用于硝酸盐和亚硝酸盐测量的大鼠骨骼肌匀浆的制备

摘要

我们提出了三种不同方法的方案，用于大鼠骨骼肌组织的四个不同肌肉群的均质化，以测量和比较硝酸盐和亚硝酸盐的水平。此外，我们比较不同的样品重量，以研究组织样品大小是否会影响均质化的结果。

摘要

硝酸盐离子（NO₃^-）曾经被认为是一氧化氮（NO）代谢的惰性最终产物。然而，先前的研究表明，硝酸盐离子可以通过两步还原机制在哺乳动物中转化为NO:硝酸盐主要通过口服共生细菌还原为亚硝酸盐（NO₂^-），然后亚硝酸盐通过多种机制还原为NO，包括通过含血红素或钼的蛋白质。这种还原性硝酸盐途径有助于增强NO介导的信号通路，特别是在心血管系统和肌肉运动期间。在这种利用之前，体内硝酸盐的水平由两个不同的来源决定:内源性NO氧化和膳食硝酸盐摄入量，主要来自植物。为了阐明生理环境中复杂的NO循环，我们进一步研究了其代谢物，硝酸盐和亚硝酸盐离子的动力学，与NO相比，它们相对稳定。在以前的研究中，骨骼肌被确定为哺乳动物硝酸盐离子的主要储存器官，也是运动期间NO的直接来源。因此，建立一种可靠的方法来测量骨骼肌中的硝酸盐和亚硝酸盐水平非常重要，并且应该有助于将其应用扩展到其他组织样本。本文详细解释了使用三种不同的均质化方法制备骨骼肌样品，用于硝酸盐和亚硝酸盐测量，并讨论了与均质化过程相关的重要问题，包括样品的大小。硝酸盐和亚硝酸盐浓度也比较了四个不同的肌肉群。

引言

一氧化氮（NO）是一种小的气态信号分子，在生理和病理生理过程中起着关键作用¹。NO可以通过一氧化氮合酶（NOS）家族的内源性酶从L-精氨酸产生，然后快速氧化为硝酸盐（NO 3-），并且可能在血液和组织中的亚硝酸盐（NO₂^-）2^，₃。最近，这些阴离子已被证明在哺乳动物系统中被还原回^NO4。硝酸盐转化为亚硝酸盐，主要是通过口腔内共生细菌硝酸盐还原酶作用于唾液腺分泌的离子而直接摄入5，并在一定程度上通过哺乳动物酶如黄嘌呤氧化还原酶^6，7。亚硝酸盐可以通过几种机制进一步还原为NO，包括脱氧血红蛋白⁸，脱氧肌红蛋白⁹，含钼酶¹⁰和质子存在下的非酶还原^11，12。

这种硝酸盐 - 亚硝酸盐 - NO途径在缺氧条件下增强，其中NOS活性降低，因为NOS需要氧气才能产生^NO4。最近的许多研究报告了膳食硝酸盐对血压调节和运动表现的有益影响，这表明硝酸盐减少途径有助于NO信号传导的增强¹³，^14，15。先前的研究表明，一些骨骼肌可能是体内主要的硝酸盐储存场所¹⁶。与血液或其他内脏器官（如肝脏）相比，骨骼肌（臀大肌）含有更高水平的硝酸盐，并且在哺乳动物体内具有相当大的质量。在大^{鼠模型中，}跑步机运动显示可增强硝酸盐减少到亚硝酸盐和臀大肌中的NO7。这些结果表明，一些骨骼肌可能是生理情况下通过硝酸盐减少途径获得NO的重要来源。最近的研究表明，这些发现，包括运动期间肌肉硝酸盐水平的变化，也发生在人类^身上17。

目前的两位作者之前已经建立了一种测量血液和其他液体样品中硝酸盐和亚硝酸盐水平的方法¹⁸。然而，当最初分析组织匀浆中这些阴离子的水平时，没有详细的方案。为了了解几个不同器官中的硝酸盐-亚硝酸盐-NO动力学，我们的目标是开发一种准确有效的方法来测量哺乳动物组织（包括骨骼肌）中的硝酸盐和亚硝酸盐水平。在早期的研究中，啮齿动物组织用于开发可靠的均质过程，然后分析这些匀浆中的硝酸盐和亚硝酸盐含量⁷，^16，19。这种均质化方法的使用扩展到人类骨骼肌活检样本，从而确认了这些值，重要的是，与血液/血浆相比，观察到的肌肉值与在啮齿动物中观察到的值相似¹⁷。近年来，其他小组也开始测量骨骼肌匀浆中的硝酸盐和亚硝酸盐水平，报告的值与我们小组^20，21报告的数值相当。

本协议论文的目的是详细描述使用三种不同的匀浆方法制备骨骼肌匀浆，以便随后测量硝酸盐和亚硝酸盐水平。此外，还研究了用于均质化的组织重量对骨骼肌样品中硝酸盐和亚硝酸盐值的影响。我们相信这些方法可以很容易地应用于其他类型的哺乳动物组织。近年来，特别是在运动生理学领域，人们开始关注硝酸盐/亚硝酸盐/NO生理学根据肌肉群可能存在的差异。我们还报告了四种不同啮齿动物肌肉中硝酸盐和亚硝酸盐的含量，并发现这两种离子在这些不同的肌肉中分布不均匀;需要进一步研究的观察结果。

研究方案

动物方案已获得NIDDK动物护理和使用委员会（ASP K049-MMB-20）的批准。动物是根据AAALAC网站上免费提供的现行实验动物护理和使用指南进行处理和治疗的。

1.大鼠骨骼肌采集

1. 当大鼠处于深度麻醉状态（5%异氟醚，通过对尾部/腿部挤压没有反应来证实），通过将19G针头放入左心室的顶点并在右心房上划开切口，开始用含有肝素的盐水灌注。让含有肝素的生理盐水灌注到内脏器官，直到至少 1.5 升/千克流过组织。此时，动物因放血而死亡，尸体已准备好进行处理以进行样本采集。
   注意:实现良好的灌注至关重要，特别是对于亚硝酸盐的准确测量，因为亚硝酸盐会被任何剩余的血红蛋白氧化成硝酸盐。
2. 识别目标肌肉组织并使用干净的手术器械从后腿²² 中切除它们。尽可能多地从肌肉组织中去除脂肪和结缔组织。
3. 将所需量的肌肉放入微量离心管中，然后放在干冰上。将装满组织的试管储存在-80°C冰箱中。
   注意:如果是人体活检样本，请在收集后立即用干净的纱布彻底吸干以去除多余的血液。

2. 均质准备

1. 亚硝酸盐保存溶液（终止液）的制备
   1. 在蒸馏水中制备含有890 mM铁氰化钾（K₃Fe（CN）₆）和118 mM NEM（N-乙基马来酰亚胺）的透明黄色溶液，确保没有晶体。以1:9的比例（v/v， 材料表）加入非离子表面活性剂（洗涤剂），轻轻混合以避免起泡。
   2. 用蒸馏水以1:9的比例稀释终止溶液。将稀释的终止溶液（肌肉组织与稀释的终止溶液的比例为1:5）放入均质管中。
      注意:20 毫克组织将需要 100 μL 终止溶液，200 mg 组织需要管中 1000 μL 终止溶液。添加溶液中洗涤剂的存在对于细胞膜的破坏至关重要。可以使用任何非离子洗涤剂，但必须注意验证它不会干扰化学发光方法。
2. 组织制备
   1. 将组织从-80°C冰箱中取出，在冰中缓慢解冻。从骨骼肌中去除剩余的脂肪和结缔组织。切下骨骼肌碎片，在纱布上吸干。
   2. 称出组织量（20、50 和 200 毫克）。将预先称重的骨骼肌放入均质管中的终止溶液中，或将预先称重的组织放入干净的微量离心管中以供以后使用。

3. 均质化

1. 旋转均质机（图1）
   1. 将装有预先称重的骨骼肌和预先测量的停止溶液的M型管放入机器中。将每个样品均质化两次（设置最具破坏性的均质循环），并在每次均质后立即将管放在冰上5分钟以冷却。
   2. 在2，000× g 和4°C下短暂离心5分钟。将整个试管放回冰上，加入适当体积的甲醇（≥99.9%，组织重量的10倍）。彻底涡旋15秒。
      注意:对于 20 mg 组织，请使用 200 μL 甲醇。甲醇用于从组织匀浆中沉淀蛋白质，并且不会干扰化学发光方法。如果使用其他蛋白质沉淀方法，请测试其与化学发光的相容性。
   3. 再次均质并在冰上孵育30分钟。将样品在4°C和3，500 ×g下离心35分钟。吸出上清液，并测量亚硝酸盐/硝酸盐水平，或储存在-80°C以备后用。
2. 磁珠均质机（图2）
   1. 将骨骼肌组织放入含珠的管中（组织的比例为1:5:5:稀释的终止溶液），并以所用仪器上可用的最高速度匀浆两次45秒。每次均质化后立即将管子放在冰上5分钟以冷却。
   2. 使用小型台式离心机（2，000 x g）短暂离心5秒。将试管放回冰上，加入适量的甲醇（纯度≥99.9%，组织重量的10倍）。彻底涡旋15秒。
      注1:对于20毫克组织，使用200μL甲醇。
      注2:甲醇用于从组织匀浆中沉淀蛋白质，不干扰化学发光法。如果使用其他蛋白质沉淀方法，请测试其与化学发光的相容性。
   3. 以所用仪器上可用的最高速度再次均质 45 秒。在冰上孵育30分钟。以17，000×g离心，4°C，30分钟。吸出上清液，并测量亚硝酸盐/硝酸盐水平，或储存在-80°C以备后用。
3. 粉碎机（图3）
   1. 准备含有稀释终止溶液（组织重量的5倍）的试管并称重。记录重量（管+停止溶液）。
   2. 将液氮粉碎机工具放在干冰上，等待约30分钟以达到所需温度。
   3. 使用在液氮中冷却的镊子，将一个样品（已测量的组织重量）转移到粉碎机中。加入一小勺液氮，确保组织处于液氮温度。
   4. 95%的液氮汽化后，将破碎工具放在组织顶部，并用力按压。你应该感觉到样品的挤压。用木槌敲击破碎工具3-5倍。
   5. 使用在液氮中冷却的勺子检查样品是否有任何剩余的块。在液氮中冷却后，在接触纸巾之前，用一张薄纸擦去任何冷冻水。如果存在一块，请将其移动到中心，然后用木槌再敲击 5-6 次。
   6. 当整个样品粉碎后，使用液氮冷却的勺子将粉碎的组织直接转移到含有稀释终止溶液的预称重管中（步骤3.3.1）。请务必快速执行此步骤，因为当压碎的骨骼肌变热时，它会变得粘稠且难以转移。
   7. 涡旋15秒。打开试管，检查试管顶部是否有组织卡住。如果有，请尝试将其移开，然后再次涡旋。
   8. 使用小型台式离心机将样品离心2-3秒。再次称量试管。通过从该新重量中减去原始管重量（步骤3.3.1）来计算组织重量。将试管放在冰上。
      注意:确切的重量将有助于确定确切的组织重量以及粉碎过程中损失的组织量。
   9. 一旦所有样品都处理完毕至步骤3.3.8，加入适量的甲醇（≥99.9%，组织重量的10倍）。彻底涡旋15秒，并在冰上孵育30分钟。
      注意:对于 20 mg 组织，请使用 200 μL 甲醇。甲醇用于从组织匀浆中沉淀蛋白质，并且不会干扰化学发光方法。如果使用其他蛋白质沉淀方法，请测试其与化学发光的相容性。
   10. 在17，000 ×g，4°C下离心30分钟。吸出上清液并测量亚硝酸盐/硝酸盐水平，或储存在-80°C以备后用。

4. 使用一氧化氮分析仪（NOA）测量亚硝酸盐/硝酸盐

1. 通过上述三种不同的均质化方法之一制备所有样品，并将它们注入NOA中进行硝酸盐和亚硝酸盐测量。
   注意:NOA使用的详细协议之前已发布¹⁹。

结果

为了获得具有代表性的结果，使用了来自8只Wistar大鼠（雄性和雌性，体重250±50g）的骨骼肌组织。通过三种不同的均质工具（旋转均质机，珠均质机和粉碎机）制备大鼠骨骼肌匀浆（每种方法50mg臀大肌）。然后使用一氧化氮分析仪（NOA）测定这些匀浆的硝酸盐和亚硝酸盐含量（图4）。这三个匀浆样品中的硝酸盐水平（图4A）彼此非常相似，范围为39.6?...

讨论

为了监测NO代谢物，硝酸盐和亚硝酸盐的变化，作为生理干预的功能，必须测量这些离子在不同器官中的水平，这些离子在其代谢中至关重要。由于血液中的血红蛋白会与NO及其代谢物发生反应，因此尽可能从组织样本中快速去除血液也很重要。因此，在收集骨骼肌组织（臀肌，TA，EDL，腓肠肌）之前，用盐水灌注动物，并立即去除目标肌肉周围的结缔组织和脂肪。对于均质溶液，用铁氰化物、NEM ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
gentle MACS M tube	Miltenyi Biotec	130-093-236	Length: 87 mm; Diameter: 30 mm
Heparin Sodium	Hospira	NDC-0409-7620-13
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
Methanol	Sigma	646377
Minilys bead homogenizer	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
Nitric Oxide analyzer	GE	Sievers NOA 280i
NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol	Sigma	74385
Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
Precellys lysing kit	Bertin Instruments	P000911-LYSK0-A	contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization
Pulverizer kit	Cellcrusher	Cellcrusher kit