経頭蓋機能超音波画像を用いたマウスにおける脳全体3D活性化と機能結合性マッピング

要約

このプロトコルは、機能的超音波(fUS)を用いたマウス脳における容積脳血力学的変動の定量化を記述する。感覚刺激に続く3D機能活性化マップの手順と安静状態機能接続性は、麻酔および覚醒マウスにおける例示例として提供される。

要約

機能的超音波(fUS)イメージングは、超高速ドップラー血管造影によって達成される脳血液量の高感度尺度に依存する新しい脳イメージングモダリティである。脳灌流は局所的な神経活動と強く結びついているため、この技術は、タスク誘発地域活性化の脳全体3Dマッピングと、無比の時空間的解決と操作のシンプルさで、非侵襲的に休息状態の機能的接続性を可能にする。fMRI(機能的磁気共鳴画像法)と比較して、fUSイメージングの主な利点は、目覚めと動物実験との完全な適合性を可能にすることです。さらに、神経科学で最も使用される前臨床モデルであるマウスにおけるfMRI脳マッピングは、脳の小さなサイズと安定した生理学的状態を維持するのが難しいため、技術的に困難なままである。ここでは、電動リニアトランスデューサーを備えた市販の商用fUSシステムを使用して麻酔および目覚めのマウスで脳全体のfUSイメージングのためのシンプルで信頼性の高い堅牢なプロトコルを提示し、感覚刺激に続く有意な皮質活性化とネットワーク識別のための再現可能な3D機能接続パターンを生み出します。

概要

この20年間、神経イメージングは脳機能と組織を研究するための重要なツールとなり、研究者は神経科学の分野で重要な発見を行うことが可能になりました。今日、機能的磁気共鳴画像法(fMRI)は、タスクまたは薬物誘発脳活性化を評価し、安静時の機能的接続性をマッピングするためのゴールドスタンダード臨床神経イメージング技術となっています。ヒトfMRIは高い信頼性と感性を持っていますが、マウスfMRIは多くの理由で技術的に挑戦的なまま^{です 1}.まず、fMRI は空間的および時間的解像度が低い。マウスの脳の小さなサイズは、合理的な空間分解能を達成するために高価なスキャナを使用して強い磁場の使用を必要とします。第2に、狭い範囲内で安定な生理学的パラメータを維持し、効率的な神経血管結合を可能にし、麻酔マウスでは非常に困難である。最後に、fMRI研究が依存する血中酸素レベル依存(BOLD)シグナルは比較的感度が低く、マウスに適用すると低い信号対雑音比を引き起こし、小さな変動を検出するために長い取得に対して繰り返し刺激を繰り返す提示が必要な場合が多い。マウスは生物医学的前臨床研究で最も広く使用されている動物モデルであり、これらの制限は神経精神医学における翻訳ギャップの一部を担い、ベッドサイドで効果的な治療に転置されるベンチ上の新しい有望な治療目標を妨げる。

機能性超音波(fUS)は、超高速ドップラー²に基づいて最近開発された神経イメージング技術です。脳の血液量を直接サンプリングすることにより、この技術は、神経血管結合を介してリアルタイムで脳活動を調査することを可能にする。他のニューロイメージング技術と比較すると、fUSは100 μmの空間分解能と数十ミリ秒の時間分解能を生み出します。この技術は、マウス脳の完全な冠状動脈セクションの全脳イメージングを可能にする。さらに、それは意識的で振る舞う動物^3、4、5と完全に互換性^{があります}。fUS の主な現在の制限の 1 つは、同時に単一のコロナ平面を記録することができます 2D 機能です。2Dマトリックスアレイトランスデューサを使用した体積3D fUSはラット⁶で既に実証されており、マウス⁷で確認されていますが、現在の感受性の欠如には完全な開頭術が必要であり、活動のわずかな変化を検出するための重要な数の試験を平均化する必要があります。あるいは、線形トランスデューサは、複数の位置を横切ってステップングされ、全脳をカバーするために平面によって機能的なイメージング平面を実行することができる。しかし、この技術は、多数の実験的パラダイムの繰り返しを必要とし、そのような長い取得時間(マウス脳のための3〜4時間^)8、9。

本研究では、市販の機能性超音波スキャナと高速平面切り替えリニアトランスデューサを含む堅牢な実験プラットフォームを、麻酔および目覚めマウスで3D fUSデータを取得する手順を備え、マウス脳の体積および経頭蓋機能マッピングを非侵襲的に、対照剤なしで、そして短い取得時間内に記述する。我々は、ウィスカ刺激に続く体性感覚皮質活性化ならびに安静状態機能接続性をマッピングすることによって、この特徴を示す。動物の準備とデータ収集のほかに、リアルタイムのfUS信号の可視化、アトラス登録、分析の手順についても説明します。

プロトコル

ここに提示されたすべての手順は、2010年9月22日(010/63/UE)の欧州共同体理事会指令と地元の倫理委員会(コンテ・デティク・アン・マティエール・デ・エクスペリメンテーション・アニマルナンバー59、パリ・センター・エ・シュッド、プロジェクト#2017-23)と一致して行われました。成体マウス(雄C57BL/6 Rj、年齢2〜3ヶ月、フランスのジャンヴィエ研究所から20〜30g)を、12hの明暗サイクル、22°Cで一定の温度、食品および水のアドリビタムを有するケージあたり4個を収容した。実験が始まる前に、動物は住宅条件に1週間の最低順応期間を与えられる。

1. 麻酔付きfUSイメージングのための動物の調製

1. 麻酔
   1. マウスの重量を量る。
   2. ケタミンとキシラジンの混合物を10 mg/mLで調製し、2 mg/mLを滅菌生理食糸でそれぞれ調製します。26ゲージ針と1mLの使い捨て注射器を使用して、0.2 mLのケタミン/キシラジン溶液を腹腔内に投与する。数分後、動物を立体フレームに置き、頭が平らであることを確認します。
   3. 麻酔薬の第二の容積を投与して、100mg/kgケタミンと20mg/kgキシラジン(初期用量を考慮に入れる)の総投与量に達する。
      注:麻酔は1時間続くはずです。安定した沈下を長期間維持するには、0.05 mLのケタミン/キシラジン混合物を30分おきに腹腔内に注入します。
2. 麻酔撮影セッションのための動物の準備
   1. マウスの目に目の軟膏(例えば、Ocry-Gel)を適用して、画像処理セッション中の白内障の形成を避けます。トリマーを使用してマウスヘッドを剃ります。数分後に脱毛クリームを塗り、すすいでください。髪が完全に取り除かれるまで繰り返します。
   2. 心電図(ECG)記録のために手足に皮下ピンを挿入します。遠心分離超音波ゲル(1500 rpm、5分)を頭部に置きます。
   3. 実験の全期間(麻酔誘導含む)の間に麻酔の深さを監視する。直腸プローブに結合した加熱毛布を用いて、37°Cで動物の温度を維持する。
   4. 麻酔の深さの間接的な指標である次の生理学的パラメータを監視する:心拍数(毎分220〜250拍) - 皮下に埋め込まれた心電図の薄い電極を介して監視する)、呼吸速度(毎分130〜140呼吸 - ECG取得システムに接続されたスピロメーターを使用して監視)。
      注 : 実験用セットアップの説明を 図 1に示します。

図1: 麻酔fUS実験の実験麻酔実験中に必要なすべての科学機器を示す実験セットアップの説明。生理学的モニタリング:呼吸と心臓の両方の周波数のライブ表示。2.4軸モーターモジュール(3つの翻訳と1回転)Iconeus 1システム(9)によって監視され、経頭蓋3D断層スキャンまたは4D集録を実行することができます。3a.ウィスカ刺激装置を駆動するサーボモータ(3b)サーボモータは、刺激パターンをイメージングシーケンスと同期させるために、Iconeus Oneシステム(9)と連動するarduino unoカードによって制御されます。4.a.スポイトポンプコントローラ。4.b。シリンジホルダー。5.a.加熱プレートを制御する温度プレートモニター。5.b。温度プレートモニター(5.a)とインターフェースする加熱プレートと直腸温度計。6.超音波ゲルは、動物の頭と超音波プローブの間に配置され、それらの間の音響結合を提供します。7. 15 MHzの超音波プローブ。プローブをモータモジュール(2)にリンクするプローブホルダー( 7 )9. Iconeus 1 つの装置およびソフトウェア、 異なるイメージングシーケンスをプログラムし、モータモジュールを制御する (2) プローブを駆動する (7) 。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

2. 目覚めの頭部固定マウス実験のための動物の準備

1. ヘッドプレート手術
   1. 麻酔動物(ステップ1.1-1.2)を加熱パッド(37°C)のステレオタックスフレームに入れる。目に保護ジェルを塗布し、26ゲージ針を使用して頭皮の皮膚の下でリドカイン.c(0.2 mL、2%)を投与し、数分待ちます。
      注:しっかりとつま先ピンチへの応答(不在)によって10〜30分ごとに麻酔レベルを監視してください。
   2. 後頭骨の後ろから鼻骨の始まりまで、矢状縫合に続く切開を行う。手術用ハサミを使用して、両方の半球の上に皮膚を切除する。
   3. 1%ヨウ素溶液で頭蓋骨をきれいにし、残りの骨膜を取り除きます。ヘッドプレートをテンプレートとして使用し、頭蓋骨に2つの穴(直径1mm)を掘削し、固定ネジを配置します。
      注意:脳の損傷や硬膜の炎症を避けるために頭蓋骨を完全に掘削しないように注意してください
   4. ヘッドプレートをネジで配置します。インプラントの良好なグリップを維持するために、フレームの前後にネジとヘッドプレートを固定するために歯科用セメントを使用してください。
      注意: フレームウィンドウ内にセメントを塗布しないように注意してください。骨を保護し、イメージングウィンドウの側面の傷を密封するために外科用接着剤の薄い層で頭蓋骨を覆います。
   5. セメントが乾燥した後、立体的なフレームから動物を取り除き、1mg / kgでアティパフェゾールの皮下注射によって麻酔を逆にします。メロキシカムの予防投与(5mg/kg/日、s.c)は術後疼痛のために投与される。
   6. 動物を加熱パッド(37°C)の回収ケージに入れます。マウスは、数時間以内にごみ箱と自宅のケージを返すことができます。保護のためにヘッドプレートの上に磁気3Dプリントキャップ(マグネットインサートを備えたポリアクタル酸材料)を置く(図2A)。マウスを離れ、モバイルホームケージ(MHC)への慣れ始める前に4〜6日間回復します。
      注:キャップとヘッドプレートの総重量は2.8gです。
2. 取り扱いと習慣
   1. 1日目の事後回収(PR)では、マウスを手に1日に数回軽く5~10分間持ちます。
   2. 2日目のPRでは、1日目のように取り扱いを繰り返し、5〜10分間動物を自由にMHCを探索します。
      注:部屋でいくつかのバックグラウンドミュージックを再生すると、動物のストレスを軽減することができます。
   3. 3日目のPRでは、動物が5〜10分間MHCを自由に探索してみましょう。その後、慎重にヘッドプレートをつかみ、クランプにそっと置き、手動でカーボンケージを動かしてマウスに付属させます。5-10分間、頭固定位置で動物を習慣化します。70%エタノール溶液でトレーニングセッションの合間にMHCを洗浄し、水道水で洗い流します。
      注: MHC が製造元の推奨に従って十分なエアー フローを受け取ることを確認します。ヘッドクランプの高さは、快適な位置を提供するために手動で調整する必要があります。
   4. 4日目と5日目のPRでは、マウスMHCを繰り返しクランプし、5分から最大30分まで、徐々にヘッド固定時間を長くします。画像化ウィンドウに生理食いおよび超音波ゲルを適用して習慣化する。
   5. 6日目PRでは、4/5 PRからプロトコルを繰り返し、ステップ3.1に続いて動物の頭部の上にプローブを配置します。
   6. 実験の当日に、上述の通りに進める。次に、生理食音で画像化窓を加湿し、超音波ゲルを塗布します。動物の追跡を開始し、プローブの位置決めに進みます(下記参照)。
      注: MHC でのクランプは、マウスをぼろでラップすることによって行うこともできます。その場合、マウスは頭部固定の前にラッピング手順に慣れる必要があります。目覚めイメージングの完全な実験セットアップの説明は、 図2Bに示されています。

図2:覚醒fUS実験の実験ある。撮像窓を保護するヘッドプレート磁気カバーの模式図(BioRender.com で作成)。イメージングセッション中(左)、カバーはヘッドプレートによって提供される大きな開口部の脳をスキャンするために取り外されます。B.頭部固定自由振る舞いマウスにおける経頭蓋覚醒イメージング用実験用設定の写真。1. Iconeus 1つのシステムとソフトウェアは、異なるイメージングシーケンスを設定し、モーターモジュールを制御することができます。2.4軸モーターモジュール(3つの翻訳と1回転)Iconeus Oneシステム(1)によって監視され、3D断層スキャンまたは4D集録を可能にします。3.空気分配テーブル。4.モバイルホームケージ(MHC)。5a、5b。MHC内の動物の環境をより詳しく見る写真。ヘッドプレートをクランプするヘッド固定システム。7.プローブをモータモジュールにリンクするプローブホルダー(2)。8.15 MHz超音波プローブ。9.超音波ゲルは、マウスの頭部と超音波プローブの間に配置され、それらの間の音響結合を提供します。10.ウィスカ刺激器を駆動するサーボモーター。サーボモータは、刺激パターンをイメージングシーケンスと同期させるために、TTL信号(1)を介してIconeus OneシステムとインターフェースされているArduino Unoカードによって制御されます。C.異なる空間サンプリングの可能性(BioRender.com で作成)の図:それぞれの場合、プローブは最初の位置から最後の位置にステップされ、ドップラー画像が積み重ねられたボリュームを再構築するために各位置に記録されます。このプロセスは、取得時間全体の間に連続的に繰り返されます。密なスキャン(左):スライス間のステップは、体積イメージングを可能にするのに十分な小ささ(通常は標高解像度に対応する400 μm)でなければなりません。スパース スキャン(右):遠くの機能領域がターゲットとされている場合(位置が異なる場合)、空間サンプリングを減らすことも可能です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

3. プローブの位置決め

1. ソフトウェア(例えば、IcoScan)を起動し、実験セッションを作成します。ナビゲーションキーボードを使用して超音波プローブの位置を調整するには、 プローブの移動 メニューに移動します。
   注:プローブは、動物の頭部の上に約1mmの位置に配置する必要があります。イメージングシーケンスを開始する前に、プローブが超音波ゲルに接触していることを確認することが重要です。
2. ライブビューの取得を開始し、必要に応じて、動物CBV(脳血量)のリアルタイムイメージングを介してプローブの位置を調整します。画像の中央に脳を揃えます。最大の信号対雑音比をキャプチャするために、イメージングパラメータを最適化します。
   注:目を覚ますマウスの実験では、横筋の収縮によって誘発されるアーティファクトを避けるために、開口サイズを縮小する必要があります。

4. 血管造影スキャンとアトラス登録

1. 取得ソフトウェアで[Angio 3D]オプションを開きます。プリセットパネルで、スキャンパラメータ(最初のスライス、最後のスライス、ステップサイズ)を調整して、脳全体(図3A、B)をスキャンし、取得を開始します。
   注:スキャンパラメータを設定する際、スキャンが脳の後部を覆っていることを確認してください
2. 取得ソフトウェアを開いたままにして、データ分析と可視化のためのソフトウェアを起動し(例えば、IcoStudio)、アンジオ3Dスキャンをロードします。3つのビューパネルを使用して取得ボリュームをナビゲートし、 コロナスキャン方向(後部または後部)を選択します。
3. 脳登録パネルに移動します。登録プロセスに必要なマウス参照テンプレートを読み込みます。全自動または手動登録モードを使用して、アレン マウス共通座標フレームワークでスキャンを登録します (図 3C)。
4. angio 3Dスキャンと参照テンプレートの重ね合わせを見るか、 またはアトラスマネージャ パネルを使用してスキャンとアレン参照アトラスの重ね合わせを見て、結果を確認してください(図3D)。登録を .bps ファイルとして保存します。
   注: 登録ファイルは、同じ実験セッション中に実行された他の取得に再利用できます。

5. 脳ポジショニングシステム(BPS)

1. IcoStudio ソフトウェアで、血管グラフィック スキャンとその .bps ファイル ( 手順 4.4で生成) がロードされていることを確認します。
2. 脳ナビゲーションパネルに移動します。[アトラスマネージャ]パネルで、親/子ツリーナビゲーターを使用して、マウスアレン脳アトラスをナビゲートします。解剖学的ターゲット領域を見つけ、それらを選択して3つのビューでスキャンに重ね合わせることができます。
3. 3-view パネルでターゲット領域を視覚化し、実験の対象領域と重なるイメージング平面を選択します。そのためには、対象地域を含むコロナ位置に 2 つのマーカーを手動で設定します。
4. 結果として得られるモーター 座標を抽出するために、脳の位置決めシステム (BPS)をクリックします。これらの座標は、対象となる平面を画像化することを可能にするプローブ位置に対応します。アンジオスキャンから計算された画像のプレビューを確認します。
5. IcoScan ソフトウェアで、 プローブの位置パネルに 入り 、BPS 座標の入力をクリックします。 ステップ 5.4で指定された座標を適用します。プローブは、ターゲットのイメージングプレーン上を移動して整列します。
6. ライブビュー取得を実行し、現在のイメージング平面が ステップ5.4で示された予測に対応していることを確認します。
   注:パラサジタル/非直交面を選択することもできます。

図3:精密なプローブ位置決めのための高速経頭血管造影スキャンと脳登録ある。 高速血管造影スキャン中に最初のコロナスライス(緑色)から最後のコロナスライス(青)まで超音波プローブによって経クラ膜的にスキャンされるマウス脳の模式的表現。現在の画像化されたスライス(赤で表される)は、脳の後ろ(緑)から前部(青)にステップバイステップで移動します。アンジオ3Dパネルでアイコスキャン取得ソフトウェアのBioRender.com B. スクリーンショットで作成されました。右のプリセットパラメータは、高速スキャンを設定します。最初のスライス、最後のスライスとステップサイズのmmの位置は、脳全体を直線的にスキャンするためによく選択されなければなりません。 C. IcoStudio 処理ソフトウェアのスクリーンショット。高速アンジオ3Dスキャンは、自動的にマウスの脳の参照テンプレートに登録されます。3つのビュー(左)は、脈管構造とマウス脳アレンアトラスの重ね合わせを冠状、矢状および軸方向のビューで示しています。 D. 3Dアンジオスキャンから16スライス(31個中)の直線レイアウト(モンタージュ)を、登録されたアレン参照アトラスを血管構造に重ね合わせています。 E. 左右の一次体性感覚皮質、バレルフィールド領域の中心に配置された2つのマーカーのおかげで、ソフトウェアによって計算されたモーター座標に対応する予測画像平面を示す脳ナビゲーションパネルのスクリーンショット。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

6. タスク誘発実験:ウィスカー刺激

1. 刺激の時間、刺激時間、繰り返し回数を含む刺激シーケンスを事前定義します。
2. 取得の合計時間、ポジション数、およびポジション間のデッドタイムを定義して、3D fUS シーケンスを実行します。TTL入力を介して集録システムと同期した自動刺激の場合は、集録を開始する前に Trig-IN オプションを選択します。
   注:この研究で提示された結果については、刺激は、側側/腹側方向のウィスカーの大部分のたわを可能にするように配置された綿棒を使用して提供されました。これは、同期を確実にするためにIconeus OneシステムにリンクされたArduino UNOカードによって駆動されるサーボモーターに固定されました。刺激のための推奨パラメータは、30 s ON、30 s OFF、20°および4 Hz周波数の振幅です。あるいは、刺激は、取得中に定義された時間にウィスカーを偏向させることによって手動で送達することもできる。
3. IcoStudio ソフトウェアで取得を開き、 アクティベーション マップ メニューを入力します。開始時間と終了時刻を使用してアクティブ化パターン フィールドに入力し、アクティブ化マップを計算します。ビジュアライゼーションの表示パラメータを調整します。非回線分析のために、アクティベーション マップを .h5 ファイルとしてエクスポートします。
   注: 活性化は、既定のマウスの血行力学的応答(HRF)によって複雑な刺激を伴う一般化線形モデル(GLM)アプローチを使用して推定されます。あるいは、活性化は、各ボクセルからの刺激パターンと血行力学的信号との間のピアソン相関を推定することによって直接可視化することができる。

7. 4D機能接続

1. 取得の合計時間、撮像平面の位置数、および位置間のデッドタイムを定義して、3D fUS シーケンスを実行します。
   メモ:4D機能接続の場合、各ボリューム<2.5s(サンプリング周波数は0.4Hz)と合計取得時間(180>のポイント数)を<することをお勧めします。
2. 取得を保存し、IcoStudio ソフトウェアにロードします。必要に応じて、.bps ファイルとアレン マウスの脳座標フレームワークを読み込みます。 [アトラスマネージャ] で、アトラスの地域を対象地域 (ROI) として選択します。
3. 機能接続メニューを入力し、ROI マネージャで目的のリージョンを選択します。結果を接続マトリックス (教師付き分析) またはシードベースの相関マップ (教師なし) として視覚化します。必要に応じて帯域幅フィルタを選択して調整し、統計分析用の相関結果をエクスポートします。
   注: 3D fUS イメージング モードでは、相対プローブ位置は手動で設定されます。したがって、2 種類のスキャンが可能で、機能アプリケーションに応じて、密なスキャンとスパース スキャンの 2 種類を選択できます (図 2C)。

結果

このプロトコルは、マウス脳における脳血血力学的変動の3D定量を、安静時または感覚刺激に反応して経年的に記述する。げっ歯類の脳機能活性化をマッピングする標準的なパラダイムであるウィスカ刺激は、感覚刺激誘発応答の一例として選択されている。 図4 は、経頭蓋fUSイメージングを用いて得られた麻酔用マウスにおける機械的ウィスカー刺激に応答した代表的な活性化マップを示す。試験時間の合計は760sで、60sベースライン(刺激前後)、80 s刺激、60sの回復時間を有し、5倍を繰り返した。有意な活性化は、デフォルトのマウス血行力学応答関数(HRF)を使用して一般線形モデル(GLM)の分解能で決定された。アクティブ化された領域 (複数比較のために厳密なボンフェローニ補正後に p 値 >0.0000006 の Z スコア) は、アレン共通の座標フレームワーク テンプレートにオーバーレイされた色分けされた値として表示されます。対側一次体性感覚皮質のボクセルワイズ時間経過は、バレルフィールド領域(S1BF)がベースラインと比較してCBVの15〜20%の増加を明らかにした。

図4:経頭蓋活性化マップおよびrCBV時間経過ケタミン/キシラジン麻酔マウスにおけるウィスカー刺激に続く。ある。 ケタミン/キシラジン麻酔下で右ウィスカー(80 s ON,60 s OFF,5x)の機械的刺激に続く活性化ボクセルを有意に活性化した図。マップは、多重比較のためのボンフェローニ補正を用いた一般線形モデル解析(GLM)に基づいてZスコアを計算することによって得られた。Zスコア(色分け)は、アレン脳3Dテンプレート(脳ポジショニングシステムへの登録後)に重ね合わせ、コロナル(左)、矢状(中央)、軸(右)の3つのビューで表示されます。アレンマウス脳共通座標フレームワークからの解剖学的領域が参照のために表示されます。活性化されたボクセルは、左S1BF皮質の中によく位置しています。スケールバー:1ミリメートル。各サンプル量は、3.85 sで2.8mm(標高方向の7つのスライスに対応)でスキャンされ、各機能応答中に20個のボリュームサンプルを記録することができました。 B. ウィスカ刺激誘発相対脳血量(rCBV)の3Dレンダリングは、ベースラインレベルと比較して増加する。S1BFの解剖学的線引きは青色で示される。 C. 左S1BF(青)と対応する刺激(赤)におけるCBV変動の時間変化の時間変化。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

同じパラダイムは、アイコスキャンの目覚めのプリセットを使用して、モバイルホームケージのヘッド固定動作マウスに適用されています。 図5 は、 図2に記載された実験セットアップを用いた複数のウィスカ刺激実験の後の活性化マップを示す。いくつかの後部および尾子のヒゲは次のパターンで刺激された:30 sベースラインに続いて30 s ON(4 Hz)および30 s OFFの5つの連続した試験(図5C)。刺激は、同期のための画像取得シーケンスをトリガするArduino UNOカードによって駆動されるサーボモータを使用して提供されました。有意な活性化は、デフォルトのマウス血行力学応答関数(HRF)を使用して一般線形モデル(GLM)の分解能で決定された。ボンフェローニ法で多重比較補正を行った。従来のアルファレベル0.05は、集録体積のボクセルの総数によって正規化され、最終的に0.000003の厳しい閾値となった。

図5:アクティベートマップとrCBV時間コースは、目覚めの動作マウスでのウィスカ刺激に続く。ある。 モバイルホームケージ内の目覚めのマウスで右ウィスカー(30 s ON、30 s OFF、5x)の機械的刺激に続いて有意に活性化されたボクセルを示す活性化マップ。マップは、多重比較(ボクセルの総数による正規化)のためのボンフェローニ補正を用いた一般線形モデル解析(GLM)に基づいてZスコアを計算することによって得られた。Zスコア(色分け)は、アレン脳3Dテンプレート(脳ポジショニングシステムへの登録後)に重ね合わせ、コロナル(左)、矢状(中央)、軸(右)の3つのビューで表示されます。アレンマウス脳共通座標フレームワークからの解剖学的領域が参照のために表示されます。活性化されたボクセルは、左S1BF皮質の中によく位置しています。スケールバー、1ミリメートル。各サンプルボリュームは、3.85 sで1.6mm(標高方向の3つのスライスに対応)でスキャンされ、各機能応答中に17個のボリュームサンプルを記録できます。 B. ウィスカー刺激誘発の3Dレンダリングは、ベースラインレベルと比較して増加する相対的な脳の血液量(rCBV)。S1BFの解剖学的線引きは青色で示される。 C. 右ウィスカー刺激実験中のモバイルホームケージにおけるマウスの図は、その間に30s試験を330 s.D. の合計取得時間に対して行った。活性化領域内に抽出された瞬間的相対CBV時間経過(青)と、対応する刺激が重畳された(赤)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6は、ケタミン-キシラジン麻酔マウスにおける3D脳領域間の正規化された低周波(<0.2Hz)自発的なCBV変動(アレン共通座標フレームワークへの登録から同定される)の時間的相関を示す。総取得時間は20分(1200s)であった。アトラス監督分析では、強い間半球間接続パターンが明らかになり、結果として得られる相関係数値は最大0.8でした。背部海馬の種子ベースの分析は、右海馬と左海馬だけでなく、深いレトロ海馬領域およびピリフォーム皮質の間の有意な間半球間接続性を明らかにした。S1BFで選択されたシード領域は、前述のように対称(コルチココルチカル)相関パターンをもたらした。

図6:ケタミン/キシラジン麻酔下のマウス脳の経頭蓋容積状態機能接続性を20分3D fUS取得で評価した。ある。 経頭蓋機能獲得に登録されたアレン共通座標フレームワークの3D領域に基づく相関行列。この行列は、スライスタイミング補正後に同定されたすべてのROIに含まれるすべてのボクセルからの平均時間信号の、正規化されたピアソンの自発的低周波変動(<0.1 Hz)の相関を計算することによって得られます。各サンプリングされたボリュームは、2.2 s. Bで取得した標高方向(4 スライスに対応)で 1.6 mm 以上スキャンされました。シードベースの解析を 3D テンプレートに投影します。種子は、β - 2.1ミリメートルで右の裏海馬内で選択されました。相関マップは、スライスタイミング補正後のシードの時間信号と集録全体の各ボクセルとの間のピアソン相関係数を計算することによって得られる。 C. 2.1 mmのS1BF内 βで選択されたシード領域を使用したシードベースの分析に基づくC. 3D相関マップ。スケールバー:1 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

脳の全イメージング法は、脳の生理学と病理をよりよく理解するための重要なツールです。ここで説明する方法は、直接ベンチで生きている脳の血行力信号の正確な定量を可能にします。機能的超音波の比類のない感度と時空間的解像度は、マウスの生理学に特に適しています。機能的応答と休止状態ネットワークは、短い取得時間内で、長い方向に、平均試験や被験者が信頼できる尺度を得ることなくマッピングできます。高感度超音波リニアプローブと高速電動セットアップの関連組合せにより、合理的な取得時間内にマウスで経頭蓋容積fUSイメージングを行うことができます。このプロトコルは、モバイルホームケージを使用して麻酔マウスまたは目覚めのマウスのいずれかで実行できます。

ウィスカ刺激は、本原稿の例として用いられる感覚刺激と、げっ歯類における標準的な機能的活性化パラダイムであり、感覚処理、神経血管結合およびそれらの変化を^{5、6、10、11}に研究するための信頼できる読み出しである。使用の容易さのために、ウィスカの粗い手動ブラッシングが好ましいかもしれませんが、この方法は空間的および時間的な精度を欠いている。fUSイメージングスキャナでトリガーされる自動刺激器のような自動刺激器を使用すると、発症時間、振幅変位、Qチップ/コームの角度など、いくつかのパラメータをより適切に制御でき、動物間の再現性が向上します。さらに、より正確な刺激タイミングにより、ピークパラメータ^12,13に発症する時間と時間を決定することにより、血行力学応答関数(HRF)のモデル化が可能^となる。刺激中に偏向したウィスカーの数(したがって活性化領域の領域)の精度を高めるために、より洗練された刺激器をこのプロトコルに適応させることができます。光^8、音^14、または匂い表示¹⁵のような他の多くの刺激は、同じプロトコルを使用して実施することができる。

機能的超音波と覚醒および動作する動物との相性は、他の神経イメージング技術と比較して重要な利点であり、麻酔バイアスを伴わない機能的活性化マッピングを可能にする。空気持ち上げられた移動式ホームケージを使用することは線形または球形のトレッドミルのような他の既存のヘッド固定装置に代わる良い方法である。ホームケージの動きをしっかりと固定しながら、マウスに環境をナビゲートする錯覚を与え、広範囲の行動検査をfUSイメージング¹⁶に結合することを可能にする。しかし、頭部固定の慣性手順は、特に交和因子と考えられる実験において、ストレスを軽減するための重要なステップを構成する。ここで詳述される手順(頭部固定への取り扱いと慣化の6日間)は、感覚刺激および安静状態機能接続性に対する堅牢な結果を与える。しかし、より洗練された行動検査¹⁷のために慣例期間を延長する必要があるかもしれません。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Plastipak 1 mL syringes	Dutscher, France	303172
BD Microlance 26 Gauge needles	Dutscher, France	303800
Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe)	Physitemp	TCAT-2DF
Arduino	Arduino	Arduino Uno-Rev3
Atipamezole	Orion Pharma, France	Antisedan®	5 mg/ml injectable solution
Dental Ciment	Sun Médical, Shiga, japan	Superbond C&B
Depilatory cream	Klorane	N/A
Eye Ointment	TVM, UK	Ocry-gel
Hair trimmer	Wella Profesionnals	N/A
Head plates	Neurotar, Finland	Model 14
Iconeus One standard package for fUS	Iconeus, France	Iconeus One
IcoScan acquisition software (v1.0)	Iconeus, France	IcoScan
IcoStudio analysis software (v1.0)	Iconeus, France	IcoStudio
Isoflurane Anesthesia station	Minerve, Esternay, France
Ketamine	Virbac, France	Ketamine1000	100 mg/ml injectable solution
Lidocaine	Vetoquinol	Lurocaine®	20 mg/ml injectable solution
Medetomidine	Orion Pharma, France	Domitor®	1 mg/ml injectable solution
Meloxicam	Boehringer lingelheim	Metacam®	0.5 mg/ml injectable solution
Mobile HomeCage Large with tracking capability	Neurotar, Finland	MHC-L-T-V4
Monitoring of ECG and breathing rate	AD Systems, (USA) and LabChart software
Servomotor	Feetech	FT90B
Stereotaxic frame	David Kopf (Tujunga, USA)	900-WA	Using Mouse Adaptor  (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922)
Surgical glue	3M, USA	Vetbond
Syringe Pump	KD Scientific, USA	Legato® 130, Cat# 788130
Ultrasound gel	DREXCO medical, France	Medi'Gel
Xylazine 2%	Bayer, France	Rompun®	20 mg/ml injectable solution