Arabidopsis ve diğer bitkilerin külleme enfeksiyonu fenotiplerini doğru bir şekilde değerlendirmek için kolay ve esnek bir aşılama yöntemi

Özet

~ 50 μm ağ ve şeffaf bir plastik odaya sahip bir aşılama kutusundan oluşan basit bir spor dağıtım sistemi oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu, bitkileri külleme sporlarıyla eşit şekilde aşılamak için kullanılabilir, böylece incelenen bitkilerin hastalık fenotiplerinin doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Özet

Mantar hastalıklarına bağlı mahsul kayıplarının azaltılması, bitki bağışıklığını ve mantar patogenezini yöneten mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını gerektirir ve bu da belirli bir mantar patojeni ile enfeksiyon üzerine bitkilerin hastalık fenotiplerinin doğru bir şekilde belirlenmesini gerektirir. Bununla birlikte, külleme gibi kültürlenemeyen biyotrofik mantar patojenleri ile doğru hastalık fenotiplemesi elde etmek kolay değildir ve bir araştırma projesinin hız sınırlayıcı bir adımı olabilir. Burada, Arabidopsis-külleme etkileşimini örnek olarak kullanarak güvenli, verimli ve kullanımı kolay bir hastalık fenotipleme sistemi geliştirdik. Bu sistem temel olarak üç bileşenden oluşur: (i) mantar sporları olan bir bitki düzlüğünü aşılamak için ~ 50 μm gözenekli paslanmaz çelik veya naylon ağ ile monte edilmiş çıkarılabilir bir kapakla donatılmış ahşap bir aşılama kutusu, (ii) içeride aşılama yaparken spor kaçışını en aza indirmek için küçük bir ön açıklığa sahip şeffaf bir plastik oda, ve (iii) eşit ve etkili aşılama için bir spor yerinden çıkarma ve dağıtım yöntemi. Burada açıklanan protokoller, aşılama kutusunu ve plastik odayı düşük bir maliyetle yapmak için adımları ve parametreleri ve külleme sporlarıyla aşılamayı sağlamak için sistemin nasıl kullanılacağına dair bir video gösterimini içerir, böylece hastalık fenotiplemesinin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini arttırır.

Giriş

Külleme, çok sayıda gıda bitkisinin ve süs bitkisinin en yaygın ve önemli hastalıklarından biridir¹. Külleme hastalıkları çalışmaları, Web of Science'da (Kasım 2020 itibariyle) anahtar kelime olarak "külleme" ile arama sonucu olarak 10.500'den fazla yayının kanıtladığı gibi çok popüler olmuştur. Gerçekten de, külleme (Blumeria graminis ile temsil edilir), Moleküler Bitki Patolojisi² dergisi tarafından en iyi 10 mantar patojeninden biri olarak kabul edilir. Hastalık duyarlılığının ölçülmesi, hastalık direncine veya duyarlılığına katkıda bulunan bitki genlerinin karakterizasyonunda veya küllemede aday efektör genlerin fonksiyonel olarak tanımlanmasında gerekli bir adımdır. Bununla birlikte, güvenilir hastalık fenotiplemesi, diğer mantar patojenlerinin çoğuna kıyasla külleme ile çok daha zordur, çünkü kısmen, ikincisinin sporlarının aksine, külleme türlerinin sporları (laboratuvar deneyimimize dayanan Golovinomyces cichoracearum UCSC1 gibi) bir su süspansiyonu işleminden geçtikten sonra canlılığın azaldığını göstermektedir ^3,4 . Test tesislerinin belirli bir külleme patojeni ile yetersiz ve / veya düzensiz aşılaması, yanlış fenotipleme sonuçlarına yol açabilir.

Külleme çalışmaları için bir dizi aşılama yöntemi bildirilmiştir. Bunlar arasında (i) sporların doğrudan enfekte olmuş yapraklardan test tesislerine fırçalanması⁵, (ii) test tesisleri^için bir spor süspansiyonunun püskürtülmesi, (iii) vakumla çalışan bir çökeltme kulesi kullanarak sporların kulenin altındaki bitkilere üflenmesi⁷ ve (iv) naylon örgü membranın kombinatoryal kullanımı ve ses bazlı titreşim⁸ . Spor fırçalama (veya tozlama) yönteminin gerçekleştirilmesi kolaydır, ancak doğada eşit değildir, bu nedenle nicel değerlendirme için doğru olmayabilir. Spor püskürtme uygun ve düzgündür, ancak yukarıda belirtildiği gibi zayıf spor çimlenmesine neden olabilir⁴. Son ikisi (yani, iii-iv), aşılamayı bile sağlayabilen çok gelişmiş yöntemlerdir; Bununla birlikte, her ikisi de aşılama kapasitelerini tek bir olayda aşılanacak bitki sayısı açısından ayarlamada esnek değildir, bu da her iki aparatın da önemsiz olmamasını sağlar ve çalışmaları vakum ve / veya elektrik kaynağının bulunduğu laboratuvar alanlarıyla sınırlıdır.

Laboratuvarımız 20 yılı aşkın bir süredir bitki-külleme etkileşimi ile çalışmaktadır ^9,10. Son on yılda, bir dizi aşılama yöntemini test ettik ve yakın zamanda basit ama etkili bir külleme aşılama yöntemi geliştirdik. Bu ağ bazlı spor fırçalama yöntemi, aşılamayı bile sağlayabilir ve basit ve ölçeklenebilirdir, bu nedenle külleme ile çalışan herhangi bir laboratuvar tarafından kolayca benimsenmelidir.

Protokol

1. Bir ağ ile monte edilmiş çıkarılabilir bir üst kapaklı standart bir aşılama kutusu yapmak

1. Mağazalardan 50 μm naylon membran örgü veya 48 μm paslanmaz çelik örgü (önerilen) rulosu satın alın. Aşınmış ağın değiştirilmesi için 14 inç x 26 inçlik birden fazla parçaya kesmek için yeterince sipariş verdiğinizden emin olun.
2. Bir adet 1/4 in x 2 ft x 4 ft orta yoğunluklu sunta veya kontrplak satın alın ve bir aşılama kutusu yapmak için parçalar halinde iki adet 24-1/2 in x 10 ve parçalar halinde iki adet 12 in x 10 kesin. Dört tarafı desteklemek için 8 köşe kelepçesi kullanın.
   NOT: Muhafazanın geniş tarafına bakıyorsanız, sol 12 inç x 10 yan yana kalıcı olarak tutturulur ve yandaki sağ 12 inç x 10, dört manyetik yakalama ile yerinde tutulan çıkarılabilir bir kapıdır (Şekil 1A, B).
3. Sol tarafın her bir iç köşesine, üstten bir inç ve alttan bir inç olmak üzere dört adet 2 inç köşe desteği yerleştirin, bir delik işaretleyin ve delin. Sol kısa tarafı iki uzun tarafa (ön ve arka) kalıcı olarak bağlamak için vidaları kullanın. İki uzun kenar arasındaki iç mesafe 11-1/2 inç değil, 12 inç olmalıdır.
4. Köşe kelepçeleri hala yerinde ve sağ kapının uygun şekilde hizalanmasıyla birlikte, sağ çıkarılabilir kapıyı yerinde tutmak için 4 manyetik yakalamanın yerini işaretleyin ve delin. Kapıya bir düğme düğmesi takın. Kapının üst kısmı üst kapağın altında kalıyor (Şekil 1A,B).
5. Bir ağ ile çıkarılabilir bir üst kapak yapmak için, uzun ahşap kare dübelini 26 inç ve 12-3/4 inçlik 2 set halinde kesin. Dört parçayı kutunun etrafına sığacak şekilde yapıştırın ve çivileyin - ekran ağı bu çerçeveye tutturulacağından, çerçevenin iç boyutları kutunun dış boyutlarından biraz daha büyüktür.
6. Ekran ağını 14 inç x 26 inçten biraz daha az bir değere kesin. Keskin kenarları önlemek için ekranın çerçeveden dışarı çıkmasına izin vermeyin. Çerçevedeki ekranı germek için yardım alın. Ağı çerçeveyle kelepçelerle tutun (Şekil 1C) ve ekranı çerçeveye sabitlemek için sağ zımbalara sahip bir zımba tabancası kullanın.
7. İki set daha kısa ahşap kare dübel (21 inç ve 9 inç) kesin ve 4 kısa ahşap kare dübel parçasını kullanarak ağı çerçeve boyunca sıkıca sandviç yapmak için vidalar kullanın (Şekil 1C, D).

2. Aşılama odası yapılması

1. Uygun mağazalardan şeffaf akrilik levhalar ve donanım öğeleri satın alın. Şekil 2C'de gösterildiği gibi kutunun ön tarafındaki akrilik levhadaki açma penceresinde 7 inç x 20 kesin.
2. Sol ve sağ tarafları, ön (pencereli) ve arka akrilik levhaları Şekil 2A'da gösterildiği gibi 8 köşe kelepçesi kullanarak bir kutuya monte edin. Odanın iç ölçümlerinin üst tabakanın boyutlarına eşit olduğundan emin olun.
   NOT: Sağ taraf destek için oradadır ve ön veya arka sayfalara takılmayacaktır. Bilerek diğer sayfalardan 1/2 daha kısadır. Bu sağ taraf, Şekil 2C, D'de gösterildiği gibi altta dik açılı bir menteşe ve üstte iki manyetik yakalama ile yerinde tutulan bir "aşağı çekme" "kanat" kapısı haline gelecektir.
3. Panelleri birbirine sabitlemek için köşe destekleri kullanın (Şekil 2B, C). Diş tellerini yerinde tutun, keskin bir işaretleyici ile işaretleyin, ortayı delin ve ardından deliği delin.
   NOT: Akrilik delmek başka bir şeyi delmekten farklıdır, zorlamayın veya matkabın karşısındaki deliğin tarafı çatlayabilir. Perçin veya vida kullanın. Vidaları aşırı sıkmayın, aksi takdirde akrilik zamanla çatlayabilir.
4. Muhafazayı arka tarafına çevirin ve 4 köşe kelepçesini çıkarın ve üst tabakayı yerine yerleştirin. İşaretleyin ve delin.
5. 3/4 açılı bir braketten yapılmış dik açılı menteşeyi takın. Menteşe çubuğu olarak naylon bir tutma kilidi somunu kullanın. Sıkmayın, bir boşluk bırakın, böylece kapı bu menteşe üzerinde dönecektir.
6. İki manyetik kapı mıknatısını #6-32x3/4" tava başlı vidalarla işaretleyin, ortalayın, delin ve takın. Ardından yakalama plakalarını #6-32x3/8" düz başlı vidalarla takın, bkz. Şekil 2C,D.

3. Dairelerdeki bitkilerin aşılanması

1. Taze külleme sporlarını inokula olarak hazırlayın (örneğin, Arabidopsis külleme Golovinomyces cichoracearum UCSC1). Bir büyüme odasında (22 ° C, 6-8 hafta boyunca% 65 bağıl nem) temiz Arabidopsis bağışıklık sistemi baskılı pad4-1 mutant bitki 11 yetiştirin ve yeterli taze külleme sporları oluşturmak için pad4-1 bitkilerinin bir veya yarım düzlüğünü aşılayın (Şekil 3A).
2. Enfeksiyon fenotiplerini belirlemek için bitkileri standart 11 in x 21 in x 2.5 in flat olarak yetiştirin.
   NOT: Altı ila sekiz hafta boyunca kısa gün (8 saat ışık, 16 saat karanlık; 22 ° C) altında yetiştirilen Arabidopsis bitkileri, külleme ile enfeksiyon testleri için iyidir.
3. Aşılamadan 8-10 gün sonra enfekte olmuş bitkilerden taze külleme sporları (dpi) mevcut olduğunda, enfeksiyon testi için bir düzlük bitkiyi aşılama odasının içindeki aşılama kutusuna taşıyın (Şekil 1B, 2C).
4. Ağır enfekte olmuş 15-20 Arabidopsis yaprağını (veya yaprak / rozet boyutuna ve aşılama seviyesine bağlı olarak 4-6 enfekte rozet) kesin, yoğunlaştırılmış su varsa yaprakların kurumasını bekleyin.
5. Bir elinizi kullanarak 1-2 yaprak veya bir çift uzun forseps içeren bir rozet alın ve yaprakları baş aşağı çevirin. Daha sonra, her iki elinizi de odanın açıklığından geçirin ve yaprakları / rozeti aşılama kutusuna monte edilmiş ağın üzerinde yavaşça hareket ettirirken forsepsin koluna bir çift makasla hafifçe vurun (Şekil 3B). Tüm yapraklar veya rozetler kullanılıncaya kadar bunu tekrarlayın.
   NOT: Olgun sporlar, enfekte olmuş yaprakların konidioforlarından kolayca çıkacaktır. Ağ üzerindeki sporları mümkün olduğunca eşit bir şekilde yerinden çıkarmaya çalışın.
6. Sporları ağdan nazikçe fırçalamak için bir veya iki ince fan-blender fırçası kullanın (Şekil 3C). Aşılama kutusunun altındaki bitkilere sporların eşit dağılımını en üst düzeye çıkarmak için ağın tüm yüzeyini dört veya daha fazla kez farklı yönlerde fırçaladığınızdan emin olun (Şekil 3D). Ağa sıkışmış sporları sallamak için fırçalarla ağı birkaç kez hafifçe sıvazlayın.
7. Sporların yarım dakika boyunca yerleşmesine izin verin. Ardından, aşılanmış bitkileri içeren düzlüğü aşılama kutusundan çıkarın. Daireyi plastik bir kubbe ile örtün ve bir büyüme odasına yerleştirin (22 ° C,% 65 bağıl nem). Hastalık fenotiplemesi 5 veya 8 ila 12 dpi ^12'de yapılabilir.

4. Bitkileri daha küçük aşılama kutuları ile aşılayın

NOT: Daha az bitkinin aşılanacağı durumlarda, standart aşılama kutusu hala kullanılabilir. Bitkileri kutunun ortasına yerleştirdiğinizden emin olun. İnokuladan tasarruf ederken tüm bitkilerin aşılanmasını sağlamak için bitkileri kaplayan ağ alanındaki sporları yerinden çıkarın ve fırçalayın. Alternatif olarak ve tercihen, daha küçük aşılama kutuları kullanılabilir (aşağıda açıklandığı gibi).

1. Karton kutuları bir aşılama kutusuna dönüştürün. Kutunun üst ve alt taraflarını çıkarın, gerekirse sıkılaştırmak için köşeyi bantlayın ve yapıştırarak veya zımbalayarak üste uygun boyutta 50 μm'lik bir ağ takın (Şekil 4A, B).
2. Bitkileri içeren düzlüğü aşılama odasının içinde hareket ettirin, bitkileri örtmek için daha küçük aşılama kutusunu dairenin üzerine yerleştirin.
3. Yukarıda tarif edildiği gibi sporları yerinden çıkarın ve fırçalayın.

5. Petri yemeklerinde müstakil yaprakları aşılayın

NOT: (i) taze külleme sporlarının çok sınırlı olduğu ve/veya (ii) enfekte hücrelerdeki hastalık fenotipleri ve/veya protein hücre altı lokalizasyonunun değerlendirilmesi gerekirken bitkilerin temiz tutulması gereken durumlarda, MS-agar plakalarında enfeksiyon için ayrılmış yapraklar kullanılabilir.

1. Petri kabından sadece biraz daha büyük olan mini bir aşılama kutusu yapın.
2. 1/2 mukavemetli Murashige ve Skoog (MS) orta boy agar (% 1.5) plakaları hazırlayın. Gerekirse küf kontaminasyonunu azaltmak için tiyabendazol (40 mg / L) ekleyin. Plakaları 4 °C'de kullanana kadar buzdolabında saklayın.
3. Test edilecek her bir bitki için yaprak sapının tabanından bir veya iki tamamen genişlemiş yaprak kökü kesin. Ayrılan yaprakların sapını ~ 30 ° 'lik bir açıyla agar ortamına yerleştirin.
   NOT: Her plaka, yaprakların büyüklüğüne ve kullanılan plakaya bağlı olarak 20-40 yaprak içerebilir (Şekil 4C).
4. Aşılama odasının içindeki yaprakları yukarıda açıklandığı gibi aşılayın. Plakayı kapakla birlikte bir büyüme odasına taşıyın.
5. Bir yaprağın küçük bir bölümünü kesin ve proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu belirli zaman noktalarında kontrol edin.
6. Enfeksiyon fenotiplerini değerlendirmek için, yaprakları 4 veya 5 dpi'de taze bir aseptik MS-agar plakasına aktarın. Yaprakları taze agar ortamına sokmadan önce yaprak sapının tabanını kesin. Hastalık fenotiplerini 8 veya 9 dpi'de değerlendirin.

Sonuçlar

Burada, hazırlanması, çalıştırılması ve ayarlanması kolay yeni bir külleme sporu aşılama yöntemi sunuyoruz. Şekil 1 , standart aşılama kutusunun montajını, 50 μm'lik bir membran ağı ile monte edilmiş çıkarılabilir kapağın yapımına vurgu yaparak göstermektedir. Şekil 2 , aşılama odasının montajını göstermektedir. Şekil 3 , bu sistemi kullanarak aşılama sürecinin temel adımlarını göstermek...

Tartışmalar

Meshed-box tabanlı aşılama yöntemimizin diğer aşılama yöntemlerine göre birçok avantajı vardır. İlk olarak, Şekil 5'te gösterildiği gibi, düzgün bir şekilde çalıştırılırsa sporların eşit dağılımını sağlayabilir. İkincisi, ~ 50 μm ağın kullanılması, artı enfekte olmuş yaprakların hafifçe sallanmasıyla sporun yerinden çıkarılması, kaynak bitkilerde bulunan thrips veya diğer bitki enfekte edici böcekler tarafından bitki enfeksiyonunu azaltabili...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48"	Amazon	NA	For making the lid of an inoculation box
#6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts	Home Depot	NA	For making an inoculation chamber
#6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack)	Home Depot	NA	For making an inoculation chamber
#6-32x3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts	Home Depot	NA	For securing  magnet door catch plates
#8-32x1/2" machine screws, flat washers and nuts	Home Depot	NA	For securing corner braces and door hinge
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet;  Size: 17 ½" X 20"	Professional Plastics	SACR.250CEF	For making an inoculation chamber
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20"	Professional Plastics	SACR.250CEF	For making an inoculation chamber
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30"	Professional Plastics	SACR.250CEF	For making an inoculation chamber
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ "	Professional Plastics	SACR.250CEF	For making an inoculation chamber
1-5/8" cabinet door magnetic catch white	Home Depot	Model #P110-W	For making an inoculation chamber
2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack)	Home Depot	Model #13611	For making an inoculation box & chamber
3" Corner Clamp	Harbor Freight Tools	SKU 63653, 1852, 60589	For making inoculation chamber
3/4"  steel zinc plated corner brace (4-Pack)	Home Depot	Model #13542	For making an inoculation box & chamber
4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles	Home Depot	Model #15184	For making an inoculation box
Fine fan-blender brushes	Michaels Store	M10472846	For inoculation
Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel	Home Depot	NA	For making the lid of an inoculation box
Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4');	Home Depot	Model# 1508104	For making an inoculation box
Round glass coverslips with a 500 µm grid	ibidi USA Inc.	10816	For determining  spore density