تحضير تجانس عضلات الهيكل العظمي للفئران لقياسات النترات والنتريت

Summary

نقدم بروتوكولات لثلاث طرق مختلفة لتجانس أربع مجموعات عضلية مختلفة من الأنسجة العضلية الهيكلية للفئران لقياس ومقارنة مستويات النترات والنتريت. علاوة على ذلك ، نقارن أوزان العينات المختلفة للتحقق مما إذا كان حجم عينة الأنسجة يؤثر على نتائج التجانس.

Abstract

كان يعتقد في السابق أن أيونات النترات (NO₃^-) هي منتجات نهائية خاملة لعملية التمثيل الغذائي لأكسيد النيتريك (NO). ومع ذلك ، أظهرت الدراسات السابقة أنه يمكن تحويل أيونات النترات مرة أخرى إلى NO في الثدييات من خلال آلية اختزال من خطوتين: يتم تقليل النترات إلى النتريت (NO₂^-) في الغالب عن طريق البكتيريا المتعايشة عن طريق الفم ، ثم يتم تقليل النتريت إلى NO بواسطة عدة آليات بما في ذلك عن طريق البروتينات المحتوية على الهيم أو الموليبدينوم. يساهم مسار النترات الاختزالي هذا في تعزيز مسارات الإشارات بدون وساطة ، لا سيما في نظام القلب والأوعية الدموية وأثناء ممارسة العضلات. يتم تحديد مستويات النترات في الجسم قبل هذا الاستخدام من خلال مصدرين مختلفين: عدم الأكسدة الذاتية وتناول النترات الغذائية ، بشكل أساسي من النباتات. لتوضيح دورة NO المعقدة في الظروف الفسيولوجية ، قمنا بفحص ديناميكيات مستقلباتها وأيونات النترات والنتريت ، والتي تكون مستقرة نسبيا مقارنة ب NO. في الدراسات السابقة ، تم تحديد العضلات الهيكلية كعضو تخزين رئيسي لأيونات النترات في الثدييات ، وكذلك مصدر مباشر ل NO أثناء التمرين. لذلك ، فإن إنشاء منهجية موثوقة لقياس مستويات النترات والنتريت في العضلات الهيكلية أمر مهم ويجب أن يكون مفيدا في توسيع نطاق تطبيقه ليشمل عينات الأنسجة الأخرى. يشرح هذا البحث بالتفصيل إعداد عينات العضلات الهيكلية ، باستخدام ثلاث طرق تجانس مختلفة ، لقياسات النترات والنتريت ويناقش القضايا المهمة المتعلقة بعمليات التجانس ، بما في ذلك حجم العينات. كما تمت مقارنة تركيزات النيترات والنتريت عبر أربع مجموعات عضلية مختلفة.

Introduction

يلعب أكسيد النيتريك (NO) ، وهو جزيء إشارات غازي صغير ، دورا مهما في العمليات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية¹. لا يمكن إنتاج NO من L-arginine بواسطة إنزيمات داخلية من عائلة سينسيز أكسيد النيتريك (NOS) قبل الخضوع للأكسدة السريعة للنترات (NO 3-) ، وربما النتريت (NO 2^-) في الدم والأنسجة ^2,3. في الآونة الأخيرة ، ثبت أن هذه الأنيونات قد تم اختزالها مرة أخرى إلى NO في أنظمة الثدييات⁴. يتم تحويل النترات إلى نتريت ، بشكل رئيسي عن طريق اختزال النترات البكتيرية المتعايشة في تجويف الفم التي تعمل على الأيونات التي تفرزها الغدد اللعابية وتبتلع مباشرة ⁵ ، وإلى حد ما ، عن طريق إنزيمات الثدييات مثل أوكسيدوريكتاز الزانثين ^6,7. يمكن تقليل النتريت إلى NO من خلال عدة آليات بما في ذلك deoxyhemoglobin⁸ ، deoxymyoglobin⁹ ، الإنزيمات المحتوية على الموليبدينوم 10 ، والاختزال غير الأنزيمي في وجود البروتونات^11,12.

يتم تعزيز مسار النترات - النتريت - NO في ظل ظروف نقص الأكسجين حيث يتضاءل نشاط NOS لأن NOS يتطلب الأكسجين لتوليد^{NO 4}. أبلغت العديد من الدراسات الحديثة عن آثار مفيدة للنترات الغذائية على تنظيم ضغط الدم وأداء التمارين الرياضية ، مما يشير إلى أن مسارات تقليل النترات تساهم في زيادة إشارات NO¹³،^14،15. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن بعض العضلات الهيكلية هي على الأرجح أماكن تخزين النترات الرئيسية في الجسم¹⁶. بالمقارنة مع الدم أو الأعضاء الداخلية الأخرى مثل الكبد ، تحتوي العضلات الهيكلية (gluteus maximus) على مستويات أعلى بكثير من النترات ولها كتلة كبيرة في جسم الثدييات. تبين أن تمرين جهاز المشي يعزز تقليل النترات إلى النتريت و NO في الألوية في نموذج^{الفئران 7}. تشير هذه النتائج إلى أن بعض العضلات الهيكلية يمكن أن تكون مصادر مهمة ل NO من خلال مسارات تقليل النترات في المواقف الفسيولوجية. تشير الدراسات الحديثة إلى أن هذه النتائج ، بما في ذلك التغيرات في مستويات نترات العضلات أثناء التمرين ، تحدث أيضا في البشر¹⁷.

كان اثنان من المؤلفين الحاليين قد وضعا سابقا طريقة لقياس مستويات النترات والنتريت في الدم وعينات سائلة أخرى¹⁸. ومع ذلك ، عندما تم تحليل مستويات هذه الأنيونات في تجانس الأنسجة في البداية ، لم تكن البروتوكولات التفصيلية متاحة. لفهم ديناميكيات النترات - النتريت - NO في العديد من الأعضاء المختلفة ، كان هدفنا هو تطوير طريقة دقيقة وفعالة لقياس مستويات النترات والنتريت في أنسجة الثدييات بما في ذلك العضلات الهيكلية. في الدراسات السابقة ، تم استخدام أنسجة القوارض لتطوير عمليات تجانس موثوقة ثم تحليل محتويات النترات والنتريت في تلك التجانسات⁷،^16،19. تم توسيع استخدام طريقة التجانس هذه لتشمل عينات خزعة العضلات الهيكلية البشرية ، حيث تم تأكيد القيم ، والأهم من ذلك ، كانت القيم التي لوحظت للعضلات مقارنة بالدم / البلازما في نطاقات ونسب مماثلة لتلك التي لوحظت في القوارض¹⁷. في السنوات الأخيرة ، بدأت مجموعات أخرى أيضا في قياس مستويات النترات والنتريت في تجانس العضلات الهيكلية ، وأبلغت عن قيم قابلة للمقارنة لتلك التي أبلغت عنها مجموعتنا^20,21.

الهدف من ورقة البروتوكول هذه هو وصف تفصيلي لإعداد متجانسات العضلات الهيكلية باستخدام ثلاث طرق تجانس مختلفة للقياس اللاحق لمستويات النترات والنتريت. بالإضافة إلى ذلك ، تم فحص تأثيرات وزن الأنسجة المستخدمة للتجانس على قيم النترات والنتريت في عينات العضلات الهيكلية. نعتقد أن هذه الطرق يمكن تطبيقها بسهولة على أنواع أخرى من أنسجة الثدييات. في الآونة الأخيرة ، وخاصة في مجال فسيولوجيا التمرين ، تم إيلاء الاهتمام للاختلافات المحتملة في فسيولوجيا النترات / النتريت / NO وفقا لمجموعات العضلات. نبلغ أيضا عن كميات النترات والنتريت في أربع عضلات مختلفة للقوارض ونجد توزيعا غير منتظم لكلا الأيونات بين هذه العضلات المختلفة. ملاحظة تتطلب مزيدا من الدراسة.

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكول الحيوان من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان NIDDK (ASP K049-MMB-20). تم التعامل مع الحيوانات ومعالجتها وفقا للدليل الحالي لرعاية واستخدام المختبر المتاح مجانا على موقع AAALAC.

1. جمع العضلات الهيكلية الفئران

1. بينما يكون الجرذ تحت التخدير العميق (5٪ إيزوفلوران ، يؤكده رد الفعل الغائب لقرص الذيل / الساق) ، ابدأ التروية بمحلول ملحي يحتوي على الهيبارين عن طريق وضع إبرة 19 جم في قمة البطين الأيسر وعمل شق على الأذين الأيمن. اترك المحلول الملحي مع الهيبارين يتخلل الأعضاء الداخلية حتى يتدفق 1.5 لتر / كجم على الأقل عبر الأنسجة. في هذه المرحلة ، تموت الحيوانات من الاستنزاف وتكون الجثث جاهزة للمعالجة لجمع العينات.
   ملاحظة: يعد تحقيق التروية الجيدة أمرا بالغ الأهمية ، خاصة بالنسبة للقياسات الدقيقة للنتريت ، لأن النتريت يتأكسد إلى نترات بواسطة أي هيموجلوبين متبقي.
2. تحديد الأنسجة العضلية المستهدفة واستئصالها من الساقين الخلفيتين²² باستخدام أدوات جراحية نظيفة. إزالة أكبر قدر ممكن من الدهون والأنسجة الضامة من أنسجة العضلات.
3. ضع الكمية المطلوبة من العضلات في أنبوب طرد مركزي دقيق ثم ضعها على ثلج جاف. قم بتخزين الأنابيب المملوءة بالأنسجة في الفريزر -80 درجة مئوية.
   ملاحظة: في حالة عينات الخزعة البشرية ، قم بمسحها جيدا فور جمعها بشاش نظيف لإزالة الدم الزائد.

2. التحضير للتجانس

1. تحضير محلول الحفاظ على النتريت (محلول التوقف)
   1. تحضير محلول أصفر صاف يحتوي على 890 mM من فيريسيانيد البوتاسيوم (K₃Fe (CN) ₆) و 118 mM NEM (N-ethylmaleimde) في الماء المقطر ، مما يضمن عدم وجود بلورات. أضف الفاعل بالسطح غير الأيوني (المنظفات) بنسبة 1: 9 (v / v ، جدول المواد) ، واخلطه برفق لتجنب الرغوة.
   2. تمييع محلول التوقف بنسبة 1: 9 بالماء المقطر. ضع محلول التوقف المخفف (نسبة 1: 5 من الأنسجة العضلية إلى محلول التوقف المخفف) في أنبوب التجانس.
      ملاحظة: سيتطلب عشرون ملليغرام من الأنسجة 100 ميكرولتر من محلول التوقف ، وسيتطلب 200 مجم من الأنسجة 1000 ميكرولتر من محلول التوقف في الأنبوب. يعد وجود المنظفات في محلول مضاف أمرا بالغ الأهمية لتعطيل أغشية الخلايا. يمكن استخدام أي منظف غير أيوني ، ولكن يجب توخي الحذر للتحقق من أنه لا يتداخل مع طريقة التلألؤ الكيميائي.
2. تحضير الأنسجة
   1. أخرج المنديل من الفريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية وقم بإذابته ببطء في الثلج. إزالة الدهون المتبقية والنسيج الضام من العضلات والهيكل العظمي. قطع قطع من العضلات والهيكل العظمي وصمة عار على الشاش حتى يجف.
   2. وزن كمية الأنسجة (20 و 50 و 200 ملغ). ضع العضلة الهيكلية الموزونة مسبقا في محلول التوقف في أنابيب التجانس أو ضع الأنسجة التي تم وزنها مسبقا في أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف لاستخدامها لاحقا.

3. التجانس

1. الخالط الدوار (الشكل 1)
   1. ضع الأنبوب من النوع M الذي يحتوي على العضلات الهيكلية الموزونة مسبقا ومحلول التوقف المقاس مسبقا في الجهاز. قم بتجانس كل عينة مرتين (الإعداد على دورة التجانس الأكثر تدميرا) وضع الأنبوب على الثلج مباشرة بعد كل تجانس لمدة 5 دقائق ليبرد.
   2. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة عند 2000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. ضع الأنبوب الكامل مرة أخرى على الثلج وأضف الحجم المناسب من الميثانول (≥ 99.9٪ ، 10x من وزن الأنسجة). دوامة تماما لمدة 15 ثانية.
      ملاحظة: للحصول على 20 ملغ من الأنسجة، استخدم 200 ميكرولتر من الميثانول. يستخدم الميثانول لترسيب البروتينات من تجانس الأنسجة ولا يتداخل مع طريقة التلألؤ الكيميائي. إذا تم استخدام طريقة ترسيب البروتين الأخرى ، فاختبر توافقها مع التلألؤ الكيميائي.
   3. تجانس مرة أخرى واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي للعينات لمدة 35 دقيقة عند 4 درجات مئوية و 3500 × جم. استنشاق المادة الطافية ، وقياس مستويات النتريت / النترات ، أو تخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
2. الخالط حبة (الشكل 2)
   1. ضع النسيج العضلي الهيكلي في أنبوب يحتوي على حبة (نسبة 1: 5 للأنسجة: محلول توقف مخفف) وتجانس مرتين لمدة 45 ثانية بأعلى سرعة متوفرة على الأداة المستخدمة. ضع الأنبوب على الثلج مباشرة بعد كل تجانس لمدة 5 دقائق ليبرد.
   2. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير لسطح المكتب (2000 × جم) لمدة 5 ثوان. ضع الأنبوب مرة أخرى على الثلج وأضف حجما مناسبا من الميثانول (نقاء ≥ 99.9٪ ، 10x من وزن الأنسجة). دوامة تماما لمدة 15 ثانية.
      ملاحظة 1: للحصول على 20 ملغ من الأنسجة ، استخدم 200 ميكرولتر من الميثانول.
      ملاحظة 2: يستخدم الميثانول لترسيب البروتينات من تجانس الأنسجة ولا يتداخل مع طريقة التلألؤ الكيميائي. إذا تم استخدام طريقة ترسيب البروتين الأخرى ، فاختبر توافقها مع التلألؤ الكيميائي.
   3. تجانس مرة أخرى لمدة 45 ثانية بأعلى سرعة متاحة على الأداة المستخدمة. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. جهاز طرد مركزي عند 17000 × جم ، 4 درجات مئوية ، 30 دقيقة. استنشاق المادة الطافية ، وقياس مستويات النتريت / النترات ، أو تخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
3. الطاحن (الشكل 3)
   1. تحضير أنابيب تحتوي على محلول توقف مخفف (5x من وزن الأنسجة) ووزنها. سجل الوزن (أنبوب + محلول إيقاف).
   2. ضع أداة طاحن النيتروجين السائل على الثلج الجاف وانتظر لمدة 30 دقيقة تقريبا حتى تصل إلى درجة الحرارة المطلوبة.
   3. باستخدام ملاقط مبردة في النيتروجين السائل ، انقل عينة واحدة (تم قياس وزن الأنسجة بالفعل) إلى آلة السحق. أضف ملعقة صغيرة من النيتروجين السائل للتأكد من أن الأنسجة في درجة حرارة النيتروجين السائل.
   4. بعد تبخر 95٪ من النيتروجين السائل ، ضع أداة التكسير فوق الأنسجة ، واضغط بقوة. يجب أن تشعر بسحق العينة. باستخدام المطرقة ، اضرب أداة التكسير 3-5x.
   5. افحص العينة بحثا عن أي قطع متبقية باستخدام ملعقة مبردة في النيتروجين السائل. بعد التبريد في النيتروجين السائل ، استخدم قطعة من المناديل الورقية لمسح أي ماء مجمد قبل لمس المنديل. في حالة وجود قطعة ، انقلها إلى المركز ، ثم اضرب 5-6 مرات أخرى بالمطرقة.
   6. عندما يتم سحق العينة بأكملها ، استخدم الملعقة المبردة بالنيتروجين السائل لنقل الأنسجة المسحوقة مباشرة إلى الأنبوب الذي تم وزنه مسبقا والذي يحتوي على محلول التوقف المخفف (الخطوة 3.3.1). تأكد من تنفيذ هذه الخطوة بسرعة لأنه عندما ترتفع درجة حرارة العضلات الهيكلية المسحوقة ، تصبح لزجة ويصعب نقلها.
   7. دوامة لمدة 15 ثانية. تأكد من عدم وجود نسيج عالق في الجزء العلوي من الأنبوب عن طريق فتح الأنبوب. إذا كان هناك ، حاول إزاحته ثم دوامة مرة أخرى.
   8. الطرد المركزي العينة لمدة 2-3 ثوان باستخدام جهاز طرد مركزي صغير لسطح المكتب. وزن الأنبوب مرة أخرى. احسب وزن الأنسجة عن طريق خصم وزن الأنبوب الأصلي (الخطوة 3.3.1) من هذا الوزن الجديد. ضع الأنبوب على الثلج.
      ملاحظة: ستساعد الأوزان الدقيقة في تحديد وزن الأنسجة الدقيق ومقدار الأنسجة المفقودة أثناء السحق.
   9. بمجرد معالجة جميع العينات حتى الخطوة 3.3.8 ، أضف حجما مناسبا من الميثانول (≥ 99.9٪ ، 10x من وزن الأنسجة). دوامة جيدا لمدة 15 ثانية ، واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: للحصول على 20 ملغ من الأنسجة، استخدم 200 ميكرولتر من الميثانول. يستخدم الميثانول لترسيب البروتينات من تجانس الأنسجة ولا يتداخل مع طريقة التلألؤ الكيميائي. إذا تم استخدام طريقة ترسيب البروتين الأخرى ، فاختبر توافقها مع التلألؤ الكيميائي.
   10. جهاز طرد مركزي عند 17000 × جم ، 4 درجات مئوية ، 30 دقيقة. استنشاق المادة الطافية وقياس مستويات النتريت / النترات ، أو تخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

4. قياس النتريت / النترات باستخدام محلل أكسيد النيتريك (NOA)

1. تحضير جميع العينات بأي من طرق التجانس الثلاث المختلفة الموضحة أعلاه وحقنها في NOA لقياس النترات والنتريت.
   ملاحظة: تم نشر بروتوكولات مفصلة لاستخدام NOA سابقا¹⁹.

النتائج

للحصول على نتائج تمثيلية ، تم استخدام أنسجة العضلات الهيكلية من 8 فئران Wistar (ذكور وإناث ، وزن 250 ± 50 جم). تم تحضير تجانس عضلات الهيكل العظمي للفئران (50 ملغ من عضلة الألوية القصوى لكل طريقة) بواسطة ثلاث أدوات تجانس مختلفة (الخالط الدوار ، الخالط الخرز ، والسحق). ثم تم تحديد محتويات النترات والنت...

Discussion

لمراقبة التغيرات في مستقلبات NO والنترات والنتريت ، كدالة للتدخلات الفسيولوجية ، من الضروري قياس مستويات هذه الأيونات في الأعضاء المختلفة التي تعتبر حاسمة في عملية التمثيل الغذائي. نظرا لأن الهيموجلوبين في الدم سوف يتفاعل مع NO ومستقلباته ، فمن المهم أيضا إزالة الدم بسرعة من عينات الأنسجة...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
gentle MACS M tube	Miltenyi Biotec	130-093-236	Length: 87 mm; Diameter: 30 mm
Heparin Sodium	Hospira	NDC-0409-7620-13
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
Methanol	Sigma	646377
Minilys bead homogenizer	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
Nitric Oxide analyzer	GE	Sievers NOA 280i
NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol	Sigma	74385
Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
Precellys lysing kit	Bertin Instruments	P000911-LYSK0-A	contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization
Pulverizer kit	Cellcrusher	Cellcrusher kit