JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الإشريكية القولونية هي السبب الرئيسي لالتهاب السحايا البكتيري السلبي للغرام الوليدي. خلال العدوى البكتيرية ، تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية التي تنتجها العدلات دورا كبيرا في مبيد الجراثيم. هنا نقدم طريقة للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية في العدلات استجابة لالتهاب السحايا E. coli.

Abstract

الإشريكية القولونية (الإشريكية القولونية)هي البكتيريا الأكثر شيوعا سلبية الغرام المسببة لالتهاب السحايا الوليدي. حدوث البكتيريا والاختراق البكتيري من خلال حاجز الدم في الدماغ هي خطوات لا غنى عنها لتطوير التهاب السحايا الإشريكية القولونية. تمثل أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) آليات مبيدات الجراثيم الرئيسية للعدلات لتدمير مسببات الأمراض الغازية. في هذا البروتوكول، تم قياس إنتاج ROS داخل الخلايا المعتمد على الوقت في العدلات المصابة بالإشريكية القولونية السحائية باستخدام مسابير ROS الفلورية التي تم اكتشافها من قبل قارئ اللوحة الدقيقة الفلورية في الوقت الحقيقي. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على تقييم إنتاج ROS في خلايا الثدييات أثناء التفاعلات بين مسببات الأمراض والمضيف.

Introduction

التهاب السحايا البكتيري الوليدي هو مرض معد شائع لدى الأطفال. الإشريكية القولونية (الإشريكية القولونية)مع كبسولة K1 هو الممرض الأكثر شيوعا سلبية الغرام مما تسبب في التهاب السحايا البكتيري الوليدي، وهو ما يمثل حوالي 80٪ من إجمالي الإصابة1،2،3. على الرغم من التقدم في العلاج الكيميائي المضاد للميكروبات والرعاية الداعمة ، لا يزال التهاب السحايا البكتيري واحدا من أكثر الحالات تدميرا مع ارتفاع المراضة والوفيات4.

يحدث التهاب السحايا البكتيري الوليدي عادة ما يبدأ مع البكتيريا الناجمة عن دخول البكتيريا المسببة للأمراض في الدورة الدموية الطرفية من الآفات المحلية للمواليد الجدد ، تليها اختراق من خلال حاجز الدم في الدماغ (BBB) في الدماغ ، مما يؤدي إلى التهاب السحايا4. بداية البكتيريا يعتمد على التفاعل بين البكتيريا والخلايا المناعية المضيفة بما في ذلك العدلات وال الضامة، الخ. العدلات، والتي تمثل ~ 50-70٪ من خلايا الدم البيضاء، هي خط الدفاع الأول ضد العدوى البكتيرية5،6. خلال غزو البكتيريا ، يتم تجنيد العدلات المنشطة إلى المواقع المعدية وإطلاق أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) بما في ذلك أيون أكسيد فائق ، بيروكسيد الهيدروجين ، الجذور الهيدروكسيل ، والأوكسجين الفردي7. يخضع ROS لتفاعلات الأكسدة مع غشاء الخلية وجزيئات الحمض النووي وبروتينات البكتيريا ، مما يؤدي إلى إصابة ووفاة البكتيريا الغازية8. الميتوكوندريا هو الموقع الرئيسي لإنتاج ROS في الخلايا eukaryotic، ومختلف oxidases (على سبيل المثال، نيكوتيناميد أدينين دينوكليوتيد فوسفات (NADPH) مجمع أوكسيداز، نظام ليبوكسيجيناز، بروتين كيناز C ونظام سيكلوكسيجيناز) التوسط في إنتاج ROS9،10. يعد القياس في الوقت الفعلي لإنتاج ROS ، الذي يمثل الآلية الأساسية المضادة للميكروبات في العدلات ، طريقة مفيدة لدراسة دفاع المضيف أثناء التفاعل بين البكتيريا والمضيف.

في هذا البروتوكول، تم قياس إنتاج ROS المعتمد على الوقت في العدلات المصابة بالإشريكية القولونية السحائية كميا مع مسبار ROS الفلوري DHE، الذي تم اكتشافه من قبل قارئ اللوحة الدقيقة الفلورية في الوقت الحقيقي. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على تقييم إنتاج ROS في خلايا الثدييات الأخرى أثناء التفاعل بين العامل الممرض والمضيف.

Protocol

تمت الموافقة على الدم المحيطي من المتطوعين المطبقين في هذا البحث من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لأول مستشفى في الجامعة الطبية الصينية (#2020-2020-237-2).

1. إعداد الكواشف والثقافة المتوسطة

  1. إعداد العازلة تحلل خلايا الدم الحمراء عن طريق إضافة 8.29 غرام من NH4Cl, 1 غرام من KHCO3, 37.2 ملغ من Na2EDTA إلى 1 لتر من الماء المقطر المزدوج وضبط درجة الحموضة إلى 7.2-7.4. إزالة البكتيريا عن طريق الترشيح باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر.
  2. إعداد المتوسطة الثقافة التجريبية ل العدلات بإضافة 5٪ مصل البقر الجنين إلى RPMI 1640 المتوسطة وتخزينها في 4 درجة مئوية. توازن إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
    ملاحظة: استخدم متوسط RPMI 1640 بدون أحمر الفينول.
  3. إعداد الفوسفات العازلة المالحة (PBS) عن طريق إضافة 8 غرام من NaCl، 0.2 غرام من KCl، 1.44 غرام من Na2HPO4· 2H2O و 0.2 غرام من KH2PO4 إلى 1 لتر من الماء المقطر المزدوج في قارورة زجاجية 1 لتر. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2-7.4. أوتوكلاف لمدة 15 دقيقة في 121 درجة مئوية.
  4. إعداد محلول ريفامبيسين عن طريق حل 0.5 غرام من مسحوق ريفامبيسين في 10 مل من ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO) لتسفر عن محلول ريفامبيسين 50 ملغ / مل.
  5. إعداد LB أجار الحل بإضافة 10 غرام من NaCl، 10 غرام من تريبتون، 5 غرام من استخراج الخميرة و 15 غرام من مسحوق أجار في 1 لتر من الماء المقطر المزدوج وautclave الخليط. ملء أطباق بيتري إلى نصف حجم عن طريق صب الحارة LB أجار الحل التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل ريفامبيسين. قم بتخزين اللوحة الصلبة المبردة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  6. إعداد الدماغ ضخ القلب (BHI) مرق مناسبة للسلالات البكتيرية عن طريق حل 37 غرام من مسحوق BHI في 1 لتر من الماء المقطر مزدوجة. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 وautclave ذلك.
  7. حل مسبار الفلورسنت ديهيدرويثيديوم (DHE) في المذيبات DMSO لتسفر عن محلول مخزون 10 mM. تخلط بلطف قبل الاستخدام.
    ملاحظة: Aliquot حل الأسهم فورا في قوارير واقية من الضوء. العمر الافتراضي لحل المخزون هو 6 أشهر عند -20 درجة مئوية.

2. إعداد سلالة البكتيريا E44

ملاحظة: E44 هو سلالة متحولة من الإشريكية القولونية السحائي مع مقاومة ريفامبيسين.

  1. تراجع مستعمرة E44 cryopreserved مع طرف ماصة معقمة، تلقيح سلالة E44 على لوحة أجار LB التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل ريفامبيسين عن طريق رسم خطوط. ضع اللوحة رأسا على عقب في الحاضنة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  2. قبل يوم واحد من التجربة ، اختر مستعمرة E44 واحدة من اللوحة مع طرف ماصة معقم ووضعها في 5 مل من مرق BHI الذي يحتوي على 100 ميكروغرام / مل ريفامبيسين في قارورة 50 مل. احتضان الثقافة البكتيرية في 37 درجة مئوية مع 90 دورة في الدقيقة لمدة 17 ساعة في شاكر الحضانة.

3. عزل العدلات من الدم المحيطي البشري

  1. رسم 5 مل من عينة الدم من المتطوعين عن طريق الوريد إلى أنبوب جمع الدم فراغ التي تحتوي على EDTA لمكافحة التخثر.
  2. الطرد المركزي عينات الدم المحيطي في 500 x ز لمدة 5 دقائق. وتنقسم عينات الدم إلى ثلاث طبقات عن طريق الطرد المركزي، والتي من أسفل إلى أعلى هي طبقة خلايا الدم الحمراء (RBC)، وطبقة خلايا الدم البيضاء (WBC) وطبقة البلازما، على التوالي.
  3. يستنشق طبقة خلايا الدم البيضاء مع ماصة إلى أنبوب جديد مع 3x RBC تحلل العازلة. يمزج الخليط جيدا ويوضع في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  4. الطرد المركزي الأنبوب في 500 × ز لمدة 5 دقائق. يستنشق supernatant تماما وتجاهل.
    1. كرر إجراء التحلل مع مخزن تحلل RBC المؤقت 1-2 مرات ، حتى يتحول الراسب إلى اللون الأبيض.
  5. غسل الخلايا عن طريق إعادة تعليق عجل مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. ثم الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق للسماح للخلايا يستقر إلى أسفل الأنبوب.
  6. تسمية العدلات مع الميكروبات CD16 عن طريق إعادة تعليق الرواسب مع 50 ميكروغرام من العازلة فرز الخلايا المغناطيسية المبردة مسبقا. ثم تخلط مع 50 ميكرولتر من الميكروبات CD16 الإنسان بدقة. احتضان الخليط في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: يجب تبريد الحلول مسبقا لمنع وضع حد أقصى للأجسام المضادة على سطح الخلية ووضع علامات غير محددة. معظم البالغين لديهم حوالي 4000 إلى 10000 خلية دم بيضاء لكل ميكرولتر من الدم ، من بينها العدلات تمثل ما يقرب من 50-70 ٪. حسب التقدير ، فإن عدد خلايا الدم البيضاء الإجمالية في 5 مل من الدم المحيطي البشري عادة ما يصل إلى 2-5 × 107.
  7. غسل الخلايا بإضافة 2 مل من العازلة فرز الخلايا المغناطيسية والطرد المركزي في 4 درجة مئوية، 300 × ز لمدة 10 دقيقة. تجاهل supernatant تماما وإعادة إنفاق الراسب مع 500 ميكرولتر من الفرز العازلة.
  8. تجميع العمود المغناطيسي وفصل الرف. نقل الفاصل إلى الرف مع العمود المغناطيسي وشطف العمود مع 3 مل من المخزن المؤقت الفرز.
  9. إسقاط تعليق الخلية في العمود للسماح العدلات المسمى من قبل الخرز المغناطيسي لإرفاق العمود المغناطيسي.
  10. اغسل الخلايا غير المسماة بإضافة 3 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المغناطيسية 3 مرات، مع التأكد من أن خزان العمود فارغ في كل مرة.
  11. قم بإزالة العمود من الفاصل المغناطيسي وضعه على أنبوب 15 مل. إضافة 5 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المغناطيسية إلى العمود. دفع خارج الخلايا المسماة المغناطيسي باستخدام المكبس.
    ملاحظة: لتحسين نقاء العدلات، قد تتكرر خطوات الفرز باستخدام عمود جديد.
  12. الطرد المركزي الأنبوب في 300 × ز لمدة 5 دقائق، والتخلص من supernatant تماما وإعادة إنفاق عجل مع 1 مل من الثقافة المتوسطة. تحديد رقم الخلية باستخدام عداد الخلية وإعداد الخلايا لإجراء المزيد من التجارب.

4. قياس روس

  1. الطرد المركزي العدلات المعزولة في 300 × ز لمدة 5 دقائق، resuspend المرسب، وضبط تركيز الخلية إلى 2 × 106/ مل مع وسيطة الثقافة التي تحتوي على 5 ميكرومتر DHE مضان التحقيق.
  2. احتضان العدلات في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتحميل مسبار DHE، ومن ثم تخصيص تعليق الخلية إلى لوحة صغيرة البوليسترين الأسود 96 جيدا مع 200 ميكرولتر لكل بئر.
  3. قم بتشغيل قارئ اللوحة الدقيقة وفتح برنامج الكشف. اختر تنسيق لوحة 96 بئرا معتما وحدد منطقة القراءة.
    1. ضبط الفلورسينس (Ex/Em = 518/605 نانومتر) في الوضع الحركي كل 5 دقائق لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تأكد من هز اللوحة لمدة 3 ق قبل كل قراءة.
  4. إخراج لوحة صغيرة من الحاضنة، إضافة E44 المستزرعة (MOI = 100) أو phorbol 12-myristate 13-خلات (PMA) (100 نانوغرام / مل) إلى كل بئر تحتوي على العدلات المحملة مسبقا مع 3 يكرر. استخدم سلطة النقد الفلسطينية كعنصر تحكم إيجابي.
  5. ضع اللوحة في قارئ اللوحة الدقيقة وابدأ الفحص على الفور.

النتائج

باستخدام البروتوكول المبين في هذه المقالة، تم عزل العدلات من الدم المحيطي البشري وتحميلها مع مسبار مضان DHE للكشف عن التغيرات في مستويات ROS استجابة للعدوى E44. هنا ، نقدم بيانات تمثيلية توضح إنتاج ROS الذي أثارته سلالة E44 التي يحددها قارئ microplate في الوقت الفعلي. بإضافة سلالات E44 في وزارة الداخلي?...

Discussion

العدلات بمثابة العنصر الأكثر وفرة من خلايا الدم البيضاء في الدورة الدموية البشرية. فهي خلايا تأثير هامة في الجهاز المناعي البشري الفطري ، الذي يبني خط الدفاع الأول ضد غزو مسببات الأمراض11. جيل ROS يمثل واحدة من آليات مبيدات الجراثيم الرئيسية من العدلات بعد البلعومة11

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة أو أي تضارب آخر في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31670845، 31870832، 32000811) وبرنامج الأستاذ المتميز في مقاطعة لياونينغ (LJH2018-35).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL polypropylene conical centrifuge tubesKIRGENKG2611
96-well plateCorning3025
AgarDINGGUODH010-1.1
Autuomated cell counterBio-rad508BR03397
Biological Safety CarbinetShanghai LishenHfsafe-1200Lcb2
Brain heart infusionBD237500
CD16 Microbeads, humanMiltenyi Biotec130-045-701
CentrifugeChangsha XiangyiTDZ5-WS
ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
Dihydroethidium (DHE)MedChemExpress104821-25-2
Fetal bovine serumCellmaxSA211.02
IncubatorHeraeusHera Cell
MACS separation bufferMiltenyi Biotec130-091-221
Microplate ReaderMolecular DevicesSpectraMax M5
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)BeyoitmeS1819-1mg
QuadroMACS separation UnitMiltenyi Biotec130-090-976
RifampicinSolarbio13292-46-1
RPMI1640 mediumSangon BiotechE600027-0500
Thermostatic shakerShanghai ZhichengZWY-100D
TryptonOXOIDLP0042
Yeast extractOXOIDLP0021

References

  1. Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
  2. Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
  3. Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
  4. Kim, K. S. Human Meningitis-Associated Escherichia coli. EcoSal Plus. 7 (1), (2016).
  5. Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
  6. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  7. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
  8. Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
  9. Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
  10. Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
  11. Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
  12. Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
  13. Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
  14. Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
  15. Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
  16. Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
  17. Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
  18. Haynes, A. P., Fletcher, J. neutrophil function test. Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).
  19. Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
  20. Siano, B., Oh, H., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
  21. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
  22. Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
  23. Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
  24. Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

170 ROS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved