中性粒细胞中活性氧物种的实时定量 感染脑膜性 大肠杆菌

摘要

大肠杆菌 是新生儿革兰阴性细菌性脑膜炎的主要原因。在细菌感染期间，中性粒细胞产生的活性氧物种起着主要的杀菌作用。在这里，我们介绍了一种检测中性粒细胞中反应性氧物种以应对 大肠杆菌脑膜炎的方法。

摘要

大肠杆菌 （大肠杆菌）是导致新生儿脑膜炎的最常见革兰阴性细菌。细菌血症的发生和细菌通过血脑屏障的渗透是 大肠杆菌 脑膜炎发展的不可或缺的步骤。活性氧物种（ROS）是中性粒细胞破坏入侵病原体的主要杀菌机制。在本协议中，使用实时荧光微板读卡器检测到的荧光 ROS 探头对感染脑膜 大肠杆菌 的嗜中性粒细胞内 ROS 生产的时间依赖性 ROS 进行量化。该方法还可用于在病原体-宿主相互作用期间评估哺乳动物细胞中的ROS生产。

引言

新生儿细菌性脑膜炎是一种常见的儿科传染病。大肠杆菌（大肠杆菌）与K1胶囊是最常见的革兰阴性病原体引起新生儿细菌性脑膜炎，约占总发病率的80%1，2，3。尽管抗菌化疗和支持性护理取得了进展，但细菌性脑膜炎仍然是发病率高^{、死亡率最高的}疾病之一。

新生儿细菌性脑膜炎的发生通常从致病菌从新生儿的局部病变进入周围循环引起的细菌血症开始，然后通过血脑屏障（BBB）渗透到大脑中，导致脑膜^炎。细菌血症的发病取决于细菌与宿主免疫细胞（包括嗜中性粒细胞和巨噬细胞等）之间的相互作用。中性粒细胞占白细胞的50-70%，是抵御^{细菌感染的第}一道^防线。在细菌入侵期间，活性嗜中性粒细胞被招募到传染性部位并释放活性氧物种（ROS），包括超氧化物离子、过氧化氢、羟基基和单氧^7。ROS对细菌的细胞膜、核酸分子和蛋白质进行氧化反应，导致入侵细菌⁸的损伤和死亡。线粒体是俄罗斯在真核细胞中生产的主要场所，各种氧化物（如烟酰胺腺苷二氯酰胺磷酸盐（NADPH）氧化酶复合物、脂氧酶系统、蛋白激酶C和环氧酶酶系统）调解了^ROS9、10的生产。代表中性粒细胞中主要抗菌机制的ROS生产的实时测量，是研究细菌与宿主相互作用期间宿主防御的有用方法。

在此协议中，受脑膜性大肠杆菌 感染的嗜中性粒细胞中依赖时间的 ROS 生产用荧光 ROS 探头 DHE 进行量化，该探测器由实时荧光微板读卡器检测到。在病原体与宿主相互作用期间，此方法还可用于评估其他哺乳动物细胞中的 ROS 生产。

研究方案

本研究中应用的志愿者外周血液经中国医科大学第一医院机构评审委员会批准（#2020-2020-237-2）。

1. 试剂和文化介质的制备

1. 通过添加 8.29 克 NH₄Cl、1 克 KHCO 3、37.2 毫克 Na₂EDTA 添加到 1 升双蒸馏水中，将 pH 值调整为 7.2-7.4，从而准备红细胞裂解缓冲器。使用 0.22 μm 过滤器过滤细菌。
2. 通过在RPMI 1640介质中加入5%的胎儿牛血清，并在4°C储存，为嗜中性粒细胞准备实验培养介质。 使用前与室温均衡。
   注:使用RPMI 1640介质，无酚红色。
3. 通过在 1 L 玻璃瓶中加入 8 克 NaCl、0.2 克 KCl、1.44 克 Na₂HPO₄+2H₂O 和 0.2 g KH₂PO₄ 加入 1 升双蒸馏水来准备磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。将pH口调整为7.2-7.4。在 121 °C 时自动将其高压 15 分钟。
4. 通过在 10 mL 的二甲基硫氧化物 （DMSO） 中溶解 0.5 克里芬霉素粉末来制备里芬平溶液，从而产生 50 毫克/mL 的利芬平溶液。
5. 通过加入 10 克 NaCl、10 克 tryptone、5 克酵母提取物和 15 克 agar 粉末加入 1 升双蒸馏水并高压灭菌混合物来准备 LB agar 解决方案。通过浇灌含有 100μg/mL 里芬平的温暖 LB agar 溶液，将培养皿填充到体积的一半。将冷却的固体板存放在 4 °C。
6. 通过将 37 克 BHI 粉末溶解到 1 升双蒸馏水中，准备适合细菌菌株的脑心输液 （BHI） 汤。将pH度调整到7.2并将其高压灭菌。
7. 溶解 DMSO 溶剂中的荧光探头二氢二氧化氢 （DHE），产生 10 mM 库存溶液。使用前轻轻混合。
   注:阿里立即将库存溶液引用到防光小瓶中。库存解决方案的保质期为 -6 个月-20 °C。

2. E44细菌菌株的制备

注:E44是一种具有利芬霉素耐药性的脑膜大肠杆菌 突变菌株。

1. 用无菌移液器尖滴入冷冻保存的 E44 菌落，通过绘制线条在含有 100μg/mL rifampicin 的 LB agar 板上接种 E44 菌株。将盘子倒置在37°C的孵化器中过夜。
2. 在实验的前一天，用无菌移液器尖端从盘子中挑选一个E44菌落，并将其放入500微升的BHI汤中，在50升的烧瓶中含有100微克/mL里芬平。在 37 °C 的孵化细菌培养中，在孵化摇床中以 90 rpm 的 17 小时为 17 小时。

3. 将嗜中性粒细胞与人类外围血液隔离

1. 将志愿者静脉注射的5mL血液样本抽到含有EDTA的真空采血管中进行抗凝。
2. 以 500 x g 的速度将外周血液样本离心 5 分钟。血液样本按离心分三层，从下到上依次为红血球（RBC）层、白血球（WBC）层和血浆层。
3. 用管道将白血球层吸气到带有 3 倍 RBC 裂解缓冲器的新管子上。将混合物彻底混合，在室温下放置5分钟。
4. 将管子在500 x g 下离心5分钟。完全吸气超自然人并丢弃。
   1. 用 RBC 裂解缓冲器重复裂解过程 1-2 次，直到沉淀物变白。
5. 用 2 mL 的 PBS 重新悬念沉淀细胞来清洗细胞。然后离心机在300 x g 下5分钟，让细胞沉淀到管子底部。
6. 用CD16微珠标记嗜中性粒细胞，用50μL的预制磁细胞分拣缓冲器重新悬念沉积物。然后与 50 μL 的人类 CD16 微珠彻底混合。在 4 °C 下孵育混合物 30 分钟。
   注意:应预先冷却解决方案，以防止在细胞表面和非特定标签上封盖抗体。大多数成年人每微升血液中约有4，000至10，000个白血球，其中中性粒细胞约占50-70%。据估计，人类外周血5mL中白血球总数通常高达2-5×10^7。
7. 在 4 °C、300 x g 下添加 2 mL 的磁性电池分拣缓冲器和离心机，在 10 分钟内清洗电池。完全丢弃超自然物，用 500 μL 的分拣缓冲器重新吸收沉淀物。
8. 组装磁柱并分离架子。用磁柱将分离器移到架子上，然后用 3 mL 的分拣缓冲器冲洗柱子。
9. 将细胞悬架放入柱中，使磁珠标记的嗜中性粒细胞附着在磁柱上。
10. 通过添加 3 mL 的磁电池分拣缓冲区 3 次来洗掉未标记的细胞，确保柱储液层每次都是空的。
11. 从磁分离器中取出柱子，并将其放在 15 mL 管上。将 5 mL 的磁电池分拣缓冲区添加到列中。使用柱塞推出磁性标记单元。
    注意:为了提高嗜中性粒细胞的纯度，可以使用新列重复分拣步骤。
12. 在300 x g 下将管子离心5分钟，完全丢弃超母体，用1mL的培养介质重新注入沉淀物。用细胞计数器确定细胞编号，并准备细胞进行进一步实验。

4. 罗斯的测量

1. 将分离的嗜中性粒细胞在300 x g 中分离5分钟，恢复沉淀物，并将细胞浓度调整为2 x 10^6/mL，培养介质包含5μM DHE荧光探针。
2. 在 37 °C 下孵育嗜中性粒细胞 30 分钟以加载 DHE 探头，然后将细胞悬架分配给每口井 200μL 的 96 井黑色聚苯乙烯微板。
3. 打开微板读卡器并打开检测软件。选择不透明的 96 井板格式并确定阅读区域。
   1. 将荧光（Ex/Em = 518/605 nm）设置为动能模式，每 5 分钟 60 分钟，在 37 °C。 每次阅读前，请务必将盘子摇动3次。
4. 从孵化器中取出微板，将培养的 E44 （MOI=100） 或 phorbol 12-肌酸酯 13 醋酸盐 （PMA） （100 ng/mL） 添加到每个含有预装嗜中性粒细胞的井中，并具有 3 个复制品。使用PMA作为正控。
5. 将盘子放在微板读卡器中，并立即开始检测。

结果

使用本文概述的协议，嗜中性粒细胞从人类外周血液中分离出来，并装载荧光探头 DHE，以检测针对 E44 感染的 ROS 水平的变化。在这里，我们提供具有代表性的数据，演示由微板读卡器实时确定的 E44 菌株引起的 ROS 生产。通过在 100 的 MOI 中添加 E44 菌株，ROS 水平立即增加，并以时间依赖的方式呈现持续上升趋势（图 1）。通过添加PMA，一个众所周知的中性粒体细胞内ROS的ROS?...

讨论

嗜中性粒细胞是人类血液循环中白血球最丰富的成分。它们是先天人类免疫系统中的重要效应细胞，是抵御病原体入侵的第一道^防线。ROS的产生代表了¹¹号噬菌体病后嗜中性粒细胞的主要杀菌机制之一。最近的研究表明，一种名为中性粒细胞外陷阱（NET）的中性粒细胞释放出的网状结构也参与了细菌杀灭过程^{6、11、12。}

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL polypropylene conical centrifuge tubes	KIRGEN	KG2611
96-well plate	Corning	3025
Agar	DINGGUO	DH010-1.1
Autuomated cell counter	Bio-rad	508BR03397
Biological Safety Carbinet	Shanghai Lishen	Hfsafe-1200Lcb2
Brain heart infusion	BD	237500
CD16 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-701
Centrifuge	Changsha Xiangyi	TDZ5-WS
Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
Dihydroethidium (DHE)	MedChemExpress	104821-25-2
Fetal bovine serum	Cellmax	SA211.02
Incubator	Heraeus	Hera Cell
MACS separation buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Beyoitme	S1819-1mg
QuadroMACS separation Unit	Miltenyi Biotec	130-090-976
Rifampicin	Solarbio	13292-46-1
RPMI1640 medium	Sangon Biotech	E600027-0500
Thermostatic shaker	Shanghai Zhicheng	ZWY-100D
Trypton	OXOID	LP0042
Yeast extract	OXOID	LP0021