질산염 및 아질산염 측정을 위한 쥐 골격근 균질액의 제조

요약

우리는 질산염과 아질산염의 수준을 측정하고 비교하기 위해 쥐 골격근 조직의 4 가지 근육 그룹의 균질화를위한 세 가지 다른 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다. 또한 조직 샘플 크기가 균질화 결과에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해 다양한 샘플 가중치를 비교합니다.

초록

질산염 이온 (NO₃^-)은 한때 산화 질소 (NO) 대사의 불활성 최종 생성물로 생각되었습니다. 그러나 이전의 연구는 질산염 이온이 2 단계 환원 메커니즘을 통해 포유류에서 NO로 다시 전환 될 수 있음을 입증했다 : 질산염은 주로 경구 공생 박테리아에 의해 아질산염 (NO₂^-)으로 환원되고, 아질산염은 헴 또는 몰리브덴 함유 단백질을 포함한 여러 메커니즘에 의해 NO로 환원된다. 이 환원성 질산염 경로는 특히 심혈관계 및 근육 운동 중에 NO 매개 신호 전달 경로를 향상시키는 데 기여합니다. 이러한 활용 전에 신체의 질산염 수준은 주로 식물에서 내인성 NO 산화 및식이 질산염 섭취의 두 가지 다른 원인에 의해 결정됩니다. 생리적 환경에서 복잡한 NO 순환을 설명하기 위해 우리는 NO에 비해 상대적으로 안정적인 대사 산물, 질산염 및 아질산염 이온의 역학을 추가로 조사했습니다. 이전 연구에서 골격근은 포유류에서 질산염 이온의 주요 저장 기관이자 운동 중 NO의 직접적인 공급원으로 확인되었습니다. 따라서 골격근에서 질산염 및 아질산염 수준을 측정하기 위한 신뢰할 수 있는 방법론을 수립하는 것이 중요하며 다른 조직 샘플로 적용을 확장하는 데 도움이 되어야 합니다. 이 논문은 질산염 및 아질산염 측정을 위해 세 가지 다른 균질화 방법을 사용하여 골격근 샘플의 준비를 자세히 설명하고 샘플의 크기를 포함하여 균질화 과정과 관련된 중요한 문제에 대해 논의합니다. 질산염과 아질산염 농도는 또한 4 개의 다른 근육 그룹에서 비교되었습니다.

서문

작은 기체 신호 분자인 산화질소(NO)는 생리학적 및 병리생리^{학적 과정에서 중요한} 역할을 합니다1. NO는 질산염 (NO 3-) 및 아마도 혈액 및 조직에서 아질산염 (NO₂^-)으로 빠르게 산화되기 전에 산화 질소 합성 효소 (NOS) 계열의 내인성 효소에 의해 L^- 아르기닌으로부터 생성 될 수있다 ^2,3. 최근에, 이들 음이온은 포유류 시스템⁴에서 NO로 다시 환원되는 것으로 나타났다. 질산염은 주로 타액선에서 분비되고 직접 섭취되는 이온에 작용하는 구강 내 공생 박테리아 질산염 환원 효소 ⁵에 의해 아질산염으로 전환되며, 어느 정도는 크 산틴 산화 환원 효소 ^6,7과 같은 포유류 효소에 의해 전환됩니다. 아질산염은 데옥시헤모글로빈⁸, 데옥시미오글로빈⁹, 몰리브덴 함유 효소(10) 및 양성자의 존재 하에서의 비효소적 환원(^11,12)을 포함하는 여러 메커니즘에 의해 NO로 더 감소될 수 있다.

이 질산염-아질산염-NO 경로는 NOS가 NO 생성⁴에 산소를 필요로하기 때문에 NOS 활성이 감소하는 저산소 조건 하에서 강화됩니다. 최근의 많은 연구에서는 식이 질산염이 혈압 조절 및 운동 수행에 유익한 효과를 보고했으며, 이는 질산염 감소 경로가 NO 신호 전달^13,14,15의 증가에 기여한다는 것을 시사합니다. 이전의 연구는 일부 골격근이 신체의 주요 질산염 저장 장소 일 가능성이 있음을 보여주었습니다¹⁶. 혈액이나 간과 같은 다른 내부 장기와 비교할 때 골격근 (대둔근)은 상당히 높은 수준의 질산염을 함유하고 포유류 신체에 상당한 질량을 가지고 있습니다. 트레드밀 운동은 쥐 모델⁷에서 아질산염과 둔근의 NO로의 질산염 감소를 향상시키는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 일부 골격근이 생리적 상황에서 질산염 환원 경로를 통해 NO의 중요한 공급원이 될 수 있음을 의미합니다. 보다 최근의 연구에 따르면 운동 중 근육 질산염 수준의 변화를 포함한 이러한 발견은 인간에서도 발생합니다¹⁷.

현재 저자 중 두 명은 이전에 혈액 및 기타 액체 샘플에서 질산염 및 아질산염 수준을 측정하는 방법을 확립했습니다¹⁸. 그러나 조직 균질액에서 이러한 음이온의 수준을 처음 분석했을 때 자세한 프로토콜을 사용할 수 없었습니다. 여러 기관에서 질산염-아질산염-NO 역학을 이해하기 위해 우리의 목표는 골격근을 포함한 포유류 조직에서 질산염 및 아질산염 수준을 측정하는 정확하고 효율적인 방법을 개발하는 것이 었습니다. 초기 연구에서, 설치류 조직은 신뢰할 수있는 균질화 공정을 개발 한 다음 이들 균질 물 ^7,16,19에서 질산염 및 아질산염 함량을 분석하는 데 사용되었다. 이 균질화 방법의 사용은 인간 골격근 생검 샘플로 확장되어 값이 확인되었으며, 중요한 것은 혈액/혈장과 비교하여 근육에 대해 관찰된 값이 설치류¹⁷에서 관찰된 값과 유사한 범위 및 비율에 있다는 것입니다. 최근 몇 년 동안 다른 그룹도 골격근 균질 액에서 질산염과 아질산염 수준을 측정하기 시작하여 우리 그룹^20,21에서보고 한 것과 비슷한 값을보고했습니다.

이 프로토콜 논문의 목적은 질산염 및 아질산염 수준의 후속 측정을 위해 세 가지 다른 균질화 방법을 사용하여 골격근 균질액의 제조를 자세히 설명하는 것입니다. 또한, 골격근 샘플에서 질산염 및 아질산염 값에 대한 균질화에 사용 된 조직 중량의 영향을 조사했다. 우리는 이러한 방법이 다른 유형의 포유류 조직에 쉽게 적용될 수 있다고 믿습니다. 최근 특히 운동 생리학 분야에서는 근육 그룹에 따른 질산염 / 아질산염 / NO 생리학의 가능한 차이에주의를 기울였습니다. 우리는 또한 네 개의 다른 설치류 근육에서 질산염과 아질산염의 양을보고하고 이러한 다른 근육 사이에서 두 이온의 불균일 한 분포를 찾습니다. 추가 연구가 필요한 관찰.

프로토콜

동물 프로토콜은 NIDDK 동물 관리 및 사용 위원회(ASP K049-MMB-20)에 의해 승인되었다. 동물은 AAALAC 웹사이트에서 무료로 제공되는 현재 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 취급 및 처리되었습니다.

1. 쥐 골격근 수집

1. 쥐가 깊은 마취 (5 % 이소 플루 란, 꼬리 / 다리 꼬집음에 반응이없는 것으로 확인)에있는 동안 19G 바늘을 좌심실의 정점에 놓고 우심방에 흠집을 만들어 헤파린이 함유 된 식염수로 관류를 시작하십시오. 적어도 1.5 리터 / kg이 조직을 통해 흐를 때까지 헤파린이 함유 된 식염수가 내부 장기를 통해 관류되도록하십시오. 이 시점에서 동물은 방혈로 사망하고 시체는 샘플 수집을 위해 처리 할 준비가됩니다.
   알림: 아질산염은 남아 있는 헤모글로빈에 의해 질산염으로 산화되기 때문에 특히 아질산염의 정확한 측정을 위해서는 우수한 관류를 달성하는 것이 중요합니다.
2. 표적 근육 조직을 확인하고 깨끗한 수술 도구를 사용하여 뒷다리⁽²² )로부터 이들을 절제한다. 근육 조직에서 가능한 한 많은 지방과 결합 조직을 제거하십시오.
3. 원하는 양의 근육을 미세 원심 분리기 튜브에 넣은 다음 드라이 아이스에 놓습니다. 티슈로 채워진 튜브를 -80 °C 냉동고에 보관하십시오.
   알림: 인간 생검 샘플의 경우 수집 즉시 깨끗한 거즈로 철저히 닦아 과도한 혈액을 제거하십시오.

2. 균질화를위한 준비

1. 아질산염 보존 용액의 제조 (정지 용액)
   1. 증류수에 890mM 페리시안화 칼륨 (K₃Fe (CN) ₆) 및 118 mM NEM (N- 에틸 말레 이미드)을 함유 한 투명한 노란색 용액을 준비하여 결정이 없는지 확인합니다. 비이온성 계면활성제(세제)를 1:9 비율(v/v, 재료 표)로 첨가하고 거품이 생기지 않도록 부드럽게 혼합합니다.
   2. 정지 용액을 증류수로 1:9 비율로 희석합니다. 희석된 정지 용액(희석된 정지 용액에 대한 근육 조직의 1:5 비율)을 균질화 튜브에 넣습니다.
      참고: 20mg의 조직에는 100μL의 정지 용액이 필요하고 200mg의 조직에는 튜브에 1000μL의 정지 용액이 필요합니다. 첨가 된 용액에 세제가 존재하는 것은 세포막의 파괴에 중요합니다. 임의의 비이온성 세제가 사용될 수 있지만, 그것이 화학발광 방법을 방해하지 않는지 확인하기 위해 주의해야 한다.
2. 조직 준비
   1. -80 °C 냉동고에서 티슈를 꺼내 얼음에서 천천히 해동합니다. 골격근에서 남은 지방과 결합 조직을 제거하십시오. 골격근 조각을 잘라 내고 거즈로 닦아서 말립니다.
   2. 조직의 양을 측정합니다 (20, 50 및 200mg). 미리 칭량된 골격근을 균질화 튜브의 정지 용액에 넣거나 나중에 사용할 수 있도록 미리 칭량된 조직을 깨끗한 미세 원심분리 튜브에 넣습니다.

3. 균질화

1. 로타리 균질화기(그림 1)
   1. 미리 계량된 골격근과 미리 측정된 정지 용액이 들어 있는 M형 튜브를 기계에 넣습니다. 각 샘플을 두 번 균질화하고(가장 파괴적인 균질화 주기로 설정) 각 균질화 직후 튜브를 얼음 위에 놓고 5분 동안 냉각시킵니다.
   2. 2,000 × g 및 4 ° C에서 5 분 동안 잠시 원심 분리합니다. 전체 튜브를 얼음 위에 다시 놓고 적절한 양의 메탄올(≥ 99.9%, 조직 무게의 10배)을 추가합니다. 15 초 동안 철저히 소용돌이.
      참고: 20mg의 조직에는 200μL의 메탄올을 사용하십시오. 메탄올은 조직 균질액으로부터 단백질을 침전시키는데 사용되며, 화학발광법을 방해하지 않는다. 다른 단백질 침전 방법을 사용하는 경우 화학 발광과의 상용성을 테스트하십시오.
   3. 한 번 더 균질화하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 샘플을 4°C 및 3,500× g에서 35분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 아질산염/질산염 수준을 측정하거나 나중에 사용하기 위해 -80°C에서 보관하십시오.
2. 비드 균질화기(그림 2)
   1. 골격근 조직을 비드 함유 튜브(조직에 대한 1:5 비율:희석된 정지 용액)에 넣고 사용된 기기에서 사용할 수 있는 최고 속도로 45초 동안 두 번 균질화합니다. 각 균질화 직후 튜브를 얼음 위에 놓고 5분 동안 식힙니다.
   2. 소형 데스크탑 원심분리기(2,000 x g)를 사용하여 5초 동안 간단히 원심분리합니다. 튜브를 얼음 위에 다시 놓고 적절한 양의 메탄올(순도 ≥ 99.9%, 조직 중량의 10배)을 추가합니다. 15 초 동안 철저히 소용돌이.
      참고 1: 20mg의 조직에는 200μL의 메탄올을 사용하십시오.
      참고 2: 메탄올은 조직 균질액으로부터 단백질을 침전시키는 데 사용되며 화학발광 방법을 방해하지 않습니다. 다른 단백질 침전 방법을 사용하는 경우 화학 발광과의 상용성을 테스트하십시오.
   3. 사용된 기기에서 사용할 수 있는 최고 속도로 45초 동안 한 번 더 균질화합니다. 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 17,000 x g, 4 °C, 30분에서 원심분리기 상청액을 흡인하고 아질산염/질산염 수준을 측정하거나 나중에 사용하기 위해 -80°C에서 보관하십시오.
3. 분쇄기(그림 3)
   1. 희석 된 정지 용액 (조직 무게의 5 배)이 들어있는 튜브를 준비하고 무게를 잰다. 무게 (튜브 + 정지 용액)를 기록하십시오.
   2. 액체 질소 분쇄기 도구를 드라이 아이스에 놓고 원하는 온도에 도달 할 때까지 약 30 분 동안 기다립니다.
   3. 액체 질소로 식힌 핀셋을 사용하여 하나의 샘플 (이미 측정 된 조직 중량)을 분쇄기로 옮깁니다. 조직이 액체 질소 온도에 있는지 확인하기 위해 작은 숟가락의 액체 질소를 추가하십시오.
   4. 액체 질소의 95 %가 기화 된 후 분쇄 도구를 조직 위에 놓고 단단히 누릅니다. 샘플 호감을 느껴야합니다. 망치를 사용하여 분쇄 도구를 3-5 번 치십시오.
   5. 액체 질소로 냉각된 숟가락을 사용하여 샘플에 남아 있는 덩어리가 있는지 확인합니다. 액체 질소에서 식힌 후 티슈를 만지기 전에 티슈 페이퍼를 사용하여 얼어붙은 물을 닦아냅니다. 덩어리가 있으면 중앙으로 옮긴 다음 망치로 5-6 번 더 치십시오.
   6. 전체 샘플이 분쇄되면 액체 질소 냉각 스푼을 사용하여 분쇄 된 조직을 희석 된 정지 용액이 들어있는 사전 칭량 튜브로 직접 옮깁니다 (단계 3.3.1). 분쇄 된 골격근이 가열되면 끈적 거리고 옮기기가 어려우므로이 단계를 신속하게 수행하십시오.
   7. 15 초 동안 소용돌이. 튜브를 열어 튜브 상단에 붙어 있는 조직이 없는지 확인하십시오. 있는 경우 제거한 다음 다시 소용돌이를 시도하십시오.
   8. 작은 데스크탑 원심 분리기를 사용하여 샘플을 2-3 초 동안 원심 분리합니다. 튜브의 무게를 다시 잰다. 이 새 무게에서 원래 튜브 무게(단계 3.3.1)를 공제하여 조직 무게를 계산합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
      알림: 정확한 무게는 정확한 조직 무게와 분쇄 중에 손실된 조직의 양을 결정하는 데 도움이 됩니다.
   9. 모든 샘플이 3.3.8 단계까지 처리되면 적절한 부피의 메탄올을 첨가합니다 (≥ 99.9 %, 조직 중량의 10 배). 15 초 동안 완전히 소용돌이하고 30 분 동안 얼음에서 배양합니다.
      참고: 20mg의 조직에는 200μL의 메탄올을 사용하십시오. 메탄올은 조직 균질액으로부터 단백질을 침전시키는데 사용되며, 화학발광법을 방해하지 않는다. 다른 단백질 침전 방법을 사용하는 경우 화학 발광과의 상용성을 테스트하십시오.
   10. 17,000 × g, 4 °C, 30 분에서 원심 분리. 상청액을 흡입하고 아질산염/질산염 수준을 측정하거나 나중에 사용할 수 있도록 -80°C에서 보관하십시오.

4. 산화질소 분석기(NOA)를 사용한 아질산염/질산염 측정

1. 위에서 설명한 세 가지 균질화 방법 중 하나로 모든 샘플을 준비하고 질산염 및 아질산염 측정을 위해 NOA에 주입합니다.
   참고: NOA 사용에 대한 자세한 프로토콜은 이전에¹⁹에 게시되었습니다.

결과

대표적인 결과를 얻기 위해, 8마리의 Wistar 쥐(수컷 및 암컷, 체중 250 ± 50g)로부터의 골격근 조직을 사용하였다. 래트 골격근 균질물(각 방법에 대해 대둔근 50mg)을 3개의 상이한 균질화 도구(회전 균질화기, 비드 균질화기 및 분쇄기)에 의해 제조하였다. 그런 다음 이러한 균질액의 질산염 및 아질산염 함량을 산화질소 분석기(NOA)를 사용하여 측정했습니다(그림 4). 이 세 가지 ?...

토론

생리적 개입의 기능으로 NO 대사 산물, 질산염 및 아질산염의 변화를 모니터링하려면 신진 대사에 중요한 여러 기관에서 이러한 이온의 수준을 측정하는 것이 필수적입니다. 혈액 내의 헤모글로빈은 NO 및 그 대사 산물과 반응하므로 가능한 한 조직 샘플에서 혈액을 신속하게 제거하는 것도 중요합니다. 따라서 골격근 조직 (대둔근, TA, EDL, 비복근)을 수집하기 전에 동물을 식염수로 관류시키고 표?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
gentle MACS M tube	Miltenyi Biotec	130-093-236	Length: 87 mm; Diameter: 30 mm
Heparin Sodium	Hospira	NDC-0409-7620-13
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
Methanol	Sigma	646377
Minilys bead homogenizer	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
Nitric Oxide analyzer	GE	Sievers NOA 280i
NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol	Sigma	74385
Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
Precellys lysing kit	Bertin Instruments	P000911-LYSK0-A	contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization
Pulverizer kit	Cellcrusher	Cellcrusher kit