Produção de células CAR-T projetadas por CRISPR humanas

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para edição de genes em células T humanas primárias usando a tecnologia CRISPR Cas para modificar células CAR-T.

Resumo

Terapias celulares adotivas usando células T do receptor de antígeno quimérico (células CAR-T) demonstraram notável eficácia clínica em pacientes com malignidades hematológicas e estão atualmente sendo investigadas para vários tumores sólidos. As células CAR-T são geradas removendo células T do sangue de um paciente e projetando-as para expressar um receptor imunológico sintético que redireciona as células T para reconhecer e eliminar células tumorais alvo. A edição de genes das células CAR-T tem o potencial de melhorar a segurança das terapias atuais de células CAR-T e aumentar ainda mais a eficácia das células CAR-T. Aqui, descrevemos métodos para ativação, expansão e caracterização de células CAR-T direcionadas por CRISPR. Isso compreende a transdução do vetor lentiviral CAR e o uso de RNA guia único (sgRNA) e Cas9 endonuclease para atingir genes de interesse em células T. Os métodos descritos neste protocolo podem ser universalmente aplicados a outras construções car e genes-alvo além dos utilizados neste estudo. Além disso, este protocolo discute estratégias para o design de gRNA, seleção de gRNA de chumbo e validação de genes-alvo para alcançar de forma reproduibivelmente alta eficiência, engenharia multiplex CRISPR-Cas9 de células T humanas de grau clínico.

Introdução

A terapia celular quimérico de antígeno (CAR)-T revolucionou o campo das terapias celulares adotivas e da imunoterapia contra o câncer. As células CAR-T são células T projetadas expressando um receptor imunológico sintético que combina um fragmento de anticorpo de cadeia única específico de antígeno com domínios de sinalização derivados da cadeia TCRzeta e domínios costimulatórios necessários e suficientes para ativação e co-estimulação de células T^1,2,3,4 . A fabricação de células CAR-T começa extraindo as próprias células T do paciente, seguida pela transdução viral ex vivo do módulo CAR e expansão do produto celular CAR-T com contas magnéticas que funcionam como antígenos artificiais apresentando células⁵. As células CAR-T expandidas são reinfundidas no paciente onde podem engrafar, eliminar células tumorais alvo e até persistir por vários anos após a infusão^6,7,8. Embora a terapia celular CAR-T tenha resultado em taxas notáveis de resposta em malignidades de células B, o sucesso clínico para tumores sólidos tem sido desafiado por múltiplos fatores, incluindo a má infiltração de células T^9,um microambiente tumoral imunossupressor^10,cobertura e especificidade de antígenos, e disfunção celular CAR-T^11,12 . Outra limitação da terapia celular CAR-T atual inclui o uso de células T autólogas. Após várias rodadas de quimioterapia e alta carga tumoral, as células CAR-T podem ser de má qualidade em comparação com produtos CAR-T aogeneicos de doadores saudáveis, além do tempo e despesas associados à fabricação de células CAR-T autólogas. A edição de genes do produto car-t por CRISPR/Cas9 representa uma nova estratégia para superar as limitações atuais das células CAR-T^{13,14,15,16,17}.

CRISPR/Cas9 é um sistema de dois componentes que pode ser usado para edição de genomas direcionados em células de mamíferos^18,19. O Endonuclease Cas9 associado ao CRISPR pode induzir quebras de dois fios específicas do local guiadas por pequenos RNAs através do emparelhamento de base com a sequência de DNA^{alvo 20}. Na ausência de um modelo de reparo, as quebras de dois fios são reparadas pela via de junção final nonhomologous propensa a erros (NHEJ), resultando em mutações de mudança de quadro ou codons de parada prematura através de mutações de inserção e exclusão (INDELs)^19,20,21. Eficiência, facilidade de uso, custo-efetividade e a capacidade de edição de genoma multiplex fazem do CRISPR/Cas9 uma ferramenta poderosa para aumentar a eficácia e a segurança das células CAR-T autólogas e aogenéticas. Essa abordagem também pode ser usada para editar células T direcionadas tcr substituindo a construção do CAR por um TCR. Além disso, células CAR-T aogenéticas que têm potencial limitado para causar enxerto versus doença hospedeira também podem ser geradas pela edição de genes do lócus TCR, b2m e HLA.

Neste protocolo, mostramos como a engenharia CRISPR de células T pode ser combinada com a entrega mediada por vetores virais do CAR-Transgene para gerar produtos celulares CAR-T editados por genoma com maior eficácia e segurança. Um diagrama esquemático de todo o processo é mostrado na Figura 1. Usando essa abordagem, demonstramos um nocaute genético de alta eficiência nas células CAR-T humanas primárias. A Figura 2A descreve em detalhes a linha do tempo de cada etapa para edição e fabricação de células T. Estratégias para o design de RNA guia e validação de nocaute também são discutidas para aplicar essa abordagem a vários genes-alvo.

Protocolo

As células T humanas foram adquiridas através do Núcleo de Imunologia Humana da Universidade da Pensilvânia, que opera sob princípios de Boas Práticas laboratoriais com procedimentos operacionais padrão estabelecidos e/ou protocolos para recebimento de amostras, processamento, congelamento e análise de acordo com as diretrizes éticas da MIATA e da Universidade da Pensilvânia.

1. Produção de vetores lentiviral

NOTA: Os produtos virais foram transformados com defeito de replicação pela separação de construtos de embalagens (Rev, gag/pol/RRE, VSVg e plasmid de transferência) em quatro plasmídeos separados, reduzindo consideravelmente a probabilidade de eventos de recombinação que podem resultar em vírus competentes para replicação.

1. Prepare as células HEK293T um dia antes da transfecção. Placa aproximadamente 6 x 10⁶ células em vasos de cultura T150 em 30 mL de mídia de cultura padrão (referido como R10:RPMI 1640 complementado com 10% de soro fetal do bezerro, 10 mM HEPES, 1% Pen/Estreptococos, 1% L-glutamina) e incubar durante a noite a 37 °C. 18-24 h depois, as células devem ser 60-70% confluentes e parecem saudáveis (projeções dendríticas e distribuição uniforme em todo o frasco). Se as células parecerem saudáveis, prossigam para o passo 1.2.
2. Prepare a mistura de transfecção contendo reagente de lipofecção (96 μL), gag/pol pTRP (Lote# RR13SEP19A) (18 μg), pTRP RSV-Rev (Lote# RR13SEP19B-3) (18 μg), pTRP VSVG (Lote# RR13SEP19C) (7 μg) plasmídeos de embalagem e 15 μg de plasmídeo de expressão (CD19bbz scFv clonado em pTRPE).
   1. Para cada reação de transfecção, prepare um tubo contendo 1 mL de mídia essencial mínima de soro reduzido mais os quatro plasmídeos descritos na etapa 1.2, bem como um tubo contendo 2 mL de mídia essencial mínima de soro reduzido mais 90 μL de reagente lipofectivo. Combine essas duas soluções pela adição dropwise da mistura de plasmídeos de 1 mL ao mix de reagente de 2 mL de lipofecção. Certifique-se de misturar vigorosamente a solução, pipetting para cima e para baixo várias vezes. Incubar a solução por 15 minutos em temperatura ambiente.
   2. Enquanto isso, aspire a mídia do frasco de células HEK293T e lave suavemente as células com 10 mL de mídia essencial mínima de soro reduzido e aspire novamente.
   3. Adicione suavemente a mistura de transfecção (3 mL) da etapa 1.2.1 ao canto inferior do frasco de cultura celular usando uma pipeta sorológica de 5 mL. Incline suavemente o frasco para distribuir uniformemente a mistura de transfecção através do frasco de cultura celular e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente. Certifique-se de não perturbar a monocamada celular. Após uma incubação de 10 minutos, adicione 35 mL de mídia R10 e devolva o frasco à incubadora por 24 h.
3. Após 24 horas, colete o supernaente dos frascos de cultura celular HEK293T e transfira para tubos cônicos de 50 mL. Adicione R10 fresco às células HEK29T e coloque as células de volta na incubadora por mais 24 h. Gire o supernante (300 x g) para remover detritos celulares e filtrar o sobrenante através de um filtro de 0,45 μm.
4. Concentre o filtrado da etapa 1.3 por ultracentrifugação de alta velocidade (25.000 x g para 2,5 h ou 8000 x g durante a noite (O/N)). Armazene a pelota do vírus 24h a 4 °C enquanto junta o vírus de 48 horas.
5. Repita as etapas 1.3-1.4 para a coleta de 48 horas e combine coletas de vírus de 24h e 48 horas. As pelotas da coleção de 48 h conterão uma colheita combinada do lentivírus.
6. Resuspend pelota viral em aproximadamente 1 mL de R10 frio e alíquota em frascos de 100 μL. Imediatamente encaixe as alíquotas usando gelo seco e armazene a -80 °C.
7. Calcule o títulor viral funcional em unidades transdutoras/mL transduzindo uma quantidade fixa de células T humanas primárias ativadas por contas CD3/CD28 com diluições seriais do supernatante lentiviral. Meça CAR-Transdução após 72 h por citometria de fluxo.
   1. Mancha para o CAR dirigido por CD19 com um anticorpo scFv anti-FCM63. Para outros receptores de antígeno quimérico, colori a mancha usando proteína recombinante rotulada por fluorohore que é específica do CAR scFv. A diluição do vírus que gera menos de 20% de células positivas car por citometria de fluxo é a diluição mais precisa para calcular o título viral. Acima de 20% de células CAR-positivas, a chance de cada célula positiva ser transduzida duas vezes aumenta, resultando em uma subestimação do número de partículas transdutoras. Calcule as unidades transdutoras por mL (TU/mL ) = (número de células transduzidas x por cento CÉLULAS POSITIVAS CAR x fator de diluição)/(volume de transdução em mL).

2. Projetando sgRNAs e interrupção genética em células T humanas primárias

1. Projetando crispr sgRNA's
   NOTA: Vários servidores e programas facilitam o design de sgRNA's específicos para alvos. Neste protocolo, os sgRNAs CRISPR foram projetados usando chopchop (https://chopchop.cbu.uib.no), e o portal de design gRNA do Instituto Broad (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
   1. Para cada gene alvo, projete de seis a dez sequências de sgRNA para direcionar sequências de exon de codificação precoce.
      NOTA: o sgRNA deve ter alta eficácia no alvo e baixa eficácia do alvo. Cada algoritmo de aprendizagem de máquina para determinar a eficácia do sgRNA funciona de forma ligeiramente diferente. Portanto, recomenda-se comparar múltiplas ferramentas de design sgRNA e fazer a curadoria de uma lista de seis a dez sgRNA para triagem.
2. Interrupção genética em células T humanas primárias
   1. Obtenha células mononucleares periféricas autólogas (PBMC's) de doadores voluntários saudáveis. Uma linha do tempo esquemática do protocolo é descrita na Figura 2A e descrita abaixo.
   2. Isole as células CD4⁺ e CD8⁺ T usando kits de seleção CD4 e CD8 disponíveis comercialmente.
   3. Combine células CD4⁺ e CD8⁺ T a uma proporção de 1:1 e incuba durante a noite a 3x10⁶ células/mL em R10 complementadas com 5 ng/mL huIL-7 e huIL-15 cada. A adição de IL-7 e IL-15 é recomendada, pois são conhecidas por promover um fenótipo de memória central e as células CAR-T expandidas com IL-7 e IL-15 têm eficácia tumoral superior em comparação com células CAR-T expandidas IL-2^22,23,24.
   4. No dia seguinte, conte células T e centrífuga 5-10 x 10⁶ células a 300 x g por 5 min. Descarte todo o supernatante e lave a pelota celular em meio essencial mínimo de soro reduzido. Resuspente a pelota em 100 μL de solução de nucleosfeição de acordo com as instruções do fabricante(Tabela de Materiais).
   5. Durante a lavagem das células, prepare o complexo de ribonucleoproteína (RNP) com Cas9 e gRNA incubando 10 μg de nuclease Cas9 com 5 μg de sgRNA por 10 minutos à temperatura ambiente (RT). A relação molar de Cas9 para sgRNA é de 1:2.4. Um controle simulado que contém Cas9 e melhorador de eletroporação, mas nenhum sgRNA, é recomendado.
      NOTA: A edição de genes multiplex pode ser realizada nesta etapa, fazendo complexos RNP para cada alvo separadamente e combinando-os com células no momento da nucleofecção, conforme descrito na etapa seguinte. Escolher os reagentes para montar o complexo RNP é fundamental para obter alta eficiência ko. Por exemplo, os núcleos Cas9 de diferentes fornecedores têm efeitos fora do alvo variados e gRNA quimicamente modificados diminuem a toxicidade para as células T, aumentando assim a eficiência do KO.
   6. Combine as células resuspended da etapa 2.2.4 com o complexo RNP a partir da etapa 2.2.5 e adicione 4,2 μL de melhorador de eletroporação de 4 μM (oligonucleotídeo ssDNA que não é homólogo ao genoma humano). Misture bem e transfira para cuvetas de eletroporação. Evite bolhas, pois prejudicam a eficiência da eletroporação.
   7. Células eletroporadas usando código de pulso EH111. Após a eletroporação, incubar células em R10 complementadas com 5 ng/mL huIL-7 e huIL-15 a 5x10⁶ células/mL a 30 °C para 48 h em placas de 12 poços. Após 48 h, proceda com ativação e expansão de células T.

3. Ativação celular T, transdução lentiviral e expansão

NOTA: Para a triagem do SGRNA's, a transdução lentiviral (Etapa 3.2) da construção do CAR não é necessária.

1. Conte células T eletroporadas e diluir a uma concentração de 1 x 10⁶ células/mL usando R10 quente suplementado com 5 ng/mL huIL-7 e huIL-15. Ative as células adicionando contas magnéticas monoclonais anti-CD3/anti-CD28 revestidas de contas magnéticas a uma proporção de 3 contas por célula T viva.
   NOTA: A eletroporação causa morte celular significativa, resultando em cerca de 60% ± 15% de células viáveis em comparação com células não eletroporadas. Use uma contagem de células vivas/mortas para determinar a quantidade apropriada de contas. Transfira as células para 37 °C e incubar durante a noite.
2. Após a estimulação durante a noite, transduem células T projetadas pelo CRISPR com supernatante lentiviral a partir do passo 1. Adicione o volume apropriado com base no título viral calculado na etapa 1.7 para alcançar uma multiplicidade de infecção (MOI) de 3 e incubar células por 72 h a 37 °C.
   NOTA: A pelota do vírus resuspendida em R10 é simplesmente adicionada em cima das células de acordo com a concentração celular, o título viral e o MOI desejado.
3. Após 72 h, alimentar células com 50% do volume de cultura atual R10 contendo 10 ng/mL huIL-7 e huIL-15 e devolvê-las à incubadora por mais 48 h. Não perturbe os aglomerados que se formaram entre as células T e as contas.
4. Após 48 h, remova as contas das células, reutilizando suavemente a mistura celular-contas seguida de separação magnética. Conte as células após a remoção das contas e leve a uma concentração de 0,8 x 10⁶ células/mL usando R10 suplementado com 5 ng/mL huIL-7 e huIL-15. Após a desescrição, os números de células devem ser semelhantes à contagem celular no dia 1 anterior à eletroporação(Figura 2B).
5. Após 24 h, conte células e alimente uma concentração de 1 x 10⁶ células/mL com R10 + 5 ng/mL huIL-7 e huIL-15. Repita isso a cada 24 horas até que a cinética de crescimento e o tamanho das células demonstrem que as células descansaram da estimulação.
   NOTA: A partir deste ponto, as células T dobram aproximadamente a cada 24h. As células T geralmente sofrem duplicações populacionais de 5 a 7 e têm um volume celular de aproximadamente 300 ± 50 fL quando descansadas.
6. Uma vez descansado, gire as células CAR-T projetadas pelo CRISPR e resuspende em mídia congelada (1:1 X-Vivo e FBS mais 10% DMSO) para criopreservação. As células CAR-T utilizadas devem ser descongeladas e descansadas a 37 °C durante 16 horas antes de um experimento.
   NOTA: Mantenha aproximadamente 10x10⁶ células reservadas para medir a eficiência do nocaute e a integração do CAR. As duplicações populacionais esperadas e as mudanças de volume durante a expansão foram mostradas na Figura 2B,2C. Além disso, a Figura 2D mostra níveis de expressão CAR em células CAR-T editadas por genes e genes.

4. Eficiência CRISPR

1. Extração genômica de DNA e amplificação genética alvo
   1. A partir de cada cultura de triagem, gire para baixo 3-5 x 10⁶ células T. As células podem ser congeladas como uma pelota seca ou pode-se prosseguir com a extração genômica de DNA. No momento da extração do DNA, resuspend pelotas em 200 μL de Salina Tampão fosfato (PBS) e extrato de DNA genômico de células eletroporadas usando um kit padrão de extração de DNA de acordo com a instrução do fabricante.
      1. Resumidamente, células de lise com proteinase K e carregam lysate em uma coluna de ligação de DNA. Durante a centrifugação, o DNA está ligado à membrana enquanto os contaminantes passam. Depois de duas etapas de lavagem para remover contaminantes restantes e inibidores de enzimas, elute DNA na água.
   2. Amplie 200-300 ng de DNA genômico usando mistura pcr padrão contendo polimerase de DNA, proteínas acessórias, sais e dNTPs e primers 10 μM para frente e reverso flanqueando a região do rompimento de dois fios pretendido.
      NOTA: Para o design da cartilha PCR, a sequência genômica de referência (pode ser encontrada usando http://www.ensemble.org) flanqueando o local de corte de gRNA são inseridos na ferramenta de explosão do primer NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). Os primers PCR devem ser projetados de tal forma que o amplicon tenha um tamanho de alvo de 600-700bp. Este comprimento permite projetar primers de sequenciamento que se ligam dentro do amplicon com distância suficiente do local de corte de gRNA (pelo menos 150 bp) para garantir uma boa qualidade de sequenciamento em torno dos indelos induzidos cas9 (ver 4.2.1). Cada gRNA requer um par de primer único, a menos que os locais de corte de gRNA estejam próximos.
   3. Execute todo o produto PCR em um gel de 1% de agarose e purifique o amplicon usando um kit padrão de purificação de gel agarose.
      NOTA: O processo de determinação do Tm ideal para PCR pode levar várias rodadas de solução de problemas. Isso ocorre porque a sequência ko tem indels e o gene alvo deve ser preparado para sequenciamento onde não haveria indels geralmente 100 bp upstream ou downstream do local cortado. Isso pode variar muito devido aos indels resultantes da adesão final não homólogo. Projetar primers de sequenciamento aninhados para os primers PCR e aumentar a concentração de sequenciados do produto pode eliminar problemas com sequenciamento.
2. Sequenciamento e detecção indel
   1. Projete primers de sequenciamento que se ligam ao amplificador purificado de gel e envie amplificadores simulados e eliminatórios para sequenciamento Sanger. Uma vez que o sequenciamento esteja concluído, carregue os arquivos de rastreamento para o software Desktop Genetics (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) para análise de TIDE.
      1. Para sequenciar o design da primer, digite a sequência da amplicon PCR em um software de design primer padrão (NCBI, Eurofins ou outras ferramentas disponíveis publicamente). O software de design sugerirá várias sequências de primer adequadas para sequenciamento de sanger.
      2. Escolha primers para a frente e para trás que se ligam dentro do amplicon pelo menos 150 bp upstream ou downstream do local de corte gRNA para garantir uma boa qualidade de sequenciamento em torno dos indels. O cromatógrafo sequenciamento será usado em 4.2 para análise de MARÉ, portanto é importante que a qualidade do sequenciamento seja boa para a decomposição indeléfera precisa (ver Hultquist et al.) ²⁵.
   2. Use a análise TIDE (Tracking of Indels by DEcomposition) para detectar a eficiência do knock out (KO) no nível genômico²⁶. O algoritmo reconstrói com precisão o espectro de indels a partir dos traços de sequência e calcula os valores de R^2, refletindo a bondade do ajuste após a modelagem linear não negativa pelo software TIDE.
3. Detecção de proteínas-alvo
   1. Para genes-alvo cujo produto genético é expresso na superfície das células T, colora aproximadamente 1 x 10⁵ células de cada cultura de triagem com um anticorpo marcado fluorocromo específico para a proteína alvo. Compare os níveis de expressão da proteína alvo entre o controle simulado e os grupos eliminatórios por citometria de fluxo, como mostrado na Figura 3A,3B.
   2. Para genes-alvo cujo produto genético é expresso intracelularmente, lise aproximadamente 3 x 10⁶ milhões de células por grupo de triagem em tampão de lise e siga protocolos padrão para SDS-PAGE e mancha ocidental. Alternativamente, a flutometria de fluxo superficial ou intracelular pode ser usada para sondar a proteína alvo.

5. Monitoramento de efeitos fora do alvo usando iGUIDE - Preparação da biblioteca, sequenciamento de DNA e análise

NOTA: a técnica iGUIDE permite a detecção de locais de decote guiado Cas9 e quantificar as distribuições dessas quebras duplas de DNA.

1. Realize iGUIDE como descrito por Nobles et al.²¹. Os efeitos fora do alvo do sgRNA visando o lócus TRAC usando a técnica iGUIDE foram mostrados em Stadtmauer et al, 2020¹³.

Resultados

Descrevemos aqui um protocolo para criar geneticamente células T, que podem ser usadas para gerar células CAR-T autólogas e aogenéricas, bem como células T redirecionadas T.

A Figura 1 fornece uma descrição detalhada das etapas envolvidas no processo de fabricação de células T editadas pelo CRISPR. O processo começa projetando sgRNA para o gene de interesse. Uma vez que o sgRNA é projetado e sintetizado, eles são então usados para fazer complexos RNP...

Discussão

Aqui descrevemos abordagens para editar células CAR-T de genes usando a tecnologia CRISPR Cas9 e fabricar produtos para testar melhor a função e eficácia. O protocolo acima foi otimizado para a realização da edição de genes CRIPSR em células T humanas primárias combinadas com células T de engenharia com receptores de antígeno quimérico. Este protocolo permite alta eficiência de nocaute com variabilidade mínima de doador para doador. A modificação usando CRISPR pode melhorar tanto a eficácia quanto a seg...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4D-Nucleofactor Core Unit	Lonza	AAF-1002B
4D-Nucleofactor X-Unit	Lonza	AAF-1002X
Accuprime Pfx Supermix	ThermoFisher	12344040
Beckman Optima XPN ultracentrifuge	Beckman Coulter
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody	Biolegend	317322	Clone OKT3
BV711 Anti-human PD1	Biolegend		Clone EH12.2H7
Cas9-Electroporation enhancers	IDT	1075915
CD3/CD28 Dynabeads	ThermoFisher	40203D
CD4+ T cell isolation Kit	StemCell technologies	15062
CD8+ T cell isolation Kit	StemCell technologies	15063
Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle	Corning	430768
Corning T150 cell culture flask	Millipore Sigma	CLS430825
DMSO	Millipore Sigma	D2650
DNAeasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69504
DynaMag Magnet	ThermoFisher	12321D
Glutamax supplement	ThermoFisher	35050061
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
HEPES (1 M)	ThermoFisher	15630080
huIL-15	PeproTech	200-15
huIL-7	PeproTech	200-07
Lipofectamine 2000	ThermoFisher	11668019
Nucleospin Gel and PCR cleanup	Takara	740609.25
Opti-MEM	ThermoFisher	31985062
P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L	Lonza	V4XP-3024
Penicilin-Streptomycin-Glutamine	ThermoFisher	10378016
pTRPE expression Plasmid	in house
Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE	CytoArt	200105
RPMI1640	ThermoFisher	12633012
sgRNA	IDT
Spy Fi Cas9	Aldevron	9214
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	326823
Viral packaging mix	in house
X-Vivo-15 Media	Lonza	BE02-060F