طريقة تلقيح سهلة ومرنة لتقييم الأنماط الظاهرية لعدوى البياض الدقيقي للأرابيدوبسيس والنباتات الأخرى بدقة

Summary

نقدم بروتوكولا لبناء نظام توزيع بوغ بسيط يتكون من صندوق تلقيح بشبكة ~ 50 ميكرومتر وغرفة بلاستيكية شفافة. يمكن استخدام هذا لتلقيح النباتات بالتساوي بجراثيم البياض الدقيقي ، وبالتالي تمكين التقييم الدقيق والقابل للتكرار للأنماط الظاهرية للأمراض للنباتات قيد الدراسة.

Abstract

يتطلب الحد من خسائر المحاصيل بسبب الأمراض الفطرية فهما أفضل للآليات التي تحكم مناعة النبات والتسبب في الأمراض الفطرية ، الأمر الذي يتطلب بدوره التحديد الدقيق للأنماط الظاهرية للأمراض للنباتات عند الإصابة بممرض فطري معين. ومع ذلك ، فإن التنميط الظاهري الدقيق للأمراض مع مسببات الأمراض الفطرية الحيوية غير القابلة للزراعة مثل البياض الدقيقي ليس من السهل تحقيقه ويمكن أن يكون خطوة تحد من معدل مشروع بحثي. هنا ، قمنا بتطوير نظام تنميط ظاهري آمن وفعال وسهل التشغيل للمرض باستخدام تفاعل Arabidopsis مع البياض الدقيقي كمثال. يتكون هذا النظام بشكل أساسي من ثلاثة مكونات: (i) صندوق تلقيح خشبي مزود بغطاء قابل للإزالة مثبت بشبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ أو النايلون من مسام ~ 50 ميكرومتر لتلقيح شقة من النباتات ذات الجراثيم الفطرية ، (ii) غرفة بلاستيكية شفافة ذات فتحة أمامية صغيرة لتقليل هروب البوغ أثناء إجراء التلقيح بالداخل ، و (ج) طريقة إزاحة البوغ وتوزيعها من أجل التلقيح المتساوي والفعال. تتضمن البروتوكولات الموضحة هنا الخطوات والمعلمات لصنع صندوق التلقيح والغرفة البلاستيكية بتكلفة منخفضة ، وعرض فيديو لكيفية استخدام النظام لتمكين التلقيح المتساوي بجراثيم البياض الدقيقي ، وبالتالي تحسين دقة وتكرار التنميط الظاهري للمرض.

Introduction

البياض الدقيقي هو واحد من أكثر الأمراض شيوعا وأهمية للعديد من المحاصيل الغذائية ونباتات الزينة¹. حظيت دراسات أمراض البياض الدقيقي بشعبية كبيرة ، كما يتضح من أكثر من 10500 منشور كنتيجة بحث مع "البياض الدقيقي" ككلمة رئيسية في Web of Science (اعتبارا من نوفمبر 2020). في الواقع ، يعتبر البياض الدقيقي (الذي يمثله Blumeria graminis) أحد أفضل 10 مسببات الأمراض الفطرية من قبل مجلة Molecular Plant Pathology². يعد القياس الكمي للحساسية للأمراض خطوة ضرورية في توصيف الجينات النباتية التي تساهم في مقاومة الأمراض أو قابليتها للإصابة ، أو التحديد الوظيفي للجينات المستجيبة المرشحة في البياض الدقيقي. ومع ذلك ، فإن التنميط الظاهري الموثوق به للأمراض أكثر صعوبة بكثير مع البياض الدقيقي مقارنة بمعظم مسببات الأمراض الفطرية الأخرى ، ويرجع ذلك جزئيا إلى أنه ، على عكس جراثيم الأخير ، تظهر جراثيم أنواع البياض الدقيقي (مثل Golovinomyces cichoracearum UCSC1 بناء على تجربتنا المعملية) قابلية أقل للحياة بعد المرور بعملية تعليق مائي ^3,4 . قد يؤدي التلقيح غير الكافي و / أو غير المتكافئ لنباتات الاختبار بممرض البياض الدقيقي إلى نتائج تنميط ظاهري غير دقيقة.

تم الإبلاغ عن عدد من طرق التلقيح لدراسات البياض الدقيقي. وتشمل هذه (i) تنظيف الجراثيم مباشرة من الأوراق المصابة لاختبار النباتات⁵ ، (ii) رش معلق بوغ لاختبار النباتات⁶ ، (iii) نفخ الجراثيم باستخدام برج ترسيب يعمل بالفراغ للنباتات الموجودة في أسفل البرج⁷ ، و (iv) تسليم البوغ عن طريق الاستخدام التوافقي لغشاء شبكة نايلون والاهتزاز القائم على الصوت⁸ . طريقة تنظيف الأبواغ (أو الغبار) سهلة الأداء ولكنها غير متساوية بطبيعتها ، وبالتالي قد لا تكون دقيقة للتقييم الكمي. يعد رش البوغ مريحا وحتى ، ولكن كما هو مذكور أعلاه قد يؤدي إلى ضعف إنبات البوغ⁴. والطريقتان الأخيرتان (أي من الثالث إلى الرابع) هما طريقتان محسنة كثيرا وقادرتان على تحقيق التلقيح المتساوي؛ ومع ذلك ، فإن كلاهما ليس مرنا في تعديل قدرة التلقيح الخاصة بهما من حيث عدد النباتات التي سيتم تلقيحها في حدث واحد ، مما يجعل أيا من الجهازين ليس تافها ، ويقتصر تشغيلهما على مناطق المختبر حيث يوجد فراغ و / أو مصدر كهرباء.

يعمل مختبرنا مع تفاعل البياض الدقيقي النباتي لأكثر من 20 عاما ^9,10. على مدى العقد الماضي ، اختبرنا عددا من طرق التلقيح وطورنا مؤخرا طريقة بسيطة وفعالة لتلقيح البياض الدقيقي. يمكن أن تضمن طريقة تنظيف الأبواغ القائمة على الشبكة تلقيحا متساويا ، وهي بسيطة وقابلة للتطوير ، وبالتالي يجب اعتمادها بسهولة من قبل أي مختبر يعمل مع البياض الدقيقي.

Protocol

1. صنع صندوق تلقيح قياسي بغطاء علوي قابل للإزالة مثبت بشبكة

1. قم بشراء لفة من شبكة غشاء نايلون 50 ميكرومتر أو شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ 48 ميكرومتر (موصى به) من المتاجر. تأكد من طلب ما يكفي للتقطيع إلى قطع متعددة بحجم 14 بوصة × 26 بوصة لاستبدال الشبكة البالية.
2. قم بشراء لوح ليفي متوسط الكثافة أو خشب رقائقي 1/4 بوصة × 2 قدم × 4 قدم ، وقم بقطع قطعتين 24-1 / 2 بوصة × 10 قطع واثنتين 12 بوصة × 10 قطع لصنع صندوق تلقيح. استخدم 8 مشابك زاوية لدعم الجوانب الأربعة.
   ملاحظة: إذا كانت تواجه الجانب العريض من العلبة ، فإن الجانب الأيسر 12 بوصة × 10 بوصة متصل بشكل دائم والجانب الأيمن 12 بوصة × 10 في الجانب عبارة عن باب قابل للإزالة مثبت في مكانه بواسطة أربعة مقابض مغناطيسية (الشكل 1 أ ، ب).
3. ضع أربعة أقواس زاوية 2 بوصة اثنين في كل زاوية داخلية من الجانب الأيسر ، بوصة واحدة من الأعلى وبوصة واحدة من الأسفل ، ضع علامة على حفرة وحفرها. استخدم البراغي لربط الجانب القصير الأيسر بشكل دائم بجانبين طويلين (أمامي وخلفي). يجب أن تكون المسافة الداخلية بين الجانبين الطويلين 12 بوصة وليس 11-1 / 2 بوصة.
4. مع بقاء مشابك الزاوية في مكانها والمحاذاة الصحيحة للباب الأيمن ، قم بتمييز وحفر موقع 4 مصيد مغناطيسي لتثبيت الباب الصحيح القابل للفصل في مكانه. تثبيت مقبض زر على الباب. يمسك الجزء العلوي من الباب تحت الغطاء العلوي (الشكل 1 أ ، ب).
5. لعمل غطاء علوي قابل للإزالة بشبكة ، قم بقص وتد خشبي مربع طويل إلى مجموعتين من 26 بوصة و 12-3 / 4 بوصة. قم بلصق القطع الأربع وتثبيتها بطريقة تتناسب مع الصندوق - الأبعاد الداخلية للإطار أكبر قليلا من الأبعاد الخارجية للصندوق ، حيث سيتم إرفاق شبكة الشاشة بهذا الإطار.
6. قص شبكة الشاشة إلى أقل بقليل من 14 بوصة × 26 بوصة. لا تسمح للشاشة بالبروز بعد الإطار لمنع الحواف الحادة. احصل على مساعدة لتمديد الشاشة على الإطار. امسك الشبكة بالإطار بواسطة المشابك (الشكل 1C) واستخدم مسدس دباسة مع الدبابيس اليمنى لتثبيت الشاشة بالإطار.
7. اقطع مجموعتين من وتد خشبي مربع أقصر (21 بوصة و 9 بوصات) ، واستخدم مسامير لشطيرة الشبكة بإحكام على طول الإطار باستخدام 4 قطع أقصر من وتد خشبي مربع (الشكل 1C ، D).

2. صنع غرفة التلقيح

1. قم بشراء ألواح الأكريليك الشفافة وعناصر الأجهزة من المتاجر المناسبة. قص 7 × 20 في نافذة الفتح على لوح الأكريليك الأمامي للصندوق كما هو موضح في الشكل 2C.
2. قم بتجميع الجانبين الأيسر والأيمن ، الأمامي (مع النافذة) وألواح الأكريليك الخلفية في صندوق باستخدام 8 مشابك زاوية كما هو موضح في الشكل 2 أ. تأكد من أن القياسات الداخلية للغرفة تساوي أبعاد الورقة العلوية.
   ملاحظة: الجانب الأيمن موجود للدعم ولن يتم توصيله بالأوراق الأمامية أو الخلفية. إنه أقصر بمقدار 1/2 من الأوراق الأخرى عن قصد. سيصبح هذا الجانب الأيمن بابا "سحبا" "رفرفا" مثبتا في مكانه بواسطة مفصلة زاوية قائمة في الأسفل واثنين من المصيد المغناطيسي في الأعلى كما هو موضح في الشكل 2C ، D.
3. استخدم دعامات الزاوية لتأمين الألواح معا (الشكل 2 ب ، ج). ثبت الأقواس في مكانها ، وقم بتمييزها بعلامة شاربي ، ولكمة مركزية ثم احفر الحفرة.
   ملاحظة: حفر الاكريليك يختلف عن حفر أي شيء آخر ، لا قوة أو قد يتصدع جانب الحفرة المقابلة للحفر. استخدم المسامير أو البراغي. لا تفرط في شد البراغي وإلا فقد يتشقق الأكريليك بمرور الوقت.
4. أدر العلبة على جانبها الخلفي وقم بإزالة مشابك الزاوية 4 وضع الورقة العلوية في مكانها. علامة والحفر.
5. قم بتثبيت مفصلة الزاوية اليمنى ، مصنوعة من دعامة زاوية 3/4. استخدم صامولة قفل من النايلون كقضيب مفصلي. لا تشد ، اترك فجوة حتى يدور الباب على هذه المفصلة.
6. ضع علامة ، لكمة مركزية ، حفر وإرفاق مغناطيسي الباب المغناطيسي بمسامير رأس عموم # 6-32x3 / 4. ثم قم بتوصيل لوحات الصيد بمسامير رأس مسطحة # 6-32x3 / 8 بوصة ، انظر الشكل 2C ، D.

3. تلقيح النباتات في الشقق

1. تحضير جراثيم البياض الدقيقي الطازجة كلقاح (على سبيل المثال ، البياض الدقيقي Arabidopsis Golovinomyces cichoracearum UCSC1). قم بزراعة نباتات متحولة نظيفة من مادة Arabidopsis ضعيفة المناعة 4-1 ¹¹ في غرفة نمو (22 درجة مئوية ، رطوبة نسبية 65٪ لمدة 6-8 أسابيع) ، وقم بتلقيح واحد أو نصف مسطح من نباتات pad4-1 لبناء ما يكفي من جراثيم البياض الدقيقي الطازجة (الشكل 3 أ).
2. قم بزراعة النباتات لتحديد الأنماط الظاهرية للعدوى في المعيار 11 بوصة × 21 بوصة × 2.5 في الشقق.
   ملاحظة: نباتات أرابيدوبسيس التي تزرع تحت يوم قصير (8 ساعات ضوء ، 16 ساعة مظلمة ؛ 22 درجة مئوية) لمدة ستة إلى ثمانية أسابيع جيدة لاختبارات العدوى مع البياض الدقيقي.
3. عندما تتوفر جراثيم البياض الدقيقي الطازجة من النباتات المصابة في 8-10 أيام بعد التلقيح (dpi) ، انقل شقة من النباتات لاختبار العدوى إلى صندوق التلقيح داخل غرفة التلقيح (الشكل 1B ، 2C).
4. قطع 15-20 ورقة أرابيدوبسيس شديدة العدوى (أو 4-6 وريدات مصابة ، اعتمادا على حجم الورقة / الوردة ومستوى التلقيح) ، اترك الأوراق تجف إذا كان هناك ماء مكثف.
5. الاستيلاء على 1-2 أوراق أو وردة مع زوج من ملقط طويل باستخدام يد واحدة ووجه الأوراق رأسا على عقب. بعد ذلك ، ضع كلتا يديك من خلال فتحة الحجرة وضرب ذراع الملقط برفق بمقص أثناء تحريك الأوراق / الوردة ببطء فوق الشبكة المثبتة على صندوق التلقيح (الشكل 3 ب). كرر هذا حتى يتم استخدام جميع الأوراق أو الوريدات.
   ملاحظة: سوف تزيح الجراثيم الناضجة بسهولة من كونيديوفورات الأوراق المصابة. حاول إزاحة الجراثيم على الشبكة بالتساوي قدر الإمكان.
6. استخدم فرشاة أو اثنتين من فرش خلاط المروحة الدقيقة لتنظيف الجراثيم برفق عبر الشبكة (الشكل 3 ج). تأكد من تنظيف سطح الشبكة بالكامل في اتجاهات مختلفة لمدة أربع مرات أو أكثر لزيادة التوزيع المتساوي للجراثيم على النباتات في قاع صندوق التلقيح (الشكل 3 د). ربت برفق على الشبكة لعدة مرات باستخدام الفرش للتخلص من الجراثيم العالقة في الشبكة.
7. دع الجراثيم تستقر لمدة نصف دقيقة. بعد ذلك ، انقل الشقة التي تحتوي على النباتات الملقحة من صندوق التلقيح. قم بتغطية الشقة بقبة بلاستيكية وضعها في غرفة نمو (22 درجة مئوية ، رطوبة نسبية 65٪). يمكن إجراء التنميط الظاهري للمرض عند 5 ، أو 8 إلى 12 نقطة في البوصة ¹².

4. تلقيح النباتات بصناديق تلقيح أصغر

ملاحظة: في الحالات التي يتم فيها تلقيح عدد أقل من النباتات ، لا يزال من الممكن استخدام صندوق التلقيح القياسي. تأكد من وضع النباتات في منتصف الصندوق. قم بإزاحة وفرشاة الجراثيم في منطقة الشبكة التي تغطي النباتات لضمان تلقيح جميع النباتات مع حفظ اللقاح. بدلا من ذلك ، ويفضل ، يمكن استخدام صناديق تلقيح أصغر (كما هو موضح أدناه).

1. تحويل صناديق من الورق المقوى إلى صندوق تلقيح. ما عليك سوى إزالة الجانبين العلوي والسفلي للصندوق ، ولصق الزاوية لتثبيتها إذا لزم الأمر ، وتركيب شبكة بحجم مناسب 50 ميكرومتر في الأعلى عن طريق اللصق أو التدبيس (الشكل 4 أ ، ب).
2. حرك الشقة التي تحتوي على النباتات داخل غرفة التلقيح ، ضع صندوق التلقيح الأصغر أعلى الشقة لتغطية النباتات.
3. قم بإزاحة وفرشاة الجراثيم كما هو موضح أعلاه.

5. تلقيح الأوراق المنفصلة في أطباق بتري

ملاحظة: في الحالات التي تكون فيها (i) جراثيم البياض الدقيقي الطازجة محدودة للغاية و / أو (ii) يجب الحفاظ على نظافة النباتات بينما يجب تقييم الأنماط الظاهرية للمرض و / أو توطين البروتين تحت الخلوي في الخلايا المصابة ، يمكن استخدام الأوراق المنفصلة للعدوى في ألواح MS-agar.

1. اصنع صندوق تلقيح صغير أكبر قليلا من طبق بتري.
2. تحضير 1/2 قوة موراشيج وسكوج (MS) لوحات أجار متوسطة (1.5 ٪). أضف ثيابندازول (40 مجم / لتر) لتقليل تلوث العفن إذا لزم الأمر. قم بتخزين الأطباق على حرارة 4 درجات مئوية في الثلاجة حتى الاستخدام.
3. قطع واحد أو اثنين من الأوراق الموسعة بالكامل من قاعدة سويقة لكل نبات على حدة ليتم اختبارها. أدخل سويقات الأوراق المنفصلة في وسط أجار بزاوية ~ 30 درجة.
   ملاحظة: يمكن أن تحتوي كل لوحة على 20-40 ورقة حسب حجم الأوراق واللوحة المستخدمة (الشكل 4C).
4. تلقيح الأوراق داخل غرفة التلقيح كما هو موضح أعلاه. انقل اللوحة مع الغطاء إلى غرفة النمو.
5. قطع جزء صغير من ورقة والتحقق من توطين تحت الخلوية للبروتينات في نقاط زمنية محددة.
6. لتقييم الأنماط الظاهرية للعدوى ، انقل الأوراق إلى صفيحة MS-agar معقمة جديدة عند 4 أو 5 نقاط في البوصة. قطع قاعدة السويقة قبل إدخال الأوراق في وسط أجار طازج. تقييم الأنماط الظاهرية للمرض في 8 أو 9 نقطة في البوصة.

النتائج

هنا ، نقدم طريقة جديدة لتلقيح بوغ البياض الدقيقي سهلة التحضير والتشغيل والضبط. يوضح الشكل 1 تجميع صندوق التلقيح القياسي مع التركيز على صنع الغطاء القابل للإزالة المثبت بشبكة غشائية 50 ميكرومتر. يوضح الشكل 2 تجميع غرفة التلقيح. يوضح الشكل 3 ال?...

Discussion

تتميز طريقة التلقيح القائمة على الصندوق الشبكي لدينا بالعديد من المزايا مقارنة بطرق التلقيح الأخرى. أولا ، يمكن أن يحقق توزيعا متساويا للجراثيم إذا تم تشغيله بشكل صحيح ، كما هو موضح في الشكل 5. ثانيا ، يمكن أن يؤدي استخدام شبكة ~ 50 ميكرومتر ، بالإضافة إلى إزاحة البوغ عن طريق ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48"	Amazon	NA	For making the lid of an inoculation box
#6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts	Home Depot	NA	For making an inoculation chamber
#6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack)	Home Depot	NA	For making an inoculation chamber
#6-32x3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts	Home Depot	NA	For securing  magnet door catch plates
#8-32x1/2" machine screws, flat washers and nuts	Home Depot	NA	For securing corner braces and door hinge
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet;  Size: 17 ½" X 20"	Professional Plastics	SACR.250CEF	For making an inoculation chamber
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20"	Professional Plastics	SACR.250CEF	For making an inoculation chamber
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30"	Professional Plastics	SACR.250CEF	For making an inoculation chamber
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ "	Professional Plastics	SACR.250CEF	For making an inoculation chamber
1-5/8" cabinet door magnetic catch white	Home Depot	Model #P110-W	For making an inoculation chamber
2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack)	Home Depot	Model #13611	For making an inoculation box & chamber
3" Corner Clamp	Harbor Freight Tools	SKU 63653, 1852, 60589	For making inoculation chamber
3/4"  steel zinc plated corner brace (4-Pack)	Home Depot	Model #13542	For making an inoculation box & chamber
4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles	Home Depot	Model #15184	For making an inoculation box
Fine fan-blender brushes	Michaels Store	M10472846	For inoculation
Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel	Home Depot	NA	For making the lid of an inoculation box
Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4');	Home Depot	Model# 1508104	For making an inoculation box
Round glass coverslips with a 500 µm grid	ibidi USA Inc.	10816	For determining  spore density