JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تعد القدرة على الكشف بدقة عن مكونات التقاطع العصبي العضلي أمرا حاسما في تقييم التعديلات في هندسته المعمارية بسبب العمليات المرضية أو التنموية. هنا نقدم وصفا كاملا لطريقة مباشرة للحصول على صور عالية الجودة من تقاطعات الأعصاب العضلية جبل كامل التي يمكن استخدامها لأداء القياسات الكمية.

Abstract

التقاطع العصبي العضلي (NMJ) هو نقطة اتصال متخصصة بين العصب الحركي والعضلات الهيكلية. هذا المشبك الطرفية معارض عالية اللدونة مورفولوجية ووظيفية. في العديد من اضطرابات الجهاز العصبي ، NMJ هو هدف مرضي مبكر يؤدي إلى فشل التضمين العصبي والضعف والضمور وحتى في موت ألياف العضلات. ونظرا لأهميتها، فإن إمكانية تقييم جوانب معينة من العلاقة بين مكونات NMJ من الناحية الكمية يمكن أن تساعد على فهم العمليات المرتبطة بتجميعها/تفكيكها. العقبة الأولى عند العمل مع العضلات هو الحصول على الخبرة التقنية لتحديد وتشريح بسرعة دون الإضرار أليافها. ويتمثل التحدي الثاني في استخدام أساليب كشف عالية الجودة للحصول على صور NMJ التي يمكن استخدامها لإجراء تحليل كمي. تقدم هذه المقالة بروتوكول خطوة بخطوة لتشريح العضلات الرقمية الملحقة وعضلات سولوس من الفئران. كما أنه يفسر استخدام immunofluorescence لتصور العناصر قبل وبعد متشابك من NMJs جبل كامل. النتائج التي تم الحصول عليها تثبت أن هذه التقنية يمكن استخدامها لتحديد التشريح المجهري للتشابك وتحديد التغيرات الطفيفة في حالة بعض مكوناته في ظل ظروف فسيولوجية أو مرضية.

Introduction

تقاطع الثدييات العصبية والعضلية (NMJ) هو المشبك الثلاثي الكوليني كبيرة تتكون من نهاية العصب العصبي الحركي, غشاء postynaptic على ألياف العضلات الهيكل العظمي, ومحطة خلايا شوان1,2,3. هذا المشبك معارض عالية اللدونة المورفولوجية والوظيفية4،5،6،7،8، حتى خلال مرحلة البلوغ عندما NMJs يمكن أن تخضع لتعديلات هيكلية ديناميكية. على سبيل المثال، أظهر بعض الباحثين أن النهايات العصبية الحركية تغير شكلها باستمرار على مقياس ميكرومتر9. كما أفيد أن مورفولوجيا NMJ يستجيب لمتطلبات وظيفية، تغيير الاستخدام، والشيخوخة، وممارسة، أو الاختلافات في النشاط الحركي4،10،11،12،13،14،15. وهكذا، فإن التدريب وعدم الاستخدام يمثلان حافزا أساسيا لتعديل بعض خصائص NMJ، مثل حجمها وطولها وتشتت الحويصلات المتشابكة والمستقبلات، وكذلك محطةالأعصاب المتفرعة14و16و17و18و19و20.

وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن أي تغيير هيكلي أو انحطاط هذا التقاطع الحيوي يمكن أن يؤدي إلى موت الخلايا العصبية الحركية وضمور العضلات21. ويعتقد أيضا أن تغيير الاتصال بين الأعصاب والعضلات يمكن أن تكون مسؤولة عن التغيرات الفسيولوجية NMJ المرتبطة بالعمر وربما لتدميرها في الحالات المرضية. التفكيك تقاطع العصبية والعضلية يلعب دورا حاسما في بداية التصلب الجانبي الضموري (ALS), مرض تنكسي عصبي يشكل واحدا من أفضل الأمثلة على ضعف التفاعل بين العضلات والأعصاب3. على الرغم من العديد من الدراسات التي أجريت على خلل الخلايا العصبية الحركية, لا يزال موضع نقاش ما إذا كان التدهور لوحظ في ALS يحدث بسبب الضرر المباشر في الخلايا العصبية الحركية ومن ثم يمتد إلى توقعات القشرية الشوكي22; أو إذا كان ينبغي أن يعتبر اعتلال الاكسونوتاتي البعيدة حيث يبدأ الانحطاط في النهايات العصبية ويتقدم نحو الخلايا العصبية الحركية سوماس23,24. نظرا لتعقيد أمراض ALS ، فمن المنطقي النظر في حدوث مزيج من العمليات المستقلة. وبما أن NMJ هو اللاعب المركزي للتفاعل الفيزيولوجي بين العضلات والأعصاب ، فإن زعزعة استقراره تمثل نقطة محورية في أصل المرض الذي هو ذات صلة ليتم تحليلها.

يتم تنظيم نظام الثدييات العصبي العضلي وظيفيا في وحدات حركية منفصلة ، تتكون من خلية عصبية محركية وألياف العضلات التي يتم تنشيطها حصريا من خلال محطتها العصبية. كل وحدة المحرك والألياف مع خصائص هيكلية مماثلة أو متطابقةوظيفية 25. الخلايا العصبية الحركية التوظيف الانتقائي يسمح تحسين استجابة العضلات لمطالب وظيفية. الآن من الواضح أن عضلات الهيكل العظمي الثديية تتكون من أربعة أنواع مختلفة من الألياف. يتم تسمية بعض العضلات وفقا لخصائص نوع الألياف الأكثر وفرة. على سبيل المثال، السولوس (عضلة خلفية للطرف الخلفي المشاركة في الحفاظ على وضع الجسم) يحمل غالبية وحدات الارتعاش البطيء (النوع 1) ومعترف به كعضلات بطيئة. بدلا من ذلك، يتكون الطول الرقمي المموه (EDL) بشكل أساسي من وحدات ذات خصائص ارتعاش سريع مماثلة (ألياف من النوع 2) ويعرف باسم عضلة سريعة متخصصة في الحركات التدريجية اللازمة للحركة. وبعبارة أخرى، على الرغم من أن عضلات البالغين هي من البلاستيك في الطبيعة بسبب التأثيرات الهرمونية والعصبية، وتكوين الألياف يحدد القدرة على أداء أنشطة مختلفة، كما رأينا في الوحيد الذي يواجه النشاط المستمر منخفضة الكثافة وEDL الذي يظهر ارتعاش واحد أكثر سرعة. ترتبط الميزات الأخرى التي هي متغيرة بين أنواع مختلفة من ألياف العضلات لهيكلها (محتوى الميتوكوندريا، وتمديد reticulum الساركوبلازمي، سمك خط Z)، محتوى MYOSIN ATPase، وتكوين سلسلة ثقيلة myosin26،27،28،29.

بالنسبة للقوارض NMJs ، هناك اختلافات كبيرة بين العضلات28،29. كشفت التحليلات المورفومترية التي أجريت في سولوس وEDL من الفئران عن وجود علاقة إيجابية بين منطقة متشابك وقطر الألياف (أي أن منطقة متشابك في الألياف البطيئة الوحيدة أكبر مما كانت عليه في ألياف EDL السريعة) ولكن النسبة بين منطقة NMJ وحجم الألياف متشابهة في كلتا العضلتين30و31. أيضا، فيما يتعلق المحطات العصبية، كانت المناطق المطلقة endplate في ألياف النوع 1 أقل مما كانت عليه في ألياف النوع 2، في حين أن تطبيع قطر الألياف جعل مناطق من المحطات العصبية في نوع 1 الألياف أكبر32.

ومع ذلك، تركز دراسات قليلة جدا على التحليل المورفومتري لإظهار الأدلة على التغيرات في بعض مكونات NMJ33،34. وبالتالي ، نظرا لأهمية NMJ في وظيفة الكائن الحي ، الذي يتم تغيير مورفولوجيا وعلم وظائف الأعضاء في أمراض مختلفة ، من المهم تحسين بروتوكولات التشريح لأنواع مختلفة من العضلات بجودة كافية للسماح بتصور هيكل NMJ بأكمله. ومن الضروري أيضا لتقييم حدوث تغييرات قبل أو postynaptic في حالات تجريبية مختلفة أو ظروف مثل الشيخوخة أوممارسة 35،36،37،38. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون من المفيد أن الأدلة على تعديلات أكثر دهاء في مكونات NMJ مثل الفوسفور العصبي المتغيرة في النهايات العصبية الطرفية كما ورد في ALS39.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للقانون الوطني رقم 18611 لرعاية الحيوانات المستخدمة لأغراض تجريبية. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل اللجنة الأخلاقية المؤسسية (CEUA IIBCE، البروتوكول رقم 004/09/2015).

1. تشريح العضلات (اليوم 1)

ملاحظة: قبل البدء، قم بإجراء 40 مل من 0.5٪ بارافورمالديهايد (PFA)، درجة الحموضة 7.4 في ملحي الفوسفات في دولبيكو (DPBS). اختياريا، وجعل 20 مل من PFA 4٪. إعداد 5 مل aliquots وتجميد في -20 درجة مئوية. في يوم تشريح، تذويب a 4٪ aliquot وإضافة 35 مل من DPBS للحصول على 40 مل من 0.5٪ PFA.

  1. عزل EDL (العضلات سريعة الارتعاش)
    1. قتل فأر ضع الحيوان مع البطن التي تواجه صعودا. إجراء شق أولي باستخدام شفرة جراحية بين أصابع الساقين نحو الطرف الخلفي.
      ملاحظة: في هذه الحالة، حقن داخل الصفاق من 90:10 ملغم/ كغ كيتامين: أعطيت xylazine للقتل الرحيم الجرذ، ولكن يسمح أيضا خيارات أخرى للتخدير.
    2. قشر قبالة الجلد، وسحبه صعودا حتى يتم الكشف عن ركبة الفئران.
    3. للعثور على EDL، اتبع أوتار القدم حتى الرباط الحلقي. هذا الرباط يدور حول وترين. قطع الرباط بين الأوتار اثنين مع مقص uniband (أو ما شابه ذلك). تحديد وتر EDL عن طريق رفع كليهما واختيار واحد أن يجعل أصابع التحرك صعودا.
    4. قطع الوتر مع مقص أحادي النطاق. ثم، في حين عقد وتر مع ملاقط البيولوجية غرامة، تبدأ في فصل ببطء العضلات EDL من الأمامية الساق، وبريفيس peroneus، وبيرونيوس longus40 (انظر الشكل 1A).
      ملاحظة: تأكد من فصل العضلات دون أي ضرر. القيام بذلك عن طريق قطع بقية العضلات الجانبية لفتح مسار بينهما (EDL ليس لديها موقع سطحي) في حين عقد ورفع العضلات EDL.
    5. لعزل العضلات تماما، وقطع وتر تعلق على ركبة الفئران مع مقص uniband.
    6. تزج العضلات تشريح في 5 مل من 0.5٪ PFA وترك لمدة 24 ساعة في 4 درجة مئوية. اختياريا، تدبيس العضلات في قطعة من الورق المقوى وتحويلها مع العضلات التي تواجه أسفل. ثم تزج تماما في 8 مل من الحل المثبت. هذه الخطوة تساعد في الحفاظ على العضلات ممدود أثناء عملية التثبيت.
  2. عزل سوليوس (العضلات بطيئة الارتعاش)
    1. الوجه الحيوان (البطن تواجه الآن إلى أسفل). من خلال الجلد، وقطع وتر كالكانيكال باستخدام شفرة الجراحية.
    2. مع مساعدة من ملاقط البيولوجية ومقص uniband، فصل العضلات gastrocnemius من العظام، وخلق "غطاء العضلات". سوف يكون الوحيد على الجانب الداخلي من الغطاء العضلي. يمكن التعرف عليه لأنه أحمر اللون ويحتوي على مورفولوجيا مسطحة.
    3. مع زوج من الملاقط البيولوجية، والوصول إلى ورفع وتر الوحيد الذي يقع فوق gastrocnemius (انظر الشكل 1B).
    4. قطع الوتر مع مقص أحادي النطاق. رفع العضلات كلها مع قطع بعض نقاط التعلق ضعيفة (أي عناصر الأوعية الدموية العصبية). وأخيرا، لتحرير العضلات الوحيدة تماما، وقطع اللفافة الوحيدة التي تشكل وتر كالكانيال مع مقص uniband.
    5. كرر الخطوة 1.1.6 لإصلاح العضلات الوحيدة تشريح.

2. إعداد الألياف مثار (اليوم 2)

  1. بعد 24 ساعة من التثبيت، شطف العضلات مع 6 مل من حل DPBS 3x لمدة 10 دقيقة لكل منهما قبل عزل ألياف العضلات.
  2. لعزل الألياف، ضع عضلة على شريحة المجهر. باستخدام مجسم، عقد بلطف واحدة من الأوتار مع زوج واحد من الملاقط البيولوجية. ثم، مع ملاقط البيولوجية الأخرى، تبدأ قرصة وتر ببطء لفصل ألياف العضلات. بعد ذلك سحب ببطء الأنسجة مقروص صعودا نحو وتر العضلات المعاكس. سيكون من الضروري تكرار هذا الإجراء عدة مرات حتى الحصول على حزم صغيرة ومعزولة متعددة.
  3. وضعها بعناية على شريحة المعالجة مسبقا (silanized). فمن الضروري للحفاظ على جميع الألياف من أجل حتى لا تتداخل. عند هذه النقطة، الهواء الجاف الألياف لمدة 24 ساعة.

3. الفلورة المناعية

  1. حضانة الأجسام المضادة الأولية (اليوم الثالث)
    ملاحظة: تم تنفيذ كافة الخطوات في درجة حرارة الغرفة، إلا إذا ذكر خلاف ذلك. الطريقة الأكثر فعالية لإزالة الحلول المختلفة دون فصل الألياف من الشريحة هي استخدام حقنة الأنسولين.
    1. لبدء عملية التخسين المناعي، قم بتطويق ألياف العضلات المعزولة المجففة بقلم عنق الرحم لإنشاء حاجز مقاوم للماء.
    2. لترطيب ألياف العضلات، أضف 200 ميكرولتر من الماء المقطر لمدة 5 دقائق، ثم قم بتغيير الماء إلى 200 ميكرولتر من DPBS لاحتضان 5 دقائق القادمة. عند هذه النقطة، بدء وضع العلامات immunofluorescence.
    3. احتضان الألياف مع 300 ميكرولتر من العازلة حجب (BB) التي تحتوي على 50 مل الجليسين، 1٪ جيش استقلال البحرين، و 1٪ تريتون X-100 لمدة 30 دقيقة.
    4. استبدال BB مع الأجسام المضادة الأولية بتركيز اقترحه المصنعون. استخدام BB لتمييع الأجسام المضادة. استخدمت هذه التجربة 400 ميكرولتر من SMI 32 أو SMI 31 التي تعرفت على الترميز العصبي غير الفوسفوري (Nf) أو الفوسفوريلات (Phos-Nf) H في 1/800 تخفيف للكشف عن مكون NMJ presynaptic.
      ملاحظة: عند اتخاذ قرار للتعرف على عنصر presynaptic كله بدلا من تقييم الفوسفور العصبي, اختيار الأجسام المضادة ضد المشبك, synaptophysin أو SV2a التي كانت تستخدم بنجاح سابقا.
    5. احتضان الألياف مع تخفيف الأجسام المضادة الأولية في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها (اختياريا، يمكن إجراء الحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة). في كلتا الحالتين، سيكون من المهم إجراء الحضانة باستخدام غرفة رطبة.
  2. الفلورة المناعية: حضانة الأجسام المضادة الثانوية (اليوم الرابع)
    1. إزالة الأجسام المضادة الأساسية وشطف الألياف 3x لمدة 10 دقيقة لكل منها مع 500 ميكرولتر من DPBS وآخر مرة مع BB.
    2. إزالة هذا الغسيل الأخير وإضافة الأجسام المضادة الثانوية المسمى fluorescently المخفف في BB. لهذه التجربة، تم استخدام 500 ميكرولتر من الماعز المضادة للفأرة اليكسا فلور 488 في 1/1000 تخفيف في BB. لعرض عنصر ما بعد متشابك من NMJs، 1:300 α-Bungarotoxin (Btx) البيوتين العشرين تم إضافة اقتران إلى تخفيف الأجسام المضادة الثانوية.
      ملاحظة: إضافة BTX-biotin XX يسمح أفضل إشارة إلى الضوضاء الصور مرة واحدة الكشف مع streptavidin أن تضخيم الإشارة. بالإضافة إلى ذلك، أدى اقتران الستريبتافيدين بالفلوروفوريس المختلفة إلى زيادة تركيبات الألوان في مقايسات الوسم المشترك. بدلا من ذلك ، يسمح Btx المسمى الفلوري بالحصول على صور ذات جودة مماثلة.
    3. احتضان الأجسام المضادة الثانوية و Btx لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو 1 ساعة في 37 درجة مئوية محمية من الضوء.
    4. إزالة الأجسام المضادة الثانوية وBtx. غسل 3x لمدة 10 دقيقة لكل مع 500 ميكرولتر من DPBS وشطف الماضي مع BB.
    5. احتضان مع 500 ميكرولتر من ستريبتافيدين اليكسا فلور 555 في تخفيف 1/1000 مع BB لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. عند هذه النقطة، إذا رغبت في ذلك، إضافة مسبار إلى مضادالنوى، مثل diaminophenylindole بتركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / مل.
    6. إزالة محلول الحضانة وغسل الألياف 3x لمدة 10 دقيقة لكل منها مع 500 ميكرولتر من DPBS. ثم، جبل الألياف.
  3. تصاعد
    1. ضع 4 نقاط من طلاء الأظافر الشفاف على شريحة المجهر كما لو كانت رؤوس مربع. السماح لهم الجافة 1-2 دقيقة. وستكون هذه هي النقاط التي سوف تقع coverslips ، مما يساعد على تجنب سحق الأنسجة.
    2. إزالة غسل DPBS الماضي وإضافة ما يكفي من وسائل الإعلام تصاعد (~ 200 ميكرولتر) لتغطية الألياف. تجنب التجفيف.
      ملاحظة: لإعداد 10 مل من مزيج الوسائط المتصاعدة، استخدم Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: الجلسيرول في 4:1 (v:v).
    3. استخدام تلميح ماصة 200 ميكرولتر لنشر بعناية وسائل الإعلام المتصاعدة على الألياف لضمان الغمر الكامل لهم جميعا. قبل وضع الزجاج الغطاء، وإزالة فقاعات الهواء.
    4. ضع الغطاء على العينات في محاولة لمنع توليد فقاعات الهواء. ويمكن القيام بهذه الحركة بمساعدة ملقط.

4. التحليل المجهري والمورفومتري

  1. صورة الاستعدادات الألياف مثار باستخدام المجهر كونفوج الليزر.
  2. خذ سلسلة من المقاطع البصرية (30 ميكرومتر Z مكدسات) عبر المشبك بأكمله باستخدام فاصل زمني واحد ميكرومتر. لتعيين المكدس، استخدم إشارة Btx. صورة على الأقل 15-20 NMJs لكل حالة عضلة مع 2048 بكسل × 2048 بكسل القرار. وقد اختيرت هذه الطريقة للحصول على صور ذات جودة بصرية ودقة كافية للتحليل المورفومتري.
  3. لإجراء القياسات، استخدم صور الإسقاط للمداخن مع أي برنامج تحليل.
    ملاحظة: على الرغم من أن التحليل المورفومتري وأوضح تم القيام به يدويا، وهناك نوعان من الأدوات التي وضعت مؤخرا صورة J المستندة إلى لدراسة العديد من الجوانب المختلفة من قبل وما بعد متشابك NMJ مورفولوجيا33،34.
  4. للحصول على قيم منطقة NMJ الإجمالية، حدد الحدود الخارجية (المخطط الخارجي للمنطقة الملطخة، راجع الشكل 2)من اللوحة النهائية باستخدام أداة Photoshop Magnetic lasso وحدد عدد وحدات البكسل المحددة في إطار الرسم البياني. ثم، يمكن تحويل مناطق البكسل إلى ميكرومتر مربع باستخدام المقياس المحدد من قبل البرنامج confocal.
  5. باستخدام نفس أداة lasso، حدد الحدود الداخلية (الخطوط العريضة للمنطقة الملطخة داخل اللوحة النهائية، انظر الشكل 2)وحدد المنطقة غير الملطخة في الهيكل بأكمله (أو المنطقة الفارغة) كما هو مفصل أعلاه (الخطوة 4.4).). سيتم الحصول على قيم منطقة Postynaptic بعد طرح المساحة الإجمالية من المساحة الفارغة لكل NMJ.
  6. الحصول على منطقة Presynaptic، التي تعرف بأنها المنطقة مع مكافحة الفلورة المناعية neurofilament، بطريقة مماثلة أن منطقة مجموع NMJ.
    ملاحظة: تم استخدام كافة هذه المعلمات لتحديد مؤشر الكثافة بعد متشابك (منطقة Postynaptic / منطقة إجمالي) وتغطية NMJ (منطقة Presynaptic / منطقة Postynaptic). مؤشر كثافة Postynaptic أعلى يعني لوحة نهاية أكثر كثافة - أو أكثر إحكاما - ، في حين أن تغطية NMJ أصغر يعكس تفاعلا أقل بكثير بين محطة الأعصاب ولوحة النهاية (كلاهما متوافق مع عملية إزالة الحبر). في الحالة الموضحة هنا ، منذ أن تم اكتشاف أشكال فوسفورية وغير فوسفورية من الفلترات العصبية على مستوى محطة الأعصاب ، تم حساب نسبة الإشارة الفوسفورية / غير الفوسفورية presynaptic ونسبة التغطية الفوسفورية / غير الفوسفورية.

النتائج

يقدم هذا البروتوكول طريقة مباشرة لعزل ألياف العضلات والحصول على المناعة من نوعين مختلفين من العضلات (عضلات سريعة وبطيئة الارتعاش ، انظر الشكل 1). باستخدام العلامات الصحيحة و / أو المسابير ، يمكن الكشف عن مكونات NMJ وتقييمها منذ وجهة نظر كمية لتقييم بعض التغيرات المورفولوجية ...

Discussion

في هذه المقالة، نقدم بروتوكول مفصل لتشريح اثنين من عضلات الهيكل العظمي الفئران (واحد بطيء الارتعاش والآخر سريع نشل)، عزل العضلات الألياف والكشف عن المناعة من علامات ما قبل وما بعد متشابك لتقييم كميا التغييرات NMJ فضلا عن عمليات التجميع / تفكيك. هذا النوع من البروتوكول يمكن أن تكون مفيدة في ن...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

شكرا جزيلا ل CSIC و PEDECIBA على الدعم المالي المقدم لهذا العمل. إلى ناتاليا روسانو لتصحيحاتها المخطوطة؛ إلى مارسيلو Casacuberta الذي يجعل الفيديو ونيكولاس بولاتو لإعارة صوته لذلك.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Stereomicroscope with cool light illuminationNikonSMZ-10A
Rocking platformBiometra (WT 16)042-500
Cover glasses (24 x 32 mm)DeltalabD102432
Premium (Plus) microscope slidesPORLABPC-201-16
TweezersF.S.T11253-20
Uniband LA-4C Scissors 125mmE.M.S77910-26
Disponsable surgical blades #10Sakira Medical1567
Disponsable sterile syringe (1 ml)Sakira Medical1569
Super PAP penE.M.S71310
100 μl or 200 μl pipetteFinnpipette9400130
Confocal microscopeZeissLSM 800 - AiryScan
NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H ratsTaconic2148-M
1X PBS (Dulbecco)Gibco21600-010
ParaformaldehydeSigma158127
Triton X-100SigmaT8787
GlycineAmresco167
BSABio Basic INC.9048-46-8
GlycerolMallinckrodt5092
TrisAmresco497
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated AntibodyBioLegend801601Previously Covance # SMI 31P
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated AntibodyBioLegend801701Previously Covance # SMI-32P
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L)Thermo ScientificA11029
α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugateInvitrogenB1196
Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugateInvitrogenS32355
Diaminophenylindole (DAPI)SigmaD8417

References

  1. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
  2. Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction. Neuron. 21, 847-855 (1998).
  3. Cappello, V., Francolini, M. Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).
  4. Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions. Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).
  5. Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ. Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).
  6. Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training. Neuroscience. 190, 56-66 (2011).
  7. Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).
  8. Arnold, A. -. S., et al. Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α. Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).
  9. Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice. Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).
  10. Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse. Brain Research. 248, 382-386 (1982).
  11. Rosenheimer, J. L. Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture. Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).
  12. Andonian, M. H., Fahim, M. A. Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing. Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).
  13. Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat. Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).
  14. Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology. Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).
  15. Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).
  16. Andonian, M. H., Fahim, M. A. Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction. International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).
  17. Fahim, M. A. Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL\6N in ageing mice. Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).
  18. Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles. Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).
  19. Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle. Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).
  20. Deschenes, M. R., et al. Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology. Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).
  21. Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication. Cells. 8 (8), 906-921 (2019).
  22. Braak, H., et al. Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread. Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).
  23. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).
  24. Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).
  25. Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. Human skeletal muscle fiber type classifications. Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).
  26. Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
  27. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  28. Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions. Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).
  29. Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), 160240 (2016).
  30. Waerhaug, O., Lømo, T. Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles. Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).
  31. Wood, S. J., Slater, C. R. The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles. Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).
  32. Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).
  33. Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).
  34. Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models. bioRxiv. , (2020).
  35. Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments. (135), e57482 (2018).
  36. Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents. Journal of Visualized Experiments. (91), e51948 (2014).
  37. Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments. (71), e4460 (2013).
  38. Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments. (83), e51162 (2014).
  39. Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS. Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).
  40. Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle. Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).
  41. Cipriani, S., et al. Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C. International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072 (2018).
  42. Boido, M., Vercelli, A. Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy. Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).
  43. Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -. C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174 digitorum longus immunofluorescence

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved