Quantificazione in tempo reale delle specie reattive dell'ossigeno nei neutrofili infettati da Escherichia Coli meningitica

Riepilogo

Escherichia coli è la principale causa di meningite batterica gram-negativa neonatale. Durante l'infezione batterica, le specie reattive di ossigeno prodotte dai neutrofili svolgono un ruolo battericida importante. Qui introduciamo un metodo per rilevare le specie reattive dell'ossigeno nei neutrofili in risposta alla meningite E. coli.

Abstract

L'Escherichia coli (E. coli)è il batterio Gram-negativo più comune che causa meningite neonatale. Il verificarsi di batteriemia e penetrazione batterica attraverso la barriera ematica-encefalica sono passi indispensabili per lo sviluppo della meningite E. coli. Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) rappresentano i principali meccanismi battericidi dei neutrofili per distruggere gli agenti patogeni invasi. In questo protocollo, la produzione di ROS intracellulare dipendente dal tempo nei neutrofili infetti da meningite E. coli è stata quantificata utilizzando sonde ROS fluorescenti rilevate da un lettore di micropiacche a fluorescenza in tempo reale. Questo metodo può anche essere applicato alla valutazione della produzione di ROS nelle cellule di mammifero durante le interazioni patogeno-ospite.

Introduzione

La meningite batterica neonatale è una malattia infettiva pediatrica comune. L'Escherichia coli (E. coli) con una capsula K1 è il più comune agente patogeno Gram-negativo che causa meningite batterica neonatale, rappresentando circa l'80% dell'incidenza^{totale 1,2,3}. Nonostante i progressi nella chemioterapia antimicrobica e nelle cure di supporto, la meningite batterica è ancora una delle condizioni più devastanti con elevata morbilità e mortalità⁴.

Il verificarsi di meningite batterica neonatale di solito inizia con la batteriemia causata dall'ingresso di batteri patogeni nella circolazione periferica dalle lesioni locali dei neonati, seguita dalla penetrazione attraverso la barriera ematico-encefalica (BBB) nel cervello, con conseguente infiammazione delle meningi⁴. L'insorgenza della bacteremia dipende dall'interazione tra batteri e cellule immunitarie ospiti tra cui neutrofili e macrofagi, ecc. I neutrofili, che rappresentano ~ 50-70% dei globuli bianchi, sono la prima linea di difesa contro le infezioni^{batteriche 5,6}. Durante l'invasione dei batteri, i neutrofili attivati vengono reclutati nei siti infettivi e rilasciano specie reattive dell'ossigeno (ROS) tra cui l'anione superossido, il perossido di idrogeno, i radicali idrossili e l'ossigeno singlet⁷. Il ROS subisce reazioni redox con la membrana cellulare, molecole di acido nucleico e proteine dei batteri, con conseguente lesione e morte del batterio invasore⁸. I mitocondri sono il principale sito di produzione di ROS nelle cellule eucariotiche e varie ossidasi (ad esempio, nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NADPH) complesso ossidasi, sistema lipossigenasi, protein chinasi C e sistema cicloossigenasi) mediano la produzione di ROS^9,10. La misurazione in tempo reale della produzione di ROS, che rappresenta il meccanismo antimicrobico primario nei neutrofili, è un metodo utile per studiare la difesa dell'ospite durante l'interazione batteri-ospite.

In questo protocollo, la produzione di ROS dipendente dal tempo nei neutrofili infetti da meningite E. coli è stata quantificata con una sonda FLUORESCENTE ROS DHE, rilevata da un lettore di micropiacche a fluorescenza in tempo reale. Questo metodo può anche essere applicato alla valutazione della produzione di ROS in altre cellule di mammiferi durante l'interazione agente patogeno-ospite.

Protocollo

Il sangue periferico dei volontari applicato in questa ricerca è stato approvato dall'Institutional Review Board della prima Hospital of China Medical University (#2020-2020-237-2).

1. Preparazione dei reagenti e del mezzo di coltura

1. Preparare il tampone di lisi dei globuli rossi aggiungendo 8,29 g di NH₄Cl, 1 g di KHCO₃, 37,2 mg di Na₂EDTA in 1 L di acqua distillata doppia e regolare il pH a 7,2-7,4. Rimuovere i batteri mediante filtrazione utilizzando filtri da 0,22 μm.
2. Preparare il terreno di coltura sperimentale per i neutrofili aggiungendo il 5% di siero bovino fetale al mezzo RPMI 1640 e conservare a 4 °C. Equilibrare a temperatura ambiente prima dell'uso.
   NOTA: Utilizzare il mezzo RPMI 1640 senza rosso fenolo.
3. Preparare la salina tampone fosfato (PBS) aggiungendo 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na₂HPO₄·2H₂O e 0,2 g di KH₂PO₄ in 1 L di acqua distillata doppia in un pallone di vetro da 1 L. Regolare il pH a 7,2-7,4. Autoclave per 15 min a 121 °C.
4. Preparare la soluzione di rifampicina sciogliendo 0,5 g di polvere di rifampicina in 10 mL di solfossido di dimetile (DMSO) per produrre una soluzione di rifampicina da 50 mg/mL.
5. Preparare la soluzione di agar LB aggiungendo 10 g di NaCl, 10 g di triptono, 5 g di estratto di lievito e 15 g di polvere di agar in 1 L di acqua distillata doppia e autoclavare la miscela. Riempire le piastre di Petri a metà del volume versando una soluzione calda di agar LB contenente 100 μg/mL di rifampicina. Conservare la piastra solida raffreddata a 4 °C.
6. Preparare l'infusione di cuore cerebrale (BHI) brodo appropriato per i ceppi batterici sciogliendo 37 g di polvere BHI in 1 L di acqua distillata doppia. Regolare il pH a 7,2 e autoclave.
7. Sciogliere il diidroetidio della sonda fluorescente (DHE) in solvente DMSO per ottenere una soluzione stock da 10 mM. Mescolare delicatamente prima dell'uso.
   NOTA: Aliquote la soluzione stock immediatamente in fiale a prova di luce. La durata di conservazione della soluzione stock è di 6 mesi a -20 °C.

2. Preparazione del ceppo batterico E44

NOTA: E44 è un ceppo mutante di meningite E. coli con resistenza alla rifampicina.

1. Immergere la colonia E44 crioconservata con una punta sterile di pipetta, inoculare il ceppo E44 sulla piastra di agar LB contenente 100 μg/mL di rifampicina disegnando linee. Mettere la piastra capovolta nell'incubatore a 37 °C durante la notte.
2. Un giorno prima dell'esperimento, scegliere una colonia E44 dalla piastra con una punta sterile di pipetta e metterla in 5 ml di brodo BHI contenente 100 μg/mL di rifampicina in un pallone da 50 ml. Incubare la coltura batterica a 37 °C con 90 giri/min per 17 ore in uno shaker di incubazione.

3. Isolamento dei neutrofili dal sangue periferico umano

1. Eleva 5 ml di campione di sangue dai volontari per via endovenosa al tubo di raccolta del sangue sottovuoto contenente EDTA per l'anticoagulazione.
2. Centrifugare i campioni di sangue periferico a 500 x g per 5 min. I campioni di sangue sono divisi in tre strati per centrifugazione, che dal basso verso l'alto sono lo strato di globuli rossi (RBC), lo strato di globuli bianchi (WBC) e lo strato plasmatico, in sequenza.
3. Aspirare lo strato di globuli bianchi con una pipetta a un nuovo tubo con tampone di lysis RBC 3x. Frullare accuratamente la miscela e posizionarsi a temperatura ambiente per 5 minuti.
4. Centrifugare il tubo a 500 x g per 5 min. Aspirare completamente il supernatante e scartare.
   1. Ripetere la procedura di lisi con tampone di lisi RBC 1-2 volte, fino a quando il precipitato diventa bianco.
5. Lavare le cellule rimospensendo il precipitato con 2 mL di PBS. Quindi centrifugare a 300 x g per 5 minuti per lasciare che le cellule si sistemino sul fondo del tubo.
6. Etichettare i neutrofili con microperline CD16 risospendendo il sedimento con 50 μL di tampone di smistamento delle celle magnetiche preraffreddato. Quindi mescolare accuratamente con 50 μL di microperline CD16 umane. Incubare la miscela a 4 °C per 30 minuti.
   NOTA: Le soluzioni devono essere pre-raffreddate per prevenire la tappatura degli anticorpi sulla superficie cellulare e l'etichettatura non specifica. La maggior parte degli adulti ha da 4.000 a 10.000 globuli bianchi per microlitro di sangue, tra cui i neutrofili rappresentano circa il 50-70%. Secondo le stime, i conteggi dei globuli bianchi totali in 5 mL di sangue periferico umano sono solitamente fino a 2-5 x 10⁷.
7. Lavare le celle aggiungendo 2 mL di tampone di smistamento delle celle magnetiche e centrifuga a 4 °C, 300 x g per 10 min. Scartare completamente il supernatante e risospendare il precipitato con 500 μL di tampone di smistamento.
8. Assemblare la colonna magnetica e separare lo scaffale. Spostare il separatore sullo scaffale con la colonna magnetica e sciacquare la colonna con 3 mL di tampone di smistamento.
9. Far cadere la sospensione cellulare nella colonna per consentire ai neutrofili etichettati dalle perline magnetiche di attaccarsi alla colonna magnetica.
10. Lavare le celle non etichettate aggiungendo 3 mL di buffer di smistamento delle celle magnetiche 3 volte, assicurandosi che il serbatoio della colonna sia vuoto ogni volta.
11. Rimuovere la colonna dal separatore magnetico e metterla su un tubo da 15 ml. Aggiungere 5 mL di buffer di ordinamento delle celle magnetiche alla colonna. Spingere fuori le celle magnetiche etichettate usando uno stantuffo.
    NOTA: Per migliorare la purezza dei neutrofili, i passaggi di ordinamento possono essere ripetuti utilizzando una nuova colonna.
12. Centrifugare il tubo a 300 x g per 5 minuti, scartare completamente il supernatante e rimescolare il precipitato con 1 ml di mezzo di coltura. Determinare il numero di cella con un contatore di celle e preparare le celle per ulteriori esperimenti.

4. Misurazione del ROS

1. Centrifugare i neutrofili isolati a 300 x g per 5 minuti, rimescolare il precipitato e regolare la concentrazione cellulare a 2 x 10⁶/mL con un mezzo di coltura contenente 5 μM di sonda a fluorescenza DHE.
2. Incubare i neutrofili a 37 °C per 30 minuti per caricare la sonda DHE, quindi allocare la sospensione cellulare a una micropia piastra di polistirolo nero da 96 pozzetti con 200 μL per pozzo.
3. Accendere il lettore di micropiatte e aprire il software di rilevamento. Scegliere il formato opaca della piastra a 96 pozzi e determinare l'area di lettura.
   1. Impostare la fluorescenza (Ex/Em = 518/605 nm) in modalità cinetica ogni 5 minuti per 60 min a 37 °C. Assicurarsi di scuotere la piastra per 3 s prima di ogni lettura.
4. Esegna la micropiatta dall'incubatore, aggiungi l'E44 coltivato (MOI=100) o il phorbol 12-miristato 13 acetato (PMA) (100 ng/mL) a ogni neutrofilo precaricato ben contenente con 3 repliche. Utilizzare pma come controllo positivo.
5. Posizionare la piastra nel lettore di micropiastrine e iniziare immediatamente il test.

Risultati

Utilizzando il protocollo delineato in questo articolo, i neutrofili sono stati isolati dal sangue periferico umano e caricati con sonda a fluorescenza DHE per rilevare i cambiamenti dei livelli di ROS in risposta all'infezione da E44. Qui forniamo dati rappresentativi che dimostrano la produzione ROS evocata dalla deformazione E44 determinata da un lettore di micropiatte in tempo reale. Aggiungendo ceppi E44 ad un MOI di 100, i livelli di ROS sono aumentati immediatamente e hanno mostrato una continua tendenza all'aumen...

Discussione

I neutrofili agiscono come il componente più abbondante dei globuli bianchi nella circolazione sanguigna umana. Sono importanti cellule effettori nel sistema immunitario umano innato, che costruisce la prima linea di difesa contro l'invasione di agenti patogeni¹¹. La generazione di ROS rappresenta uno dei principali meccanismi battericidi dei neutrofili dopo la fagocitosi¹¹. Recenti studi hanno dimostrato che una struttura simile a una rete rilasciata da un neutrofilo chia...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL polypropylene conical centrifuge tubes	KIRGEN	KG2611
96-well plate	Corning	3025
Agar	DINGGUO	DH010-1.1
Autuomated cell counter	Bio-rad	508BR03397
Biological Safety Carbinet	Shanghai Lishen	Hfsafe-1200Lcb2
Brain heart infusion	BD	237500
CD16 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-701
Centrifuge	Changsha Xiangyi	TDZ5-WS
Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
Dihydroethidium (DHE)	MedChemExpress	104821-25-2
Fetal bovine serum	Cellmax	SA211.02
Incubator	Heraeus	Hera Cell
MACS separation buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Beyoitme	S1819-1mg
QuadroMACS separation Unit	Miltenyi Biotec	130-090-976
Rifampicin	Solarbio	13292-46-1
RPMI1640 medium	Sangon Biotech	E600027-0500
Thermostatic shaker	Shanghai Zhicheng	ZWY-100D
Trypton	OXOID	LP0042
Yeast extract	OXOID	LP0021