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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La capacità di rilevare con precisione i componenti della giunzione neuromuscolare è fondamentale per valutare le modifiche nella sua architettura a causa di processi patologici o di sviluppo. Qui presentiamo una descrizione completa di un metodo semplice per ottenere immagini di alta qualità di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero che possono essere utilizzate per eseguire misurazioni quantitative.

Abstract

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è un punto di contatto specializzato tra il nervo motorio e il muscolo scheletrico. Questa sinapsi periferica presenta un'elevata plasticità morfologica e funzionale. In numerosi disturbi del sistema nervoso, nmj è un bersaglio patologico precoce con conseguente fallimento della neurotrasmissione, debolezza, atrofia e persino nella morte delle fibre muscolari. A causa della sua rilevanza, la possibilità di valutare quantitativamente alcuni aspetti della relazione tra i componenti NMJ può aiutare a comprendere i processi associati al suo assemblaggio / smontaggio. Il primo ostacolo quando si lavora con i muscoli è quello di acquisire l'esperienza tecnica per identificare e sezionare rapidamente senza danneggiare le loro fibre. La seconda sfida consiste nell'utilizzare metodi di rilevamento di alta qualità per ottenere immagini NMJ che possono essere utilizzate per eseguire analisi quantitative. Questo articolo presenta un protocollo passo-passo per sezionare i muscoli extensor digitorum longus e soleus dai ratti. Spiega anche l'uso dell'immunofluorescenza per visualizzare elementi pre e postinaptici di NMJs a montaggio intero. I risultati ottenuti dimostrano che questa tecnica può essere utilizzata per stabilire l'anatomia microscopica della sinapsi e identificare sottili cambiamenti nello stato di alcuni dei suoi componenti in condizioni fisiologiche o patologiche.

Introduzione

La giunzione neuromuscolare del mammifero (NMJ) è una grande sinapsi tripartita colinergica composta dalla terminazione nervosa del motoneurone, dalla membrana postssinaptica sulla fibra muscolare scheletrica e dalle cellule terminali di Schwann1,2,3. Questa sinapsi presenta un'elevata plasticità morfologica e funzionale4,5,6,7,8,anche durante l'età adulta quando gli MN possono subire modifiche strutturali dinamiche. Ad esempio, alcuni ricercatori hanno dimostrato che le terminazioni nervose motorie cambiano continuamente la loro forma alla scala micrometrica9. È stato anche riferito che la morfologia della NMJ risponde a requisiti funzionali, uso alterato, invecchiamento, esercizio fisico o variazioni nell'attivitàlocomotoria 4,10,11,12,13,14,15. Pertanto, l'allenamento e la mancanza di utilizzo rappresentano uno stimolo essenziale per modificare alcune caratteristiche della NMJ, come le sue dimensioni, lunghezza, dispersione di vescicole sinaptiche e recettori, così come la ramificazione terminalenervosa 14,16,17,18,19,20.

Inoltre, è stato dimostrato che qualsiasi cambiamento strutturale o degenerazione di questa giunzione vitale potrebbe causare la morte delle cellule dei motoneuroni e l'atrofiamuscolare 21. Si pensa anche che la comunicazione alterata tra nervi e muscoli potrebbe essere responsabile dei fisiologici cambiamenti di NMJ legati all'età e possibilmente della sua distruzione in stati patologici. Lo smantellamento della giunzione neuromuscolare gioca un ruolo cruciale nell'insorgenza della sclerosi laterale amiotrofica (SLA), una malattia neurodegenerativa che costituisce uno dei migliori esempi di interazione muscolo-nervosa compromessa3. Nonostante i numerosi studi condotti sulla disfunzione dei motoneuroni, si discute ancora se il deterioramento osservato nella SLA si verifichi a causa del danno diretto al motoneurone e poi si estenda alle proiezioni cortico-spinali22; o se deve essere considerato come un'assonopatia distale in cui la degenerazione inizia nelle terminazioni nervose e progredisce verso il somasdel motoneurone 23,24. Data la complessità della patologia della SLA, è logico considerare che si verifica un mix di processi indipendenti. Poiché nmj è il protagonista dell'interazione fisiopatologica tra muscolo e nervo, la sua destabilizzazione rappresenta un punto cardne dell'origine della malattia che è rilevante per essere analizzata.

Il sistema neuromuscolare dei mammiferi è funzionalmente organizzato in unità motorie discrete, costituite da un motoneurone e dalle fibre muscolari che sono esclusivamente innervate dal suo terminale nervoso. Ogni unità motore ha fibre con proprietà strutturali e funzionali simili o identiche25. Il reclutamento selettivo dei motoneuroni consente di ottimizzare la risposta muscolare alle esigenze funzionali. Ora è chiaro che i muscoli scheletrici dei mammiferi sono composti da quattro diversi tipi di fibre. Alcuni muscoli sono nominati in base alle caratteristiche del loro tipo di fibra più abbondante. Ad esempio, il soleo (un muscolo posteriore dell'arto posteriore coinvolto nel mantenimento della postura del corpo) porta la maggior parte delle unità a contrazione lenta (tipo 1) ed è riconosciuto come un muscolo lento. Invece, l'estensore digitorum longus (EDL) è essenzialmente composto da unità con proprietà simili a contrazione rapida (fibre di tipo 2) ed è noto come muscolo veloce specializzato per i movimenti fasici necessari per la locomozione. In altre parole, sebbene i muscoli adulti siano di natura plastica a causa delle influenze ormonali e neurali, la sua composizione in fibra determina la capacità di svolgere diverse attività, come si vede nel soleus che sperimenta un'attività continua a bassa intensità e L'EDL che mostra una singola contrazione più rapida. Altre caratteristiche che sono variabili tra i diversi tipi di fibre muscolari sono correlate alla loro struttura (contenuto mitocondriale, estensione del reticolo sarcoplasmatico, spessore della linea Z), contenuto di miosina ATPasi e composizione della catena pesante della miosina26,27,28,29.

Per i NMJ roditori, ci sono differenze significative tra imuscoli 28,29. Le analisi morfometriche eseguite in soleus ed EDL dai ratti hanno rivelato una correlazione positiva tra l'area sinaptica e il diametro delle fibre (cioè, l'area sinaptica nelle fibre lente soleus è maggiore che nelle fibre veloci EDL) ma il rapporto tra l'area NMJ e la dimensione della fibra è simile in entrambi imuscoli 30,31. Inoltre, in relazione ai terminali nervosi, le aree assolute della piastra terminale nelle fibre di tipo 1 erano inferiori rispetto alle fibre di tipo 2, mentre la normalizzazione per diametro delle fibre ha reso le aree dei terminali nervosi nelle fibre di tipo 1 lepiù grandi 32.

Tuttavia, pochissimi studi si concentrano sull'analisi morfometrica per mostrare l'evidenza dei cambiamenti in alcuni dei componentiNMJ 33,34. Pertanto, a causa della rilevanza della NMJ nella funzione dell'organismo, la cui morfologia e fisiologia sono alterate in varie patologie, è importante ottimizzare i protocolli di dissezione di diversi tipi di muscoli con qualità sufficiente a consentire la visualizzazione dell'intera struttura NMJ. È inoltre necessario valutare il verificarsi di cambiamenti pre o postinaptici in diverse situazioni o condizioni sperimentali come l'invecchiamento ol'esercizio fisico 35,36,37,38. Inoltre, può essere utile evidenzare alterazioni più sottili nei componenti NMJ come la fosforilazione del neurofilamento alterato nelle terminazioni nervose terminali come riportato nella SLA39.

Protocollo

Tutte le procedure animali sono state eseguite secondo le linee guida della legge nazionale n. 18611 per la cura degli animali utilizzati a fini sperimentali. Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale (CEUA IIBCE, Protocollo Numero 004/09/2015).

1. Dissezione muscolare (Giorno 1)

NOTA: Prima di iniziare, fare 40 mL di paraformaldeide (PFA) allo 0,5%, pH 7,4 nella soluzione salina fosfato di Dulbecco (DPBS). Opzionalmente, fare 20 mL del 4% di PFA. Preparare aliquote da 5 mL e congelare a -20 °C. Il giorno della dissezione, scongelare un'aliquota del 4% e aggiungere 35 mL di DPBS per ottenere 40 mL dello 0,5% di PFA.

  1. Isolamento dell'EDL (muscolo a contrazione rapida)
    1. Eutanasia di un topo. Posizionare l'animale con l'addome rivolto verso l'alto. Effettuare un'incisione iniziale utilizzando una lama chirurgica tra le dita dei piedi verso l'arto posteriore.
      NOTA: In questo caso, è stata somministrata un'iniezione intraperitoneale di 90:10 mg/Kg di chetamina:xirazina per eutanasiare il ratto, ma sono consentite anche altre opzioni di anestesia.
    2. Staccare la pelle, tirandolo verso l'alto fino a quando il ginocchio del ratto non è esposto.
    3. Per trovare l'EDL, seguire i tendini del piede fino al legamento anulare. Questo legamento circonda due tendini. Tagliare il legamento tra i due tendini con forbici uniband (o simili). Identificare il tendine EDL sollevando entrambi e scegliere quello che fa muovere le dita dei piedi verso l'alto.
    4. Tagliare il tendine con forbici uniband. Quindi, mentre si tiene il tendine con pinzette biologiche fini, iniziare a separare lentamente il muscolo EDL dal tibialis anteriore, dal peroneus brevis e dal peroneus longus40 (vedi figura 1A).
      NOTA: Assicurarsi che il muscolo sia separato senza alcun danno. Fallo tagliando il resto dei muscoli laterale per aprire un percorso tra di loro (l'EDL non ha una posizione superficiale) mentre si tiene e si solleva il muscolo EDL.
    5. Per isolare completamente il muscolo, tagliare il tendine attaccato al ginocchio del topo con forbici uniband.
    6. Immergere il muscolo sezionato in 5 mL dello 0,5% di PFA e lasciare per 24 ore a 4 °C. Facoltativamente, graffettare il muscolo in un pezzo di cartone e girarlo con il muscolo rivolto verso il basso. Quindi immergerlo completamente in 8 mL della soluzione fissante. Questo passaggio aiuta a mantenere il muscolo allungato durante il processo di fissazione.
  2. Isolamento del soleo (muscolo a contrazione lenta)
    1. Capovolgere l'animale (l'addome è ora rivolto verso il basso). Attraverso la pelle, tagliare il tendine calcaneale usando una lama chirurgica.
    2. Con l'aiuto delle pinzette biologiche e delle forbici uniband, separare il muscolo gastrocnemio dalle ossa, creando un "coperchio muscolare". Il soleo sarà sul lato interno del coperchio muscolare. Può essere identificato perché è di colore rosso e ha una morfologia piatta.
    3. Con un paio di pinzette biologiche, raggiungere e sollevare il tendine soleo che si trova sopra il gastrocnemio (vedi figura 1B).
    4. Tagliare il tendine con forbici uniband. Sollevare l'intero muscolo mentre si tagliano alcuni dei punti di attacco deboli (cioè gli elementi neurovascolari). Infine, per liberare completamente il muscolo soleo, tagliare il fasccle soleus che forma il tendine calcaneale con forbici uniband.
    5. Ripetere il passaggio 1.1.6 per fissare il muscolo soleo sezionato.

2. Preparazione della fibra presa in giro (Giorno 2)

  1. Dopo 24 ore di fissazione, sciacquare i muscoli con 6 mL di soluzione DPBS 3x per 10 minuti ciascuno prima di isolare le fibre muscolari.
  2. Per isolare le fibre, mettere un muscolo su uno scivolo al microscopio. Usando uno stereomicroscopio, tenere delicatamente uno dei tendini con una coppia di pinzette biologiche. Quindi, con le altre pinzette biologiche, inizia a pizzicare lentamente il tendine per separare le fibre muscolari. Dopo di che tirare lentamente il tessuto pizzicato verso l'alto verso il tendine muscolare opposto. Sarà necessario ripetere questa azione più volte fino a ottenere più piccoli fasci isolati.
  3. Posizionarli con cura su una diapositiva pretrattata (silanizzata). È necessario mantenere tutte le fibre in ordine in modo che non si sovrappongano. A questo punto, asciugare all'aria le fibre per 24 ore.

3. Immunofluorescenza

  1. Incubazione di anticorpi primari (Giorno 3)
    NOTA: Tutti i passaggi sono stati eseguiti a temperatura ambiente, tranne se altrimenti indicato. Il modo più efficiente per rimuovere le diverse soluzioni senza staccare le fibre dallo scivolo è utilizzare una siringa per insulina.
    1. Per iniziare il processo di immunostaining, circondare le fibre muscolari isolate essiccate con una pap pen per creare una barriera impermeabile.
    2. Per idratare le fibre muscolari, aggiungere 200 μL di acqua distillata per 5 minuti, quindi cambiare l'acqua a 200 μL di DPBS per la successiva incubazione di 5 minuti. A questo punto, avviare l'etichettatura dell'immunofluorescenza.
    3. Incubare le fibre con 300 μL di un tampone di blocco (BB) contenente glicina 50 mM, 1% BSA e 1% Tritone X-100 per 30 min.
    4. Sostituire BB con l'anticorpo primario a una concentrazione suggerita dai produttori. Utilizzare il BB per diluire l'anticorpo. Questo esperimento ha utilizzato 400 μL di SMI 32 o SMI 31 che riconoscevano il neurofilamento H non fosforilato (Nf) o fosforilato (Phos-Nf) a 1/800 diluizione per rilevare la componente presnaptica NMJ.
      NOTA: Quando decidi di riconoscere l'intero elemento presinattico invece di valutare la fosforilazione del neurofilamento, scegli gli anticorpi contro sinapsina, sinaptofisina o SV2a che sono stati precedentemente utilizzati con successo.
    5. Incubare le fibre con la diluizione dell'anticorpo primario a 4 °C durante la notte (facoltativamente, l'incubazione può essere eseguita a 37 °C per 1 h). In entrambi i casi, sarà importante eseguire l'incubazione utilizzando una camera umida.
  2. Immunofluorescenza: Incubazione anticorpale secondaria (Giorno 4)
    1. Rimuovere l'anticorpo primario e risciacquare le fibre 3 volte per 10 minuti ciascuna con 500 μL di DPBS e l'ultima volta con BB.
    2. Rimuovere quest'ultimo lavaggio e aggiungere l'anticorpo secondario etichettato fluorescentmente diluito in BB. Per questo esperimento, sono stati utilizzati 500 μL di capra anti-topo Alexa Fluor 488 a 1/1000 diluizione in BB. Per visualizzare l'elemento postssinattico dei NMJ, 1:300 α-Bungarotoxin (Btx) biotina-XX coniugato è stato aggiunto alla diluizione anticorpale secondaria.
      NOTA: L'aggiunta di Btx-biotina XX consente migliori immagini segnale-rumore una volta rilevate con streptavidina che amplifica il segnale. Inoltre, la coniugazione di streptavidina a diversi fluorofori ha aumentato le combinazioni di colori nei test di co-etichettatura. In alternativa, Btx con etichetta fluorescente consente di ottenere immagini di qualità simile.
    3. Incubare l'anticorpo secondario e il Btx per 2 ore a temperatura ambiente o 1 h a 37 °C protetto dalla luce.
    4. Rimuovere l'anticorpo secondario e il Btx. Lavare 3 volte per 10 minuti ciascuno con 500 μL di DPBS e l'ultimo risciacquo con BB.
    5. Incubare con 500 μL di Streptavidin Alexa Fluor 555 a 1/1000 diluizione con BB per 1 h a temperatura ambiente. A questo punto, se lo si desidera, aggiungere una sonda per controsostenere i nuclei, come il diaminofenillindolo ad una concentrazione finale di 1 μg/mL.
    6. Rimuovere la soluzione di incubazione e lavare le fibre 3 volte per 10 minuti ciascuna con 500 μL di DPBS. Quindi, montare le fibre.
  3. Montante
    1. Posizionare 4 punti di smalto trasparente sul vetrino del microscopio come se fossero i vertici di un quadrato. Lasciarli asciugare 1-2 minuti. Questi saranno i punti in cui i coprispalli riposeranno, aiutando ad evitare la frantumazione dei tessuti.
    2. Rimuovere l'ultimo lavaggio DPBS e aggiungere abbastanza supporti di montaggio (~ 200 μL) per coprire le fibre; evitare l'asciugatura.
      NOTA: Per preparare 10 mL del mix di supporti di montaggio, utilizzare Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: glicerolo in un 4:1 (v:v).
    3. Utilizzare una punta di pipetta da 200 μL per distribuire con cura i supporti di montaggio sulle fibre per garantire una completa immersione di tutti loro. Prima di posizionare il vetro di copertura, rimuovere le bolle d'aria.
    4. Posizionare il coverslip sui campioni cercando di prevenire la generazione di bolle d'aria. Questo movimento può essere fatto con l'aiuto di forcep.

4. Microscopia e analisi morfometrica

  1. Immagini i preparati in fibra presa in giro usando la microscopia confocale laser.
  2. Prendere una serie di sezioni ottiche (pile Z da 30 μm) attraverso l'intera sinapsi usando un intervallo di un micrometro. Per impostare lo stack, utilizzare il segnale Btx. Immagine di almeno 15-20 NMJ per ogni condizione muscolare con una risoluzione px x 2048 px 2048 2048. Questo metodo è stato scelto per ottenere immagini con qualità ottica e risoluzione sufficienti per l'analisi morfometrica.
  3. Per eseguire le misurazioni, utilizzare le immagini di proiezione delle pile con qualsiasi software di analisi.
    NOTA: Sebbene l'analisi morfometrica spiegata sia stata eseguita manualmente, esistono due strumenti basati su Image J recentemente sviluppati per studiare molti aspetti diversi della morfologia NMJ pre e postinaptica33,34.
  4. Per ottenere i valori dell'area NMJ totale, selezionate il bordo esterno (contorno esterno dell'area macchiata, vedere figura 2) della piastra finale utilizzando lo strumento lazo magnetico di Photoshop e determinate il numero di pixel selezionati nella finestra Istogramma. Quindi, le aree pixel possono essere convertite in micrometri quadrati utilizzando la scala specificata dal software confocale.
  5. Con lo stesso strumento lazo, selezionare il bordo interno (contorni dell'area macchiata all'interno della piastra finale, vedere figura 2) e determinare l'area non macchiata nell'intera struttura (o nell'area vuota) come descritto sopra (passaggio 4.4.). I valori dell'area postsinaptica verranno ottenuti dopo aver sottratto l'area totale dall'area vuota di ogni NMJ.
  6. Ottenere l'Area Presnaptica, che è definita come l'area con immunofluorescenza anti-neurofilamento, in modo simile all'area NMJ totale.
    NOTA: Tutti questi parametri sono stati utilizzati per determinare l'indice di densità post-sinaptica (area postsinaptica/area totale) e la copertura NMJ (area presnaptica/area postsinaptica). Un indice di densità postsinaptica più elevato implica una banda terminale più densa o più compatta, mentre una copertura NMJ più piccola riflette un'interazione molto più povera tra terminale nervoso e piastra terminale (entrambe compatibili con un processo di denervazione). Nel caso qui mostrato, poiché sono state rilevate forme fosforilate e non fosforilate di neurofilamenti a livello terminale nervoso, sono stati calcolati il rapporto segnale presnaptico fosforilato/non fosforilato e il rapporto di copertura fosforilato/non fosforilato.

Risultati

Questo protocollo offre un metodo semplice per isolare e immunostain fibre muscolari da due diversi tipi di muscoli (muscoli a contrazione rapida e lenta, vedi Figura 1). Utilizzando i marcatori e/o le sonde corretti, i componenti NMJ possono essere rilevati e valutati poiché un punto di vista quantitativo per valutare alcuni dei cambiamenti morfologici che possono verificarsi come conseguenza della progressione della malattia o di uno specifico trattamento farmacologico. Nel presente studi...

Discussione

In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato per la dissezione di due muscoli scheletrici del ratto (uno a contrazione lenta e l'altro a contrazione rapida), isolamento muscolare delle fibre e rilevamento dell'immunofluorescenza dei marcatori pre e postinaptici per valutare quantitativamente i cambiamenti nmj e i processi di assemblaggio / smontaggio. Questo tipo di protocollo può essere utile nei modelli diroditori 41,42 per valutare NMJ durante i ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Molte grazie al CSIC e al PEDECIBA per il sostegno finanziario dato a questo lavoro; a Natalia Rosano per le sue correzioni manoscritte; a Marcelo Casacuberta che realizza il video e a Nicolás Bolatto per aver prestato la sua voce per questo.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Stereomicroscope with cool light illuminationNikonSMZ-10A
Rocking platformBiometra (WT 16)042-500
Cover glasses (24 x 32 mm)DeltalabD102432
Premium (Plus) microscope slidesPORLABPC-201-16
TweezersF.S.T11253-20
Uniband LA-4C Scissors 125mmE.M.S77910-26
Disponsable surgical blades #10Sakira Medical1567
Disponsable sterile syringe (1 ml)Sakira Medical1569
Super PAP penE.M.S71310
100 μl or 200 μl pipetteFinnpipette9400130
Confocal microscopeZeissLSM 800 - AiryScan
NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H ratsTaconic2148-M
1X PBS (Dulbecco)Gibco21600-010
ParaformaldehydeSigma158127
Triton X-100SigmaT8787
GlycineAmresco167
BSABio Basic INC.9048-46-8
GlycerolMallinckrodt5092
TrisAmresco497
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated AntibodyBioLegend801601Previously Covance # SMI 31P
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated AntibodyBioLegend801701Previously Covance # SMI-32P
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L)Thermo ScientificA11029
α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugateInvitrogenB1196
Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugateInvitrogenS32355
Diaminophenylindole (DAPI)SigmaD8417

Riferimenti

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