Production de cellules CAR-T humaines conçues par CRISPR

Résumé

Nous présentons ici un protocole d’édition de gènes dans les cellules T humaines primaires utilisant la technologie CRISPR Cas pour modifier les cellules CAR-T.

Résumé

Les thérapies cellulaires adoptives utilisant des cellules T réceptrices de l’antigène chimérique (cellules CAR-T) ont démontré une efficacité clinique remarquable chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques et sont actuellement à l’étude pour diverses tumeurs solides. Les cellules CAR-T sont générées en retirant les cellules T du sang d’un patient et en les modifiant pour exprimer un récepteur immunitaire synthétique qui redirige les cellules T pour reconnaître et éliminer les cellules tumorales cibles. L’édition génique des cellules CAR-T a le potentiel d’améliorer l’innocuité des thérapies cellulaires CAR-T actuelles et d’augmenter encore l’efficacité des cellules CAR-T. Ici, nous décrivons les méthodes d’activation, d’expansion et de caractérisation des cellules CAR-T dirigées CD19 conçues par CRISPR chez l’homme. Cela comprend la transduction du vecteur lentiviral CAR et l’utilisation de l’ARN guide unique (SGRNA) et de l’endonucléase Cas9 pour cibler les gènes d’intérêt dans les cellules T. Les méthodes décrites dans ce protocole peuvent être universellement appliquées à d’autres constructions CAR et gènes cibles au-delà de ceux utilisés pour cette étude. En outre, ce protocole traite des stratégies de conception de l’ARNg, de la sélection de l’ARNg principal et de la validation de l’élimination du gène cible afin d’obtenir de manière reproductible une ingénierie CRISPR-Cas9 multiplexe à haute efficacité de cellules T humaines de qualité clinique.

Introduction

La thérapie cellulaire par récepteur de l’antigène chimérique (CAR)-T a révolutionné le domaine des thérapies cellulaires adoptives et de l’immunothérapie du cancer. Les cellules CAR-T sont des cellules T modifiées exprimant un récepteur immunitaire synthétique qui combine un fragment d’anticorps à chaîne unique spécifique à l’antigène avec des domaines de signalisation dérivés de la chaîne TCRzeta et des domaines costimulatoires nécessaires et suffisants pour l’activation et la co-stimulation des lymphocytes T^1,2,3,4 . La fabrication de cel....

Protocole

Les lymphocytes T humains ont été obtenus par l’intermédiaire du noyau d’immunologie humaine de l’Université de Pennsylvanie, qui fonctionne selon les principes des bonnes pratiques de laboratoire avec des procédures opérationnelles standard établies et / ou des protocoles pour la réception, le traitement, la congélation et l’analyse des échantillons conformément aux directives éthiques de la MIATA et de l’Université de Pennsylvanie.

1. Production de vecteurs lentiviraux

REMARQUE: Les produits viraux ont été rendus défectueux de réplication par séparation des constructions d’emballage (Rev, gag / pol / RRE, VSVg et....

Résultats

Nous décrivons ici un protocole de génie génétique des lymphocytes T, qui peut être utilisé pour générer à la fois des cellules CAR-T autologues et allogéniques, ainsi que des cellules T redirigées par TCR.

La figure 1 fournit une description détaillée des étapes impliquées dans le processus de fabrication des lymphocytes T édités par CRISPR. Le processus commence par la conception de l’ARNg pour le gène d’intérêt. Une fois que les sgRNA so.......

Discussion

Nous décrivons ici des approches pour modifier les gènes des cellules CAR-T à l’aide de la technologie CRISPR Cas9 et fabriquons des produits pour tester davantage la fonction et l’efficacité. Le protocole ci-dessus a été optimisé pour effectuer l’édition de gènes CRIPSR dans des cellules T humaines primaires combinées à des cellules T d’ingénierie avec des récepteurs d’antigènes chimériques. Ce protocole permet une efficacité élevée de knockout avec une variabilité minimale de donneur à don.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4D-Nucleofactor Core Unit	Lonza	AAF-1002B
4D-Nucleofactor X-Unit	Lonza	AAF-1002X
Accuprime Pfx Supermix	ThermoFisher	12344040
Beckman Optima XPN ultracentrifuge	Beckman Coulter
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody	Biolegend	317322	Clone OKT3
BV711 Anti-human PD1	Biolegend		Clone EH12.2H7
Cas9-Electroporation enhancers	IDT	1075915
CD3/CD28 Dynabeads	ThermoFisher	40203D
CD4+ T cell isolation Kit	StemCell technologies	15062
CD8+ T cell isolation Kit	StemCell technologies	15063
Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle	Corning	430768
Corning T150 cell culture flask	Millipore Sigma	CLS430825
DMSO	Millipore Sigma	D2650
DNAeasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69504
DynaMag Magnet	ThermoFisher	12321D
Glutamax supplement	ThermoFisher	35050061
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
HEPES (1 M)	ThermoFisher	15630080
huIL-15	PeproTech	200-15
huIL-7	PeproTech	200-07
Lipofectamine 2000	ThermoFisher	11668019
Nucleospin Gel and PCR cleanup	Takara	740609.25
Opti-MEM	ThermoFisher	31985062
P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L	Lonza	V4XP-3024
Penicilin-Streptomycin-Glutamine	ThermoFisher	10378016
pTRPE expression Plasmid	in house
Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE	CytoArt	200105
RPMI1640	ThermoFisher	12633012
sgRNA	IDT
Spy Fi Cas9	Aldevron	9214
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	326823
Viral packaging mix	in house
X-Vivo-15 Media	Lonza	BE02-060F