثقوب (قطر 1 ملم) في الجمجمة لوضع مسامير الرسو.
      تنبيه: يجب الحرص على عدم الحفر تماما من خلال الجمجمة لتجنب أي تلف في الدماغ أو التهاب دورا
   4. ضع اللوحة الرأسية مع البراغي. استخدام الاسمنت الأسنان لإصلاح مسامير واللوحة الأمامية وفي الجزء الخلفي من الإطار للحفاظ على قبضة جيدة من زرع.
      تنبيه: يجب الحرص على عدم تطبيق الاسمنت داخل إطار الإطار لأنه يقلل كثيرا من جودة الإشارة. قم بتغطية الجمجمة بطبقة رقيقة من الغراء الجراحي لحماية العظام وختم الجروح على جانب نافذة التصوير.
   5. إزالة الحيوان من الإطار ستيريوتاكسيك بعد الاسمنت جاف وعكس التخدير عن طريق الحقن تحت الجلد من الاتيباميزول في 1 ملغ / كغ. تدار إدارة وقائية من ميلوكسيكام (5 ملغ / كغ / يوم , ق .c.) لآلام ما بعد العملية الجراحية.
   6. ضع الحيوان في قفص الإنعاش على وسادة التدفئة (37 درجة مئوية). يمكن للفأر العودة قفص المنزل مع littermates في غضون ساعات قليلة. ضع غطاء مغناطيسي مطبوع ثلاثي الأبعاد (مادة حمضية متعددة الميول مع إدراج مغناطيس) فوق اللوحة الأمامية للحماية(الشكل 2A). اترك الماوس للتعافي لمدة 4 إلى 6 أيام قبل بداية التعود على القفص المنزلي المتنقل (MHC).
      ملاحظة: يبلغ الوزن الإجمالي للغطاء ولوحة الرأس 2.8 غرام.
2. المناولة والتعود
   1. في اليوم الأول بعد التعافي (PR)، أمسك الماوس برفق في يدك لمدة 5-10 دقائق عدة مرات في اليوم.
   2. في اليوم 2 العلاقات العامة، كرر التعامل كما هو الحال في اليوم 1 وترك الحيوان لمدة 5-10 دقيقة استكشاف بحرية MHC.
      ملاحظة: يمكن أن يساعد تشغيل بعض الموسيقى الخلفية في الغرفة في تقليل إجهاد الحيوان.
   3. في اليوم 3 العلاقات العامة، والسماح للحيوان بحرية استكشاف MHC لمدة 5-10 دقيقة. بعد ذلك، والاستيلاء بعناية على لوحة الرأس ووضعه بلطف في المشبك، تتحرك يدويا قفص الكربون لمرافقة الماوس. Habituate الحيوان في موقف رئيس ثابت لمدة 5-10 دقيقة. تنظيف MHC بين الدورات التدريبية مع محلول الإيثانول 70٪ وشطف مع ماء الصنبور.
      ملاحظة: تأكد من أن يتلقى MHC تدفق هواء كافية كما هو موصى به من قبل الشركة المصنعة. ارتفاع المشبك الرأس يحتاج إلى تعديل يدويا لتوفير موقف مريح.
   4. في اليوم 4 و 5 العلاقات العامة، المشبك مرارا وتكرارا MHC الماوس وزيادة تدريجيا في الوقت المحدد الرأس، بدءا من 5 دقائق وحتى 30 دقيقة. تطبيق بعض هلام المالحة والموجات فوق الصوتية على نافذة التصوير للتعود.
   5. في اليوم 6 العلاقات العامة، كرر البروتوكول من اليوم 4/5 العلاقات العامة ووضع التحقيق فوق رأس الحيوان بعد الخطوة 3.1.
   6. في يوم التجربة، تابع كما هو موضح أعلاه. ثم قم بترطيب نافذة التصوير بالمحلول الملحي وتطبيق بعض هلام الموجات فوق الصوتية. بدء تتبع الحيوان والمضي قدما لتحديد المواقع التحقيق (انظر أدناه).
      ملاحظة: قد يكون Clamping في MHC أيضا عن طريق التفاف الماوس في خرقة. في هذه الحالة ، يجب أن تعود الفئران على إجراء التغليف قبل تثبيت الرأس. ويرد وصف الإعداد التجريبي الكامل للتصوير مستيقظا في الشكل 2B.

الشكل 2: الإعداد التجريبي لتجارب fUS مستيقظا. أ. رسم تخطيطي للغطاء المغناطيسي للغطاء المغناطيسي للغطاء الرأسي الذي يحمي نافذة التصوير (التي تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com). أثناء جلسات التصوير (يسار)، تتم إزالة الغطاء لمسح الدماغ في الفتحة الكبيرة التي توفرها لوحة الرأس. باء - ال 20 في المائ صورة فوتوغرافية للإعداد التجريبي للتصوير المستيقظ عبر الجمجمة في الفئران ذات السلوك الحر الثابتة بالرأس. 1. Iconeus نظام واحد والبرمجيات ، مما يسمح لاقامة مختلف تسلسل التصوير والسيطرة على وحدة المحركات. 2. أربعة محاور وحدة المحركات (ثلاث ترجمات ودوران واحد) رصدها Iconeus نظام واحد (1) والسماح بمسح 3D الطبوغرافية أو 4D الاستحواذ. 3. الهواء الاستغناء عن الجدول. 4. القفص المنزلي المتنقل (MHC). 5a،5b. صور تظهر مناظر أقرب لبيئة الحيوان داخل MHC. 6. نظام تثبيت الرأس لقط لوحة الرأس. 7. حامل مسبار يربط المسبار بوحدة المحرك (2). 8.15 ميجاهرتز مسبار بالموجات فوق الصوتية. 9. هلام الموجات فوق الصوتية وضعت بين رأس الماوس والتحقيق بالموجات فوق الصوتية، وتوفير اقتران الصوتية بينهما. 10. سيرفو موتور يقود المحفز شعيرات. يتم التحكم في سيرفو موتور بواسطة بطاقة اردوينو أونو التي يتم ربطها مع نظام Iconeus One من خلال إشارة TTL (1) من أجل مزامنة أنماط التحفيز مع تسلسل التصوير. جيم - الدوائر التي لا يمكن أن توضيح لإمكانيات أخذ العينات المكانية المختلفة (التي تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com): في كل حالة، يتم تصعيد المسبار من الموضع الأول إلى الأخير ويتم تسجيل صورة دوبلر في كل موضع لإعادة بناء وحدة التخزين المكدسة. تتكرر هذه العملية باستمرار خلال وقت الاستحواذ بأكمله. المسح الضوئي الكثيف (يسار): يجب أن تكون الخطوة بين الشرائح صغيرة بما يكفي (عادة 400 ميكرومتر، وهو ما يتوافق مع دقة الارتفاع) للسماح بالتصوير الحجمي. المسح المتفرق (يمين): إذا تم استهداف مناطق وظيفية بعيدة (في مواقع مختلفة)، فمن الممكن أيضا تقليل أخذ العينات المكانية لتصوير شرائح مختلفة تتقاطع مع هذه المناطق مع عدم المساس بأخذ العينات الزمنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. تحديد المواقع التحقيق

1. بدء تشغيل البرنامج (على سبيل المثال، IcoScan) وإنشاء جلسة تجربة. انتقل إلى القائمة Move Probe لضبط موضع مسبار الموجات فوق الصوتية باستخدام لوحة مفاتيح التنقل.
   ملاحظة: يجب وضع المسبار على بعد 1 مم تقريبا فوق رأس الحيوان. من المهم التأكد من أن المسبار على اتصال مع هلام الموجات فوق الصوتية قبل البدء في أي تسلسل التصوير.
2. بدء اقتناء لايف فيو وضبط موقف التحقيق إذا لزم الأمر عن طريق التصوير في الوقت الحقيقي من CBV الحيوان (حجم الدم الدماغي). محاذاة الدماغ في وسط الصورة. تحسين معلمات التصوير لالتقاط أعلى نسبة إشارة إلى ضوضاء.
   ملاحظة: في تجارب الفئران المستيقظة، يجب تقليل حجم الفتحة لتجنب القطع الأثرية الناجمة عن تقلص العضلات الجانبية.

4. المسح الجيوجرافيك وتسجيل أطلس

1. افتح خيار Angio ثلاثي الأبعاد في برنامج الاستحواذ. على لوحة مسبقا، وضبط المعلمات المسح الضوئي (الشريحة الأولى، شريحة الماضي وحجم الخطوة) من أجل مسح الدماغ كله(الشكل 3A،B)،وبدء الاستحواذ.
   ملاحظة: عند إعداد معلمات المسح الضوئي، تأكد من أن المسح سيغطي الجزء الخلفي من الدماغ
2. اترك برنامج الاستحواذ مفتوحا وابدأ تشغيل البرنامج لتحليل البيانات والتصور (على سبيل المثال ، IcoStudio) ، وتحميل المسح الضوئي ثلاثي الأبعاد. انتقل من خلال حجم الاستحواذ باستخدام لوحة 3-طرق العرض وحدد اتجاه المسح الإكليلي:الأمامي الخلفي أو الأمامية الملصقات.
3. انتقل إلى لوحة تسجيل الدماغ. تحميل قالب مرجع الماوس التي ستكون هناك حاجة لعملية التسجيل. تسجيل المسح الضوئي على الإحداثيات الشائعة الماوس ألين الإطار باستخدام التلقائي بالكامل أو وسائط التسجيل اليدوي(الشكل 3C).
4. تحقق من النتيجة من خلال النظر في superposition من المسح الضوئي 3D أنجيو والقالب المرجعي أو من خلال النظر في superposition من المسح الضوئي وأطلس ألين المرجعية باستخدام لوحة مدير أطلس (الشكل 3D). حفظ التسجيل كملف .bps.
   ملاحظة: يمكن إعادة استخدام ملف التسجيل لأي اكتساب أخرى تنفيذها أثناء جلسة عمل التجربة نفسها.

5. نظام تحديد المواقع الدماغ (BPS)

1. في برنامج IcoStudio، تأكد من تحميل المسح الجيوجرافيك وملف .bps الخاص به (الذي تم إنشاؤه في الخطوة 4.4).
2. انتقل إلى لوحة الملاحة الدماغ. في لوحة مدير أطلس، انتقل من خلال أطلس الدماغ ألين الماوس مع الملاح شجرة الأم / الطفل. العثور على المناطق المستهدفة التشريحية وتحديدها لفرضها على المسح الضوئي الخاص بك في 3 طرق العرض.
3. تصور المناطق المستهدفة في لوحة 3-view واختر مستوى التصوير الذي يتداخل مع المناطق المستهدفة للتجربة. للقيام بذلك، قم بتعيين علامتين يدويا على الموضع الإكليلي الذي يتضمن المناطق ذات الاهتمام.
4. انقر على نظام تحديد المواقع الدماغ (BPS) لاستخراج الإحداثيات الحركية الناتجة. تتوافق هذه الإحداثيات مع موضع المسبار الذي يسمح بتصوير الطائرة المستهدفة. تحقق من معاينة الصورة التي يتم حسابها من مسح الأوعية.
5. في برنامج IcoScan، أدخل لوحة تحديد المواقع المسبار وانقر على إدخال إحداثيات BPS. تطبيق الإحداثيات المحددة في الخطوة 5.4. يتحرك المسبار ويصطف على مستوى التصوير المستهدف.
6. إجراء عملية اقتناء عرض مباشرة والتحقق من أن مستوى التصوير الحالي يتوافق مع التنبؤ المحدد في الخطوة 5.4.
   ملاحظة: من الممكن أيضا تحديد طائرات parasagittal/غير متعامدة.

الشكل 3:المسح الوعائي عبر الجمجمة السريع وتسجيل الدماغ لتحديد موضع المسبار الدقيق. أ. التمثيل التخطيطي لدماغ الفأرة التي يتم مسحها عبر الجمجمة بواسطة مسبار الموجات فوق الصوتية من الشريحة التاجية الأولى (الأخضر) إلى آخر شريحة تاجية (زرقاء) أثناء المسح الوعائي السريع. تتحرك الشريحة المصورة الحالية (الممثلة باللون الأحمر) خطوة بخطوة من الخلف (الأخضر) إلى الجزء الأمامي (الأزرق) من الدماغ. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com B. لقطة شاشة لبرنامج اكتساب IcoScan في لوحة Angio 3D. المعلمات مسبقا على اليمين تكوين المسح السريع. يجب اختيار المواقع في مم من الشريحة الأولى ، والشريحة الأخيرة وحجم الخطوة بشكل جيد لمسح الدماغ بأكمله خطيا. جيم - الدوائر التي لا يمكن أن لقطة شاشة لبرنامج معالجة IcoStudio. يتم تسجيل المسح الضوئي السريع Angio 3D تلقائيا إلى قالب مرجعي لدماغ الماوس. تظهر المناظر الثلاثة (إلى اليسار) تراكب الأوعية الدموية وأطلس ألين دماغ الفأر في المناظر الإكليلية والمترهلة والمؤهلة. د- الخطية وضع التدريجي (المونتاج) من 16 شرائح (من أصل 31) من مسح الأوعية 3D، مع أطلس مرجع ألن المسجلة فرضها على الأوعية الدموية. هاء - ال هاء لقطة شاشة للوحة تنقل الدماغ التي تظهر مستوى التصوير المتوقع المقابل لإحداثيات المحرك التي يحسبها البرنامج بفضل العلامات اللذين تم وضعها في وسط قشرة somatosensory الأولية اليسرى واليمينية ، منطقة حقول البرميل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. تجربة المهمة التي أثارتها: تحفيز شعيرات

1. Predefine تسلسل التحفيز، بما في ذلك وقت التحفيز، بين التحفيز الوقت وعدد من التكرار.
2. تشغيل تسلسل fUS ثلاثي الأبعاد عن طريق تحديد الوقت الإجمالي للاستحواذ وعدد المناصب بالإضافة إلى الوقت الفاصل بين المراكز. في حالة التحفيز التلقائي المتزامن مع نظام الاستحواذ من خلال إدخال TTL ، حدد خيار Trig-IN قبل بدء الاستحواذ.
   ملاحظة: بالنسبة للنتائج المقدمة في هذا العمل، تم تسليم التحفيز باستخدام مسحة القطن المتمركزة مثل السماح بحرف معظم شعيرات في الاتجاه الظهري / البطني. تم تثبيته على محرك سيرفو مدفوعا ببطاقة Arduino UNO ، مرتبطة بنظام Iconeus One لضمان المزامنة. المعلمات الموصى بها للتحفيز هي 30 s ON، 30 s OFF، سعة 20° و 4 هرتز تردد. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا تسليم التحفيز يدويا عن طريق تحويل شعيرات في الأوقات المحددة أثناء الاستحواذ.
3. افتح عملية الاستحواذ في برنامج IcoStudio وأدخل قائمة خريطة التنشيط. املأ حقل نمط التنشيط بأوقات البدء والانتهاء واحسب خريطة التنشيط. ضبط معلمات العرض للتصور. تصدير خريطة التنشيط كملف .h5 للتحليل خارج الخط.
   ملاحظة: يتم تقدير التنشيط باستخدام أسلوب نموذج خطي معمم (GLM) مع التحفيز الملتوية بواسطة استجابة ديناميكية الماوس الافتراضية (HRF). بدلا من ذلك، يمكن تصور التنشيط مباشرة عن طريق تقدير ارتباط بيرسون بين نمط التحفيز وإشارة ديناميكية الدم من كل voxel.

7. 4D الاتصال الوظيفي

1. تشغيل تسلسل fUS ثلاثي الأبعاد من خلال تحديد الوقت الإجمالي للاستحواذ ، وعدد مواقع طائرة التصوير وكذلك الوقت الميت بين المواقف.
   ملاحظة: بالنسبة للتوصيل الوظيفي رباعي الأبعاد، نوصي بوقت الامتلاك بين كل وحدة تخزين < 2.5 s (تردد أخذ العينات بما لا يقل عن 0.4 هرتز) ووقت اكتساب إجمالي لا يقل عن 10 دقائق (عدد النقاط الزمنية > 180).
2. حفظ الاستحواذ وتحميله في برنامج IcoStudio. إذا لزم الأمر، قم بتحميل ملف .bps وإطار عمل تنسيق دماغ الماوس ألين. في مدير أطلس، حدد مناطق الأطلس كمنااطق اهتمام (ROI).
3. أدخل القائمة الاتصال الوظيفي وحدد المناطق المطلوبة في إدارة عائد الاستثمار. تصور النتائج كمصفوفة اتصال (تحليل تحت الإشراف) أو خريطة ارتباط قائمة على البذور (غير خاضعة للرقابة). حدد وضبط مرشحات عرض النطاق الترددي كما هو مطلوب وتصدير نتائج الارتباط للتحليل الإحصائي.
   ملاحظة: في وضع التصوير ثلاثي الأبعاد fUS، يتم تعيين موضعي التحقيق النسبيين يدويا. وبالتالي، نوعين من عمليات المسح ممكنة ويمكن اختيارها اعتمادا على التطبيق الوظيفي: مسح كثيف مقابل مسح متفرق(الشكل 2C).

النتائج

يصف هذا البروتوكول التحديد الكمي ثلاثي الأبعاد للتغيرات الدماغية الديناميكية عبر الجمجمة في دماغ الماوس أو في الراحة أو استجابة للتحفيز الحسي. تم اختيار تحفيز الشعيرات ، وهو نموذج قياسي لرسم خريطة التنشيط الوظيفي للدماغ في القوارض ، كمثال على الاستجابة التحفيزية الحسية. يظهر الشكل 4 خريطة تنشيط تمثيلية استجابة لتحفيز الشعيرات الميكانيكية في فأر مخدر تم الحصول عليه باستخدام التصوير عبر الجمجمة. كان إجمالي وقت التجربة 760 s ، مع خط أساس 60 s (قبل وبعد التحفيز) ، وتحفيز 80 s ووقت نقاهة 60 s ، كرر 5x. تم تحديد التنشيط الهامة مع دقة طراز خطي عام (GLM) باستخدام دالة استجابة ديناميكية للفأرة الافتراضية (HRF). يتم عرض المناطق المنشطة (درجات Z مع قيمة p >0.0000006 بعد تصحيح Bonferroni الصارم للمقارنة المتعددة) كقيم مرمزة بالألوان مضافة إلى قالب إطار عمل التنسيق المشترك Allen. Voxel الحكمة مسار الوقت من القشرة سوماتوسينسورية الأولية المضادة، منطقة حقل برميل (S1BF) كشفت عن زيادة 15-20٪ من CBV مقارنة مع خط الأساس.

الشكل 4: خرائط التنشيط عبر الجمجمة ودورة rCBV الزمنية بعد تحفيز شعيرات في الكيتامين / xylazine الماوس مخدر. أ. خريطة التنشيط التي تظهر voxels تنشيطها بشكل ملحوظ بعد التحفيز الميكانيكي للشعيرات الحق (80 ق على، 60 ق قبالة، 5x) تحت التخدير الكيتامين / xylazine. تم الحصول على الخرائط عن طريق حساب درجات Z استنادا إلى تحليل النموذج الخطي العام (GLM) مع تصحيح Bonferroni للمقارنة المتعددة. يتم تراكب درجات Z (مرمزة بالألوان) على قالب ألن ثلاثي الأبعاد للدماغ (بعد التسجيل مع نظام تحديد موضع الدماغ) ويتم عرضها في ثلاث طرق عرض: الإكليلي (الأيسر) ، القوس (الوسط) والموالب (يمين). يتم عرض المناطق التشريحية من الدماغ ألين إطار تنسيق مشترك للرجوع إليها. تقع الفوكسل المنشطة بشكل جيد داخل قشرة S1BF اليسرى. شريط المقياس: 1 مم. تم مسح كل حجم عينة أكثر من 2.8 مم (المقابلة ل 7 شرائح في اتجاه الارتفاع) في 3.85 s مما يسمح لتسجيل 20 عينات volumic خلال كل استجابة وظيفية. B. 3D تقديم شعيرات التحفيز أثار حجم الدم الدماغي النسبي (rCBV) زيادة بالمقارنة مع مستوى خط الأساس. يشار إلى الترسيم التشريحي للS1BF باللون الأزرق. جيم - الدوائر التي لا يمكن أن مسار زمني للاختلافات CBV في S1BF اليسار (الأزرق) والتحفيز المقابلة تطبيقها (الأحمر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وقد تم تطبيق نفس النموذج في الماوس يتصرف رئيس ثابتة في homecage المحمول باستخدام مسبقا مستيقظا من IcoScan. الشكل 5 يعرض خريطة التنشيط بعد تجربة تحفيز شعيرات متعددة باستخدام الإعداد التجريبي الموضح في الشكل 2. تم تحفيز عدد قليل من شعيرات الخلفية وcaudal مع النمط التالي: 30 ق خط الأساس تليها خمس تجارب متتالية من 30 ق على (4 هرتز) و 30 ق OFF (الشكل 5C). تم تسليم التحفيز باستخدام محرك سيرفو مدفوعا ببطاقة Arduino UNO التي تؤدي إلى تسلسل الحصول على الصورة للتزامن. تم تحديد التنشيط الهامة مع دقة طراز خطي عام (GLM) باستخدام دالة استجابة ديناميكية للفأرة الافتراضية (HRF). تم إجراء تصحيح مقارنة متعددة مع الأسلوب Bonferroni. تم تطبيع مستوى ألفا التقليدي البالغ 0.05 من خلال العدد الإجمالي لل voxels في حجم الاستحواذ ، مما أدى إلى عتبة صارمة نهائية قدرها 0.000003.

الشكل 5: خرائط التنشيط ودورة rCBV الوقت بعد التحفيز شعيرات في الماوس يتصرف مستيقظا. أ. خريطة التنشيط التي تظهر voxels تنشيطها بشكل ملحوظ بعد التحفيز الميكانيكي للشعيرات اليمنى (30 s ON، 30 s OFF، 5x) في فأرة مستيقظا في المنزل المحمول. تم الحصول على الخرائط عن طريق حساب درجات Z استنادا إلى تحليل النموذج الخطي العام (GLM) مع تصحيح Bonferroni للمقارنة المتعددة (التطبيع حسب العدد الإجمالي لل voxels). يتم تراكب درجات Z (مرمزة بالألوان) على قالب ألين ثلاثي الأبعاد للدماغ (بعد التسجيل مع نظام تحديد موضع الدماغ) ويتم عرضها في ثلاث طرق عرض: الإكليلي (الأيسر) ، القوس (الأوسط) والموال (يمين). يتم عرض المناطق التشريحية من إطار عمل التنسيق المشترك بين دماغ ألين ماوس للرجوع إليها. تقع الفوكسل المنشطة بشكل جيد داخل قشرة S1BF اليسرى. قضبان المقاييس، 1 مم. تم مسح كل حجم عينة أكثر من 1.6 مم (المقابلة ل 3 شرائح في اتجاه الارتفاع) في 3.85 s مما يسمح لتسجيل 17 عينات volumic خلال كل استجابة وظيفية. B. 3D تقديم شعيرات التحفيز أثار النسبية حجم الدم الدماغي (rCBV) زيادة بالمقارنة مع مستوى خط الأساس. يشار إلى الترسيم التشريحي للS1BF باللون الأزرق. جيم - الدوائر التي لا يمكن أن رسم توضيحي للفأرة في المنزل المتنقل أثناء تجربة تحفيز الشعيرات اليمنى ، والتي تم خلالها إجراء خمس تجارب 30 s لوقت اكتساب إجمالي قدره 330 s. D. مسار الوقت النسبي الفوري CBV المستخرج داخل المنطقة المنشطة (الأزرق) ، مع فرض التحفيز المقابل (أحمر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويبين الشكل 6 الارتباطات الزمنية لتقلبات CBV التلقائية العادية منخفضة التردد (<0.2 هرتز) بين مناطق الدماغ ثلاثية الأبعاد (التي تم تحديدها من التسجيل إلى إطار التنسيق المشترك ل Allen) في فأر مخدر من الكيتامين- زيلاسين. وكان إجمالي وقت الاستحواذ 20 دقيقة (1200 s). وكشف التحليل الذي أشرف عليه أطلس عن وجود أنماط قوية للاتصال بين نصف الكرة الأرضية، مع قيم معامل ارتباط ناتجة تصل إلى 0.8. كشف التحليل القائم على البذور في قرن آمون الظهري عن اتصال كبير بين نصف الكرة الأرضية بين قرن آمون الأيمن والأيسار بالإضافة إلى مناطق فرس النهر الرجعية العميقة والكورتيزبيريفورم. كما أسفرت منطقة البذور المختارة في S1BF عن نمط ارتباط متناظر (القشرية القشرية) ، كما هو موضح سابقا.

الشكل 6:اتصال وظيفي عبر الجمجمة الحجمي للراحة في دماغ الماوس تحت تخدير الكيتامين / الإكسيلازين الذي تم تقييمه على اكتساب 20 دقيقة 3D fUS. أ. مصفوفة الارتباط على أساس المناطق ثلاثية الأبعاد لإطار التنسيق المشترك ألن المسجلة على اكتساب وظيفية عبر الجمجمة. يتم الحصول على المصفوفة عن طريق حساب ارتباط بيرسون العادي للتقلبات التلقائية منخفضة التردد (<0.1 هرتز) لمتوسط إشارات الوقت من جميع voxels المدرجة في كل عائد استثمار محدد بعد تصحيح توقيت الشريحة. تم مسح كل حجم عينات أكثر من 1.6 ملم في اتجاه الارتفاع (المقابلة ل 4 شرائح) المكتسبة أكثر من 2.2 s. B.. تحليل يستند إلى البذور المتوقعة على قالب ثلاثي الأبعاد. تم اختيار البذور داخل قرن آمون الظهري الأيمن في β - 2.1 ملم. يتم الحصول على خريطة الارتباط عن طريق حساب معامل ارتباط بيرسون بين الإشارات الزمنية للبذور وكل voxel من الاستحواذ كله بعد تصحيح توقيت الشريحة. خريطة الارتباط ثلاثي الأبعاد المستندة إلى التحليل القائم على البذور مع منطقة البذور المختارة داخل S1BF عند β - 2.1 مم. أشرطة المقياس: 1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

طرق تصوير الدماغ كله هي أدوات حاسمة لفهم أفضل لعلم وظائف الأعضاء في الدماغ وعلم الأمراض. الطريقة الموصوفة هنا تسمح بالتحديد الكمي الدقيق للإشارات الديناميكية الدموية في الدماغ الحي مباشرة على مقاعد البدلاء. الحساسية التي لا تضاهى والقرار spatio الزمنية من الموجات فوق الصوتية وظيفية مناسبة بشكل خاص لعلم وظائف الأعضاء الماوس. ويمكن رسم خرائط للاستجابات الوظيفية وشبكات الراحة في غضون فترات اكتساب قصيرة، طوليا ودون الحاجة إلى متوسط التجارب أو المواضيع للحصول على مقياس موثوق به. مزيج ذات الصلة من مسابير خطية بالموجات فوق الصوتية عالية الحساسية والاجهزة الآلية السريعة تمكن المرء من أداء التصوير عبر الجمجمة الحجمي fUS في الفئران في غضون أوقات اكتساب معقولة. يمكن تنفيذ هذا البروتوكول إما على الفئران المخدرة أو المستيقظة باستخدام قفص منزلي متنقل.

تحفيز شعيرات، التحفيز الحسية المستخدمة كمثال توضيحي في هذه المخطوطة، هو نموذج تنشيط وظيفي قياسي في القوارض وقراءة موثوق بها^لدراسةالمعالجة الحسية، اقتران الأوعية الدموية العصبية وتعديلاتها 5^،6،10،11. في حين أن الفرشاة اليدوية الخشنة للشعيرات قد تكون مفضلة لسهولة استخدامها ، فإن هذه الطريقة تفتقر إلى الدقة المكانية والزمنية. استخدام محفز تلقائي، مثل واحد وصفها هنا أثار مع الماسح الضوئي التصوير fUS، يسمح للسيطرة بشكل أفضل على العديد من المعلمات بما في ذلك وقت البدء، وتشريد السعة، والتردد، فضلا عن زاوية Q-تلميح / مشط، مما أدى إلى استنساخ أفضل بين الحيوانات. بالإضافة إلى ذلك، توقيت أكثر دقة من التحفيز تمكن النمذجة من وظيفة الاستجابة الهمودية (HRF) من خلال تحديد الوقت لبداية والوقت إلى المعلمات الذروة^12،13. لضمان دقة أفضل في عدد الشعيرات المنحرفة أثناء التحفيز (وبالتالي منطقة المنطقة المنشطة) ، يمكن تكييف المحفزات الأكثر تطورا مع هذا البروتوكول. يمكن تنفيذ العديد من المحفزات الأخرى مثل الضوء⁸، الصوت¹⁴ أو عرض^{الرائحة 15} باستخدام نفس البروتوكول.

التوافق بين الموجات فوق الصوتية وظيفية مع الحيوانات مستيقظا ويتصرف ميزة هامة بالمقارنة مع تقنيات التصوير العصبي الأخرى، وتمكين رسم الخرائط التنشيط وظيفية دون التحيز التخدير. استخدام المنزل المحمول رفع الهواء هو بديل جيد لغيرها من الأجهزة القائمة رئيس ثابتة مثل المطاحن الخطية أو كروية. في حين يجري بحزم رئيس ثابتة، وحركة homecage يعطي الماوس الوهم للتنقل في البيئة، مما يسمح لمجموعة واسعة من الاختبارات السلوكية أن يقترن التصوير fUS¹⁶. ومع ذلك ، فإن إجراء التعود على تحديد الرأس يشكل خطوة مهمة لتقليل الإجهاد ، خاصة بالنسبة للتجارب التي يمكن اعتبارها عاملا محيرا. الإجراء المفصل هنا (6 أيام من المناولة والتعود على تثبيت الرأس) يعطي نتائج قوية للتحفيز الحسي والاتصال الوظيفي يستريح الدولة. ومع ذلك، قد يكون من الضروري تمديد فترة التعود على الاختبارات السلوكية أكثر^{دقة 17}.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Plastipak 1 mL syringes	Dutscher, France	303172
BD Microlance 26 Gauge needles	Dutscher, France	303800
Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe)	Physitemp	TCAT-2DF
Arduino	Arduino	Arduino Uno-Rev3
Atipamezole	Orion Pharma, France	Antisedan®	5 mg/ml injectable solution
Dental Ciment	Sun Médical, Shiga, japan	Superbond C&B
Depilatory cream	Klorane	N/A
Eye Ointment	TVM, UK	Ocry-gel
Hair trimmer	Wella Profesionnals	N/A
Head plates	Neurotar, Finland	Model 14
Iconeus One standard package for fUS	Iconeus, France	Iconeus One
IcoScan acquisition software (v1.0)	Iconeus, France	IcoScan
IcoStudio analysis software (v1.0)	Iconeus, France	IcoStudio
Isoflurane Anesthesia station	Minerve, Esternay, France
Ketamine	Virbac, France	Ketamine1000	100 mg/ml injectable solution
Lidocaine	Vetoquinol	Lurocaine®	20 mg/ml injectable solution
Medetomidine	Orion Pharma, France	Domitor®	1 mg/ml injectable solution
Meloxicam	Boehringer lingelheim	Metacam®	0.5 mg/ml injectable solution
Mobile HomeCage Large with tracking capability	Neurotar, Finland	MHC-L-T-V4
Monitoring of ECG and breathing rate	AD Systems, (USA) and LabChart software
Servomotor	Feetech	FT90B
Stereotaxic frame	David Kopf (Tujunga, USA)	900-WA	Using Mouse Adaptor  (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922)
Surgical glue	3M, USA	Vetbond
Syringe Pump	KD Scientific, USA	Legato® 130, Cat# 788130
Ultrasound gel	DREXCO medical, France	Medi'Gel
Xylazine 2%	Bayer, France	Rompun®	20 mg/ml injectable solution