Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقدم بروتوكولا لتحرير الجينات في الخلايا التائية البشرية الأولية باستخدام تقنية CRISPR Cas لتعديل خلايا CAR-T.

Abstract

وقد أظهرت علاجات الخلايا بالتبني باستخدام مستقبلات مستضد الشميريك الخلايا التائية (CAR-T الخلايا) فعالية سريرية ملحوظة في المرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة الدموية ويجري حاليا التحقيق لمختلف الأورام الصلبة. يتم إنشاء خلايا CAR-T عن طريق إزالة الخلايا التائية من دم المريض وهندستها للتعبير عن مستقبلات المناعة الاصطناعية التي تعيد توجيه الخلايا التائية للتعرف على الخلايا السرطانية المستهدفة والقضاء عليها. تحرير الجينات من خلايا CAR-T لديه القدرة على تحسين سلامة العلاجات الحالية CAR-T الخلية وزيادة فعالية خلايا CAR-T. هنا، ونحن نصف أساليب لتنشيط وتوسيع وتوصيف البشرية CRISPR المهندسة CD19 موجهة CAR-T الخلايا. ويشمل ذلك نقل ناقل مكافحة الأمراض إلى جانب استخدام الحمض النووي الريبي الدليلي الوحيد (sgRNA) وCas9 endonuclease لاستهداف الجينات ذات الأهمية في الخلايا التائية. يمكن تطبيق الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول عالميا على بنيات CAR الأخرى واستهداف الجينات خارج تلك المستخدمة في هذه الدراسة. وعلاوة على ذلك، يناقش هذا البروتوكول استراتيجيات لتصميم الحمض النووي الريبي، واختيار الحمض النووي الريبي الرصاص والتحقق من صحة خروج المغلوب الجينات المستهدفة لتحقيق استنساخ عالية الكفاءة، متعددة كريسبر-Cas9 الهندسة من الدرجة السريرية الخلايا التائية البشرية.

Introduction

أحدث العلاج بالخلايا الشيمية المضادة (CAR) -T ثورة في مجال علاجات الخلايا بالتبني والعلاج المناعي للسرطان. تم تصميم CAR-T-الخلايا التائية التعبير عن مستقبلات المناعة الاصطناعية التي تجمع بين مستضد محددة جزء الأجسام المضادة سلسلة واحدة مع مجالات الإشارات المستمدة من سلسلة TCRzeta والمجالات costimulatory اللازمة وكافية لتنشيط الخلايا التائية والتحفيز المشترك1،2،3،4 . تصنيع خلايا CAR-T يبدأ عن طريق استخراج الخلايا التائية الخاصة بالمريض، تليها تحويل فيروسي ex vivo من وحدة CAR وتوسيع منتج خلية CAR-T مع الخرز المغناطيسي الذي يعمل كمضاد اصطناعي يقدم الخلايا5. يتم إعادة غرس خلايا CAR-T الموسعة في المريض حيث يمكنهم الإصابة ، والقضاء على الخلايا السرطانية المستهدفة وحتى الاستمرار لعدة سنوات بعد التسريب6و7و8. على الرغم من أن العلاج بالخلايا CAR-T قد أدى إلى معدلات استجابة ملحوظة في الأورام الخبيثة B-الخلية, وقد تم تحدي النجاح السريري للأورام الصلبة من قبل عوامل متعددة بما في ذلك ضعف تسلل الخلايا التائية9, وبيئة دقيقة الورم المثبطة للمناعة10,تغطية مستضد وخصوصية, واختتلال وظيفي خلية CAR-T11,12 . وهناك قيد آخر للعلاج الحالي بالخلايا CAR-T يشمل استخدام الخلايا التائية الذاتية. بعد جولات متعددة من العلاج الكيميائي وارتفاع عبء الورم، يمكن أن تكون خلايا CAR-T ذات نوعية رديئة بالمقارنة مع منتجات CAR-T الذاتية من المتبرعين الأصحاء بالإضافة إلى الوقت والنفقات المرتبطة بتصنيع خلايا CAR-T الذاتية. يمثل تحرير الجينات لمنتج خلية CAR-T بواسطة CRISPR/Cas9 استراتيجية جديدة للتغلب على القيود الحالية لخلايا CAR-T13و14و15و16و17.

CRISPR/Cas9 هو نظام مكونين يمكن استخدامه لتحرير الجينوم المستهدف في خلايا الثدييات18،19. يمكن أن تحفز Cas9 المرتبطة ب CRISPR Endonuclease فواصل مزدوجة الخيط الخاصة بالموقع تسترشد بالرناسات الصغيرة من خلال الاقتران الأساسي مع تسلسل الحمض النووي المستهدف20. في حالة عدم وجود قالب إصلاح، يتم إصلاح فواصل مزدوجة حبلا من قبل الخطأ عرضة nonhomologous نهاية الانضمام (NHEJ) المسار، مما أدى إلى الطفرات frameshift أو codons وقف سابق لأوانه من خلال الطفرات الإدراج والحذف (INDELs)19،20،21. الكفاءة وسهولة الاستخدام وفعالية التكلفة والقدرة على تحرير الجينوم متعددة تجعل CRISPR / Cas9 أداة قوية لتعزيز فعالية وسلامة خلايا CAR-T ذاتية التشغيل ومتعددة التجانس. ويمكن أيضا استخدام هذا النهج لتحرير TCR توجيه الخلايا التائية عن طريق استبدال بناء CAR مع TCR. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تولد الخلايا الذاتية CAR-T التي لديها إمكانات محدودة للتسبب في الكسب غير المشروع مقابل المرض المضيف عن طريق تحرير الجينات TCR، b2m، وHLA الموضع.

في هذا البروتوكول، نعرض كيف يمكن الجمع بين هندسة CRISPR للخلايا التائية مع ناقل فيروسي بوساطة تسليم CAR-Transgene لتوليد منتجات خلايا CAR-T المحررة من الجينوم مع تعزيز الفعالية والسلامة. يظهر رسم تخطيطي للعملية بأكملها في الشكل 1. باستخدام هذا النهج، أظهرنا خروج المغلوب الجينات عالية الكفاءة في الخلايا الأساسية CAR-T الإنسان. يصف الشكل 2A بالتفصيل الجدول الزمني لكل خطوة لتحرير وتصنيع الخلايا التائية. كما تتم مناقشة استراتيجيات تصميم الحمض النووي الريبي دليل والتحقق من خروج المغلوب لتطبيق هذا النهج على الجينات المستهدفة المختلفة.

Protocol

تم شراء الخلايا التائية البشرية من خلال جامعة بنسلفانيا نواة المناعة البشرية، التي تعمل بموجب مبادئ الممارسة المختبرية الجيدة مع إجراءات التشغيل القياسية المعمول بها و / أو بروتوكولات لاستلام العينات، وتجهيزها، وتجميدها، وتحليلها وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية MIATA وجامعة بنسلفانيا.

1. إنتاج ناقلات لينتيفيرال

ملاحظة: تم جعل المنتجات الفيروسية النسخ المتماثل المعيبة عن طريق فصل بنيات التعبئة والتغليف (القس، هفوة / بول / RRE، VSVg ونقل البلازميد) إلى أربعة البلازميدات منفصلة، والحد إلى حد كبير من احتمال أحداث إعادة التركيب التي قد تؤدي إلى الفيروس النسخ المتماثل المختصة.

  1. إعداد خلايا HEK293T قبل يوم واحد من العدوى. لوحة ما يقرب من 6 × 106 خلايا في الأوعية الثقافة T150 في 30 مل من وسائل الإعلام الثقافة القياسية (يشار إليها باسم R10: RPMI 1640 تكملها مع 10٪ مصل العجل الجنين، 10 MM HEPES, 1٪ القلم / ستريب, 1٪ L-الجلوتامين) واحتضان بين عشية وضحاها في 37 °C. 18-24 ح في وقت لاحق, يجب أن تكون الخلايا 60-70٪ التقاء وتبدو صحية (التوقعات التشجرية والتوزيع موحدة عبر القارورة). إذا كانت الخلايا تبدو صحية، انتقل إلى الخطوة 1.2.
  2. إعداد مزيج العدوى التي تحتوي على كاشف شفط الدهون (96 ميكرولتر)، pTRP هفوة / بول (لوت # RR13SEP19A) (18 ميكروغرام)، pTRP RSV-Rev (لوت # RR13SEP19B-1 3) (18 ميكروغرام)، pTRP VSVG (لوت # RR13SEP19C) (7 ميكروغرام) plasmids التعبئة والتغليف و 15 ميكروغرام من البلازميد التعبير (CD19bbz scFv المستنسخة في pTRPE).
    1. لكل تفاعل مع العدوى، قم بإعداد أنبوب واحد يحتوي على 1 مل من الحد الأدنى من الوسائط الأساسية منخفضة المصل بالإضافة إلى البلازميدات الأربعة الموصوفة في الخطوة 1.2 بالإضافة إلى أنبوب واحد يحتوي على 2 مل من الحد الأدنى من الوسائط الأساسية منخفضة المصل بالإضافة إلى 90 ميكرولتر من كاشف شفط الدهون. الجمع بين هذين الحلين عن طريق إضافة دروبوايز من مزيج 1 مل بلازميد إلى 2 مل من مزيج كاشف شفط الدهون. تأكد من خلط بقوة الحل عن طريق pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. احتضان الحل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. في غضون ذلك، يستنشق وسائل الإعلام من قارورة الخلية HEK293T وغسل الخلايا بلطف مع 10 مل من وسائل الإعلام الأساسية الحد الأدنى من المصل و أسبيرات مرة أخرى.
    3. أضف بلطف مزيج العدوى (3 مل) من الخطوة 1.2.1 إلى الزاوية السفلية من قارورة ثقافة الخلية باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل. إمالة بلطف قارورة لتوزيع بالتساوي مزيج transfection عبر قارورة ثقافة الخلية واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من عدم إزعاج أحادية الخلية. بعد حضانة لمدة 10 دقائق، أضف 35 مل من وسائط R10 وأرجع القارورة إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة.
  3. بعد 24 ساعة، وجمع supernatant من قوارير ثقافة الخلية HEK293T ونقلها إلى أنابيب مخروطية 50 مل. إضافة R10 جديدة إلى خلايا HEK29T ووضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة لمدة 24 ساعة أخرى. قم بتدبير الناتورنت (300 × ز) لإزالة حطام الخلية وتصفية الناسخ الفائق من خلال فلتر 0.45 ميكرومتر.
  4. ركز الخيوط من الخطوة 1.3 بواسطة جهاز طرد فائق السرعة (25000 × غرام ل 2.5 ساعة أو 8000 × غرام بين عشية وضحاها (O /N)). تخزين 24 ح فيروس بيليه في 4 درجة مئوية في حين تجمع الفيروس 48 ساعة.
  5. كرر الخطوات 1.3-1.4 لجمع 48 ساعة والجمع بين 24 ساعة و 48 ح مجموعات الفيروس. الكريات من جمع 48 ساعة سوف تحتوي على حصاد مجتمعة من الفيروس العدسي.
  6. Resuspend بيليه الفيروسية في ما يقرب من 1 مل من R10 الباردة وaliquot في قارورة 100 ميكرولتر. المفاجئة على الفور تجميد aliquots باستخدام الجليد الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  7. حساب titer الفيروسية وظيفية في وحدات التحويل / مل عن طريق تحويل كمية ثابتة من CD3/CD28 حبة تنشيط الخلايا التائية البشرية الأولية مع المخففات التسلسلية من supernatant العدسية. قياس CAR-النقل بعد 72 ساعة عن طريق قياس التدفق الخلوي.
    1. وصمة عار لCD19 الموجهة CAR مع مضاد لمكافحة FCM63 scFv الأجسام المضادة. لمستقبلات مستضدات الشيمية الأخرى، وصمة عار باستخدام البروتين المؤتلف المسمى بالفلوروفور والمخصفص ب CAR scFv. تخفيف الفيروس الذي يولد أقل من 20٪ خلايا إيجابية CAR عن طريق قياس التدفق الخلوي هو التخفيف الأكثر دقة لحساب التيتر الفيروسي من. فوق 20٪ خلايا إيجابية CAR، تزداد فرصة كل خلية إيجابية ليتم تحويلها مرتين، مما يؤدي إلى التقليل من عدد الجسيمات العابرة. حساب وحدات التحويل لكل مل (TU/mL) = (عدد الخلايا التي تم تحويلها x في المائة خلايا CAR الإيجابية x عامل التخفيف)/(حجم النقل في مل).

2. تصميم SgRNAs وتعطل الجينات في الخلايا التائية البشرية الأولية

  1. تصميم كريسبر SgRNA
    ملاحظة: العديد من الخوادم والبرامج تسهيل تصميم sgRNA الخاصة بالهدف. في هذا البروتوكول، تم تصميم CRISPR SgRNAs باستخدام CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no)، وبوابة تصميم gRNA من معهد برود (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
    1. لكل جين مستهدف، قم بتصميم ستة إلى عشرة تسلسلات SgRNA لاستهداف تسلسلات exon الترميز المبكر.
      ملاحظة: يجب أن يكون SgRNA فعالية عالية على الهدف وانخفاض فعالية الهدف. كل خوارزمية التعلم الآلي لتحديد فعالية SgRNA يعمل بشكل مختلف قليلا. لذلك ، يوصى بمقارنة أدوات تصميم SgRNA المتعددة وتنظيم قائمة من ستة إلى عشرة sgRNA للفحص.
  2. اضطراب الجينات في الخلايا التائية البشرية الأولية
    1. الحصول على خلايا الدم المحيطي أحادية النوى (PBMC) من المتبرعين المتطوعين الأصحاء. ويرد وصف مخططي للبروتوكول في الشكل 2A ويرد وصفه أدناه.
    2. عزل CD4+ و CD8+ تي الخلايا باستخدام CD4 المتاحة تجاريا ومجموعات اختيار CD8.
    3. الجمع بين CD4+ و CD8+ تي الخلايا بنسبة 1:1 واحتضان بين عشية وضحاها في 3x106 خلايا / مل في R10 تكملها مع 5 نانوغرام / مل huIL-7 وهويل-15 لكل منهما. ويوصى بإضافة IL-7 و IL-15 كما هي معروفة لتعزيز النمط الظاهري الذاكرة المركزية وخلايا CAR-T الموسعة مع IL-7 و IL-15 لديها فعالية متفوقة المضادة للورم مقارنة مع IL-2 توسيع CAR-T الخلايا22,23,24.
    4. في اليوم التالي، عد الخلايا التائية والطرد المركزي 5-10 × 106 خلايا في 300 × ز لمدة 5 دقائق. تجاهل كل supernatant وغسل بيليه الخلية في انخفاض المصل الحد الأدنى من وسائل الإعلام الأساسية. Resuspend بيليه في 100 ميكرولتر من محلول النيوكليوفكشن وفقا لتعليمات الشركة المصنعة(جدول المواد).
    5. أثناء غسل الخلايا، قم بإعداد مجمع ريبونوكليوبروتين (RNP) مع Cas9 وgRNA عن طريق احتضان 10 ميكروغرام من نواة Cas9 مع 5 ميكروغرام من sgRNA لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). نسبة الضرس من Cas9 إلى sgRNA هو 1:2.4. ويوصى عنصر تحكم وهمية التي تحتوي على Cas9 ومحسن الكهربائي، ولكن لا sgRNA.
      ملاحظة: يمكن إجراء تحرير الجينات متعددة في هذه الخطوة عن طريق جعل مجمعات RNP لكل هدف على حدة والجمع بينها وبين الخلايا في الوقت nucleofection كما هو موضح في الخطوة التالية. اختيار الكواشف لتجميع مجمع RNP هي المفتاح للحصول على كفاءة KO عالية. على سبيل المثال، النوى Cas9 من مختلف البائعين لها آثار متفاوتة خارج الهدف وgRNA المعدلة كيميائيا تقليل السمية إلى الخلايا التائية، وبالتالي زيادة كفاءة KO.
    6. الجمع بين الخلايا التي أعيد إنفاقها من الخطوة 2.2.4 مع مجمع RNP من الخطوة 2.2.5 وإضافة 4.2 ميكرولتر من 4 ميكرومتر محسنات الإلكتروبوليون (ssDNA oligonucleotide غير متجانسة للجينوم البشري). تخلط جيدا ونقلها إلى cuvettes الكهارل. تجنب الفقاعات لأنها تضعف كفاءة الكهرومporation.
    7. خلايا الكتروبورات باستخدام رمز النبض EH111. بعد الكهرومporation، تكمل الخلايا المحتضنة في R10 5 نانوغرام/مل huIL-7 و huIL-15 عند 5x106 خلايا/مل عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في 12 لوحة بئر. بعد 48 ساعة، والمضي قدما في تفعيل الخلايا التائية والتوسع.

3. ت تنشيط الخلية، تحويل العدسية والتوسع

ملاحظة: لفحص sgRNA، لا يلزم إجراء تحويل العدسي (الخطوة 3.2) من بناء جمهورية أفريقيا الوسطى.

  1. عد الخلايا التائية الكهربية وتمييع إلى تركيز 1 × 106 خلايا / مل باستخدام R10 الدافئة تكملها مع 5 نانوغرام / مل huIL-7 وهويل-15. تنشيط الخلايا عن طريق إضافة المضادة CD3/ANTI-CD28 الأجسام المضادة للخلايا المغلفة الخرز المغناطيسي بنسبة 3 حبات لكل حي تي الخلية.
    ملاحظة: يسبب الإلكتروبوليشن موتا كبيرا للخلايا مما يؤدي إلى ما يقرب من 60٪ ± خلايا قابلة للحياة بنسبة 15٪ مقارنة بالخلايا غير الكهربية. استخدم عدد الخلايا الحية/الميتة لتحديد مقدار الخرز المناسب. نقل الخلايا إلى 37 درجة مئوية واحتضان بين عشية وضحاها.
  2. بعد التحفيز بين عشية وضحاها، محول CRISPR المهندسة الخلايا التائية مع supernatant العدسية من الخطوة 1. أضف الحجم المناسب استنادا إلى التيتر الفيروسي المحسوب في الخطوة 1.7 لتحقيق تعدد العدوى (MOI) من 3 واحتضان الخلايا لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتم إضافة بيليه الفيروس resuspended في R10 ببساطة على رأس الخلايا وفقا لتركيز الخلية، التيتر الفيروسية، و MOI المطلوب.
  3. بعد 72 ساعة، تغذية الخلايا مع 50٪ من حجم الثقافة الحالية R10 تحتوي على 10 نانوغرام / مل huIL-7 وhuIL-15 وإعادتها إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة أخرى. لا تزعج المجموعات التي تشكلت بين الخلايا التائية والخرز.
  4. بعد 48 ساعة، قم بإزالة الخرز من الخلايا عن طريق إعادة تعليق خليط حبة الخلية بلطف يليه الفصل المغناطيسي. عد الخلايا بعد إزالة حبة وجلب إلى تركيز 0.8 × 106 خلايا / مل باستخدام R10 تكملها مع 5 نانوغرام / مل huIL-7 وهويل-15. بعد إزالة الديكور، يجب أن تكون أرقام الخلايا مشابهة لعدد الخلايا في اليوم الأول قبل الإلكتروبوليشن(الشكل 2B).
  5. بعد 24 ساعة، عد الخلايا والأعلاف إلى تركيز 1 × 106 خلايا / مل مع R10 + 5 نانوغرام / مل huIL-7 وhuIL-15. كرر هذا كل 24 ساعة حتى الحركية النمو وحجم الخلية تثبت الخلايا قد استراح من التحفيز.
    ملاحظة: من هذه النقطة، تضاعف الخلايا التائية تقريبا كل 24 ساعة. وعادة ما تخضع الخلية التائية لمضاعفة عدد السكان 5-7 ويكون حجم الخلية حوالي 300 ± 50 fL عند الراحة.
  6. يستريح مرة واحدة، تدور أسفل CRISPR المهندسة CAR-T الخلايا وإعادة الإنفاق في تجميد وسائل الإعلام (1:1 X-فيفو وFBS بالإضافة إلى 10٪ DMSO) لالتبريد. يجب إذابة خلايا CAR-T المستخدمة والراحة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة قبل التجربة.
    ملاحظة: احتفظ بخلايا 10x106 تقريبا محجوزة لقياس كفاءة خروج المغلوب وتكامل CAR. وقد تبين تضاعف عدد السكان المتوقع والتغيرات في الحجم خلال التوسع في الشكل 2B، 2C. بالإضافة إلى ذلك، يظهر الشكل 2D مستويات التعبير CAR على كل من الخلايا موك وجين تحرير CAR-T.

4. كفاءة كريسبر

  1. استخراج الحمض النووي الجينومي وتضخيم الجينات المستهدفة
    1. من كل ثقافة الفحص، تدور أسفل 3-5 × 106 تي الخلايا. يمكن تجميد الخلايا إما كبيليه جاف أو يمكن للمرء المضي قدما في استخراج الحمض النووي الجينومي. في وقت استخراج الحمض النووي، وإعادة إنفاق الكريات في 200 ميكروغرام من الفوسفات العازلة المالحة (PBS) واستخراج الحمض النووي الجينومي من الخلايا الكهربائية باستخدام عدة استخراج الحمض النووي القياسية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      1. لفترة وجيزة، خلايا الليس مع البروتين K وتحميل lysate على عمود ربط الحمض النووي. أثناء الطرد المركزي ، يكون الحمض النووي ملزما للغشاء بينما تمر الملوثات. بعد خطوتين غسل لإزالة الملوثات المتبقية ومثبطات الإنزيم، الحمض النووي elute في الماء.
    2. تضخيم 200-300 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي باستخدام مزيج PCR القياسية التي تحتوي على بوليمرات الحمض النووي، والبروتينات الملحقة، والأملاح، وDNTPs و 10 ميكرومتر إلى الأمام وعكس التمهيديات التي تحيط المنطقة من كسر حبلا مزدوج المقصود.
      ملاحظة: لتصميم التمهيدي PCR، يتم إدخال تسلسل الجينوم المرجعي (يمكن العثور عليها باستخدام http://www.ensemble.org) يحيط موقع قطع gRNA في أداة التفجير التمهيدي NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). يجب تصميم التمهيديات PCR بحيث amplicon لديه حجم الهدف من 600-700bp. يسمح هذا الطول بتصميم التهيئة التسلسلية التي تربط داخل amplicon مع مسافة كافية من موقع قطع gRNA (150 bp على الأقل) لضمان جودة تسلسل جيدة حول Indels Cas9 المستحثة (انظر 4.2.1). كل gRNA يتطلب زوج التمهيدي فريدة من نوعها، ما لم تكن مواقع قطع الجيش الملكي النيبالي على مقربة.
    3. تشغيل المنتج PCR كامل على هلام agarose 1٪ وتنقية amplicon باستخدام معيار agarose هلام تنقية عدة.
      ملاحظة: عملية تحديد TM الأمثل ل PCR يمكن أن يستغرق عدة جولات من استكشاف الأخطاء وإصلاحها. وذلك لأن تسلسل KO يحتوي على indels وينبغي إعداد الجين المستهدف للتسلسل حيث لن يكون هناك indels عادة 100 نقطة أساس المنبع أو المصب من موقع القطع. هذا يمكن أن تختلف على نطاق واسع بسبب indels الناتجة عن الانضمام نهاية غير متجانسة. تصميم التهيئة المتداخلة التسلسل إلى التمهيديات PCR وزيادة تركيز تسلسل المنتج يمكن القضاء على مشاكل مع التسلسل.
  2. التسلسل والكشف عن indel
    1. تصميم تسلسل التمهيديات التي تربط إلى هلام amplicon تنقية وإرسال amplicons وهمية و بالضربة القاضية لتسلسل سانجر. بمجرد اكتمال التسلسل، قم بتحميل ملفات التتبع إلى برنامج علم الوراثة المكتبي (tide.deskgen.com، علم الوراثة المكتبي) لتحليل TIDE.
      1. لتسلسل تصميم التمهيدي، أدخل تسلسل amplicon PCR في برنامج تصميم التمهيدي القياسية (NCBI، Eurofins أو غيرها من الأدوات المتاحة للجمهور). سيقترح برنامج التصميم تسلسلات التمهيدي متعددة مناسبة لتسلسل سانجر.
      2. اختيار التمهيديات إلى الأمام وعكس التي تربط داخل amplicon ما لا يقل عن 150 نقطة أساس المنبع أو المصب من موقع خفض الجيش الملكي النيبالي لضمان جودة تسلسل جيدة حول indels. سيتم استخدام الرسم اللوني للتسلسل في 4.2 لتحليل TIDE ، لذلك من المهم أن تكون جودة التسلسل جيدة للتحلل الدقيق للإندل (انظر Hultquist وآخرون).) 25.
    2. استخدام TIDE (تتبع Indels بواسطة DEcomposition) تحليل للكشف عن ضرب (KO) كفاءة على مستوى الجينوم26. الخوارزمية يعيد بدقة الطيف من indels من تسلسل يتتبع ويحسب R2 القيم، مما يعكس الخير من تناسب بعد النمذجة الخطية غير السلبية من قبل برنامج TIDE.
  3. الكشف عن البروتين المستهدف
    1. بالنسبة للجينات المستهدفة التي يتم التعبير عن منتجها الجيني على سطح الخلايا التائية ، وصمة عار ما يقرب من 1 ×10 5 خلايا من كل ثقافة فحص مع الأجسام المضادة الموسومة بالفلوروشروم محددة للبروتين المستهدف. قارن مستويات التعبير من البروتين المستهدف بين التحكم وهمية ومجموعات خروج المغلوب عن طريق قياس التدفق الخلوي كما هو مبين في الشكل 3A، 3B.
    2. بالنسبة للجينات المستهدفة التي يتم التعبير عن منتجها الجيني داخل الخلايا ، قم بتحلل ما يقرب من 3 × 106 ملايين خلية لكل مجموعة فحص في حاجز التحلل واتبع البروتوكولات القياسية ل SDS-PAGE والنشاف الغربي. بدلا من ذلك، يمكن استخدام قياس التدفق الخلوي السطحي أو داخل الخلايا للتحقيق في البروتين المستهدف.

5. رصد الآثار خارج الهدف باستخدام iGUIDE - إعداد المكتبة، تسلسل الحمض النووي، وتحليل

ملاحظة: تقنية iGUIDE يسمح للكشف عن مواقع تقسيم Cas9 الموجهة وتحديد توزيعات تلك فواصل الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل.

  1. أداء iGUIDE كما وصفها نوبلزوآخرون. وقد أظهرت الآثار خارج الهدف من SGRNA استهداف مكان TRAC باستخدام تقنية iGUIDE في Stadtmauer وآخرون, 202013.

النتائج

نحن نصف هنا بروتوكولا للهندسة الوراثية للخلايا التائية ، التي يمكن استخدامها لتوليد كل من خلايا CAR-T الذاتية واللوججينية ، وكذلك الخلايا التائية المعاد توجيهها TCR.

يقدم الشكل 1 وصفا مفصلا للمراحل التي تنطوي عليها عملية تصنيع الخلايا التائية المحررة من CRISPR. ت?...

Discussion

هنا نصف النهج لتحرير الجينات CAR-T الخلايا باستخدام التكنولوجيا CRISPR Cas9 وتصنيع المنتجات لمزيد من الاختبار لوظيفة وفعالية. تم تحسين البروتوكول أعلاه لأداء تحرير الجينات CRIPSR في الخلايا التائية البشرية الأولية جنبا إلى جنب مع الخلايا التائية الهندسية مع مستقبلات مستضد الشيمي. يسمح هذا البروت?...

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ أي إفصاحات.

Acknowledgements

نحن نعترف بنو المناعة البشرية لتوفير الخلايا التائية المانحة العادية وجوهر قياس التدفق الخلوي في جامعة بنسلفانيا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4D-Nucleofactor Core UnitLonzaAAF-1002B
4D-Nucleofactor X-UnitLonzaAAF-1002X
Accuprime Pfx SupermixThermoFisher12344040
Beckman Optima XPN ultracentrifugeBeckman Coulter
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 AntibodyBiolegend317322Clone OKT3
BV711 Anti-human PD1BiolegendClone EH12.2H7
Cas9-Electroporation enhancersIDT1075915
CD3/CD28 DynabeadsThermoFisher40203D
CD4+ T cell isolation KitStemCell technologies15062
CD8+ T cell isolation KitStemCell technologies15063
Corning 0.45 micron vacuum filter/bottleCorning430768
Corning T150 cell culture flaskMillipore SigmaCLS430825
DMSOMillipore SigmaD2650
DNAeasy Blood and Tissue KitQiagen69504
DynaMag MagnetThermoFisher12321D
Glutamax supplementThermoFisher35050061
HEK293T cellsATCCCRL-3216
HEPES (1 M)ThermoFisher15630080
huIL-15PeproTech200-15
huIL-7PeproTech200-07
Lipofectamine 2000ThermoFisher11668019
Nucleospin Gel and PCR cleanupTakara740609.25
Opti-MEMThermoFisher31985062
P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit LLonzaV4XP-3024
Penicilin-Streptomycin-GlutamineThermoFisher10378016
pTRPE expression Plasmidin house
Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PECytoArt200105
RPMI1640ThermoFisher12633012
sgRNAIDT
Spy Fi Cas9Aldevron9214
Ultracentrifuge tubesBeckman Coulter326823
Viral packaging mixin house
X-Vivo-15 MediaLonzaBE02-060F

References

  1. Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).
  2. Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
  3. Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
  4. Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
  5. Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
  6. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  7. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
  8. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  9. Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
  10. Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
  11. Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
  12. Beatty, G. L., O'Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
  13. Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
  14. MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
  15. Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
  16. Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
  17. Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
  18. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  19. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  20. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  21. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
  22. Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
  23. Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
  24. Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
  25. Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
  26. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

169 CAR T CRISPR Cas9 T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved