全山神経筋接合部の免疫蛍光解析と形態測定解析のための単一骨格筋線維の解剖

要約

神経筋接合成分を正確に検出する能力は、病理学的または発達的プロセスのために、そのアーキテクチャの変更を評価する上で非常に重要です。ここでは、定量的測定を行うために使用できる全マウント神経筋接合部の高品質画像を得るための簡単な方法の完全な説明を提示する。

要約

神経筋接合部(NMJ)は、運動神経と骨格筋の間の特殊な接触点である。この周辺シナプスは、高い形態学的および機能的可塑性を示す。多くの神経系障害において、NMJは神経伝達障害、衰弱、萎縮、さらには筋線維死に至る初期の病理学的標的である。その関連性により、NMJコンポーネント間の関係の特定の側面を定量的に評価する可能性は、その組み立て/分解に関連するプロセスを理解するのに役立ちます。筋肉を扱うときの最初の障害は、繊維を傷つけることなく迅速に識別し、解剖するための技術的専門知識を得ることである。第2の課題は、高品質な検出方法を用いて、定量分析に使用できるNMJ画像を取得することです。この記事では、ラットから伸び器ジジドーラムロンゴラスとソレウスの筋肉を解剖するためのステップバイステップのプロトコルを提示します。また、全型NJのプリリシナプス要素とポストナプティクス要素を視覚化するための免疫蛍光の使用についても説明しています。得られた結果は、この技術がシナプスの顕微鏡解剖学を確立し、生理学的または病理学的条件下でのその成分の一部の状態の微妙な変化を特定するために使用できることを実証する。

概要

哺乳動物神経筋接合部(NMJ)とは、運動ニューロン神経終末部、骨格筋線維上のポストナプティック膜、及びシュワン細胞^1、2、3の末端からなる大きなコリン作動性三者分裂性シナプスである。このシナプスは、MJが動的構造修飾を受けることができる成人期においても、高形態学的および機能的可塑性4、5、6、7、8を示す。例えば、一部の研究者は、運動神経終末がマイクロメートルスケール⁹で絶えず形を変えることを示している。また、NMJの形態は、機能的要件、変更された使用、老化、運動、または運動活動^{4、10、11、12、13、14、15}の変動に応答することが報告されている。したがって、トレーニングと使用の欠如は、NMJのいくつかの特性を変更するための本質的な刺激を表し、そのサイズ、長さ、シナプス小胞および受容体の分散、ならびに神経末分岐14、16、17、18、19、20などである。

さらに、この重要な接合の構造変化または変性は、運動ニューロン細胞死および筋萎縮²¹をもたらす可能性があることを示している。また、神経と筋肉間のコミュニケーションの変化は、生理学的な加齢に伴うNMJの変化と、おそらく病理学的状態におけるその破壊の原因となり得ると考えられている。神経筋接合部解体は筋萎縮性側索硬化症(ALS)の発症において重要な役割を果たすが、これは、筋神経相互作用障害の最良例の1つを構成する神経変性疾患^{である3。}運動ニューロン機能障害に関して行われた数多くの研究にもかかわらず、ALSで観察された劣化が運動ニューロンへの直接的な損傷のために起こり、その後コルチコ脊髄投影²²に及ぶかどうかはまだ議論されている。または、変性が神経終末で始まり、運動ニューロンソマ^23、24に向かって進行する遠位奇数症と考えるべきである場合。ALS病理の複雑さを考えると、独立したプロセスの組み合わせが起こることを考慮することは論理的です。NMJは筋肉と神経の間の生理病理学的相互作用の中心的なプレーヤーであるため、その不安定化は分析されるべき関連する疾患の起源における極めて重要なポイントを表す。

哺乳類の神経筋系は、機能的に、運動ニューロンとその神経末端によって排他的に内在する筋線維からなる離散運動単位に編成される。各モータユニットは、構造特性および機能特性^が25に類似しているか、同一の繊維を有する。運動ニューロン選択的リクルートメントは、機能的要求に対する筋肉応答を最適化することを可能にする。哺乳類の骨格筋は4種類の異なる繊維で構成されているのは明らかです。いくつかの筋肉は、最も豊富な繊維の種類の特性に応じて命名されています。例えば、ソレウス(体の姿勢の維持に関与する後肢の後肢)は、遅いけいれんユニット(タイプ1)の大部分を担い、遅い筋肉として認識される。代わりに、伸びジデンソルロンゴ(EDL)は本質的に同様の高速けいれん特性(タイプ2繊維)を持つ単位で構成され、運動に必要なフェジス運動に特化した高速筋肉として知られています。つまり、成人の筋肉はホルモンや神経の影響により自然の中ではプラスチックであるが、その繊維組成は、連続的な低強度活性を経験するソレソウスと、より急速な単一のけいれんを示すEDLに見られるように、異なる活性を行う能力を決定する。異なるタイプの筋線維の中で可変的である他の特徴は、その構造(ミトコンドリア含有量、サルコプラズムレチクルの拡張、Z線の厚さ)、ミオシンATPase含有量、およびミオシン重鎖組成物^{26、27、28、29}に関連している。

げっ歯類のNJの場合、筋肉^28、29の間で有意な違いがあります。ラットからソレウスとEDLで行われた形態測定解析は、シナプス領域と繊維径との間に正の相関関係を明らかにした(すなわち、ソレウス遅繊維におけるシナプス領域はEDL高速繊維よりも大きい)が、NMJ面積と繊維サイズの比率は両方の筋肉^30,31で類似している。また、神経末端に関しては、1型繊維のエンドプレート絶対領域は2型繊維よりも低く、一方、繊維径による正規化は1型繊維の神経末端の領域を最大³²にした。

しかし、NMJ成分^33,34の変化の証拠を示す形態解析に焦点を当てた研究はほとんどない。したがって、様々な病理において形態や生理学が変化する生物の機能におけるNMJの関連性のために、NMJ構造全体の可視化を可能にする十分な品質で異なるタイプの筋肉の解剖プロトコルを最適化することが重要である。また、老化や運動^{35、36、37、38}などの異なる実験状況または条件における前または後の昼寝の変化の発生^を評価する必要があります。また、ALS³⁹に報告されているように、末端神経終末における神経フィラメントリン酸化の変化などのNMJ成分においてより微妙な変化を証明するのに役立つ可能性がある。

プロトコル

すべての動物の手順は、実験目的のために使用される動物の世話のための国法N°18611のガイドラインに従って行われました。この議定書は、制度倫理委員会(CEUA IIBCE、プロトコル番号004/09/2015)によって承認されました。

1. 筋解剖(1日目)

注:開始する前に、ダルベッコのリン酸生理食塩(DPBS)で0.5%パラホルムアルデヒド(PFA)、pH 7.4の40 mLを作ってください。必要に応じて、4% PFA の 20 mL を作ります。5 mLアリコートを準備し、-20°Cで凍結します。 解剖の日に、4%のアリコートを解凍し、DPBSの35 mLを加え、0.5%PFAの40 mLを得る。

1. EDLの分離(速い筋をぴくぴくする)
   1. ネズミを安楽死させる。腹部を上向きにして動物を置きます。後肢に向かってつま先の間の外科用ブレードを使用して最初の切開を行います。
      注:この場合、90:10 mg/Kgケタミンの腹腔内注射:キシラジンはラットを安楽死させるために与えられたが、麻酔の他の選択肢も許可されている。
   2. 皮膚を剥がし、ラットの膝が露出するまで上方に引っ張ります。
   3. EDLを見つけるには、足腱を環状靭帯まで従ってください。この靭帯は2つの腱を囲む。ユニバンドはさみ(または同様)で2つの腱の間の靭帯を切断します。両方を持ち上げてEDL腱を識別し、つま先を上に動かしたものを選択します。
   4. ユニバンドはさみで腱を切ります。次に、細かい生体ピンセットで腱を保持しながら、後方の脛表筋、ペローヌス・ブレビス、及びペロネウス・ロンダス⁴⁰ からEDL筋をゆっくりと分離し始める( 図1Aを参照)。
      メモ:筋肉が損傷を受けることなく分離されていることを確認してください。EDL筋肉を保持し、持ち上げながら、それらの間のパスを開くために横方向の筋肉の残りの部分を切断することによってこれを行います(EDLは表面的な位置を持っていません)。
   5. 筋肉を完全に分離するには、ラットの膝に付着した腱をユニバンドハサミで切ります。
   6. 解剖した筋肉を0.5%PFAの5mLに浸し、4°Cで24時間放置する。 必要に応じて、段ボールの一部に筋肉をホチキス止めし、筋肉を下に向けて回します。その後、完全に8 mLの固定溶液に浸漬します。このステップは、固定プロセス中に伸長した筋肉を維持するのに役立ちます.
2. ソレウスの分離 (ゆっくりぴくぴく筋肉)
   1. 動物を反転します(腹部は現在下向きです)。皮膚を通して、外科用ブレードを使用して踵腱を切断する。
   2. 生体ピンセットとユニバンドはさみの助けを借りて、胃腸筋を骨から分離し、「筋肉のふた」を作り出します。ソレウスは筋肉の蓋の内側側になります。それは色が赤で、平らな形態を有するので識別することができる。
   3. 一対の生物学的ピンセットを使用して、胃食用腱の上にあるソレウス腱に手を伸ばして持ち上げます( 図1Bを参照)。
   4. ユニバンドはさみで腱を切ります。弱い取り付けポイント(すなわち、神経血管要素)の一部を切断しながら、筋肉全体を持ち上げます。最後に、ソレウスの筋肉を完全に解放するために、ユニバンドハサミで踵腱を形成するソレウスの魅惑をカットします。
   5. 解剖されたソレウスの筋肉を修正するためにステップ1.1.6を繰り返します。

2.からかわれた繊維の準備(2日目)

1. 24時間の固定後、6 mLのDPBS溶液3xで筋線維を単離する前にそれぞれ10分間リンスします。
2. 繊維を分離するには、顕微鏡スライドに筋肉を置きます。実体顕微鏡を使用して、1組の生物学的ピンセットで腱の1つをそっと保持します。その後、他の生体ピンセットと共に、腱をゆっくりとつまみ始め、筋線維を分離する。その後、ゆっくりと反対側の筋肉腱に向かって上方につままれた組織を引っ張ります.複数の小さな分離バンドルを取得するまで、この操作を数回繰り返す必要があります。
3. 前処理されたスライド(シラナイズ)に注意して置きます。繊維が重ならないように、すべての繊維を順番に保つ必要があります。この時点で、24時間繊維を空気乾燥する。

3. 免疫蛍光

1. 一次抗体インキュベーション(3日目)
   注: 特に明記されていない限り、すべてのステップは室温で実行されました。スライドから繊維を取り外すことなく、異なるソリューションを除去する最も効率的な方法は、インスリン注射器を使用することです。
   1. 免疫染色プロセスを開始するには、乾燥した単離された筋線維をパップペンで囲み、防水バリアを作成します。
   2. 筋線維を水和するには、蒸留水200μLを5分間加え、次の5分間のインキュベーションのために200 μLのDPBSに水を交換します。この時点で、免疫蛍光標識を開始する。
   3. 50 mMグリシン、1%BSA、トリトンX-100を含む300μLのブロッキングバッファー(BB)を用いたインキュベート繊維を30分間インキュベートします。
   4. BBをメーカーが提案した濃度で一次抗体に置き換えます。BBを使用して抗体を希釈します。この実験では、非リン酸化(Nf)またはリン酸化(Phos-Nf)の神経フィラメントHを認識したSMI32またはSMI 31の400μLを1/800希釈で使用し、NMJシナプス前成分を検出した。
      注:ニューロフィラメントリン酸化を評価するのではなく、シナプス前の元素全体を認識することを決定する場合は、シナプシン、シナプトフィシンまたはSV2aに対する抗体を選択してください。
   5. 一次抗体希釈を一晩4°Cでインキュベートする(場合によっては、インキュベーションは1時間37°Cで行うことができる)。どちらの場合も、湿気の多いチャンバーを使用してインキュベーションを行うことが重要になります。
2. 免疫蛍光:二次抗体インキュベーション(4日目)
   1. 一次抗体を取り除き、繊維3xをそれぞれ10分間、500 μLのDPBSで、最後にBBでリンスします。
   2. この最後の洗浄を取り除き、BBで希釈した蛍光標識二次抗体を加えます。この実験では、BBで1/1000希釈時に500μLのヤギ抗マウスアレクサFluor 488を使用した。NmJのポストナプティック要素を見るために、1:300 α-ブンガロトキシン(Btx)ビオチン-XXコンジュゲートを二次抗体希釈に添加した。
      注:Btx-ビオチンXXを追加すると、シグナルを増幅するストレプトアビジンで検出された信号対雑音画像が向上します。さらに、異なるフルオロフォアへのストレプトアビジン結合は、共標識アッセイにおける色の組み合わせを増加させる。あるいは、蛍光標識Btxは、同様の品質の画像を得ることができます。
   3. 二次抗体とBtxを室温で2時間、光から保護された37°Cで1時間インキュベートします。
   4. 2次抗体とBtx.は、DPBS 500 μLとBBで最後のリンスをそれぞれ10分間洗浄3倍洗浄します。
   5. 500 μLのストレプトアビジン アレクサ Fluor 555 を 1/1000 希釈で、BB を室温で 1 時間インキュベートします。この時点で、必要に応じて、1μg/mLの最終濃度でジアミノフェニルドノールなどの核に対抗するプローブを追加します。
   6. インキュベーション溶液を取り外し、繊維3xを10分間、それぞれ500 μLのDPBSで洗浄します。次に、繊維を取り付ける。
3. マウンティング
   1. 正方形の頂点であるかのように顕微鏡スライドに透明なマニキュアの4ドットを置きます。1-2分乾燥させます。これらは、カバーリップが休むポイントであり、組織の粉砕を避けるのに役立ちます。
   2. 最後のDPBS洗浄を取り外し、繊維をカバーするのに十分な取り付け媒体(〜200 μL)を追加します。乾燥を避けてください。
      注:取り付けメディアミックスの10 mLを準備するには、トリス-HCl 1,5 M pH 8,8:グリセロールを4:1(v:v)で使用してください。
   3. 200 μL のピペットチップを使用して、取り付けメディアを繊維に慎重に分散させ、それらすべての完全な浸漬を確実にします。カバーガラスを配置する前に、気泡を取り除きます。
   4. 気泡の発生を防ぐためにサンプルにカバースリップを置きます。この動きは鉗子の助けによって行うことができる。

4. 顕微鏡・形態測定解析

1. レーザー共焦点顕微鏡を使用して、からかわれた繊維製剤を画像化します。
2. 1マイクロメートル間隔でシナプス全体にわたって一連の光セクション(30 μm Zスタック)を取ります。スタックを設定するには、Btx 信号を使用します。2048 px x 2048 ピクセル解像度の筋肉状態ごとに、15~20 個以上の NmJ をイメージします。この方法は、モルフォメトリクス解析のための十分な光学品質と解像度を持つ画像を得るために選択されました。
3. 測定を実行するには、解析ソフトウェアでスタックの投影画像を使用します。
   注:説明された形態測定解析は手動で行われましたが、最近開発された2つのImage Jベースのツールがあり、前およびポストナプティクスNMJ形態^33、34の多くの異なる側面を研究しています。
4. 合計 NMJ 領域の値を取得するには、Photoshopの磁気投げ縄ツールを使用して、エンドプレートの外部境界(染色領域の外部アウトライン、図 2を参照)を選択し、ヒストグラムウィンドウで選択したピクセル数を決定します。次に、共焦点ソフトウェアで指定された尺度を使用して、ピクセル領域を平方マイクロメートルに変換することができます。
5. 同じ投げ縄ツールで、内部境界(エンドプレート内の染色された領域の輪郭、 図2を参照)を選択し、上記の詳細に示すように、構造全体(または空の領域)の非染色領域を決定します(ステップ4.4.各 NMJ の空の領域から合計領域を差し引いた後、ポストナプティック領域の値が取得されます。
6. シナプス前領域を得る、すなわち抗ニューロフィラメント免疫蛍光を有する領域として定義される、全NMJ領域と同様の方法で。
   注: これらのパラメータはすべて、シナプス後密度指数(ポストシナプス領域/総面積)およびNMJカバレッジ(シナプス前領域/ポストシナプス領域)を決定するために使用されました。より高いポストナプティクス密度指数は、より密度の高い、またはよりコンパクトなエンドプレートを意味しますが、より小さいNMJカバレッジは、神経末端とエンドプレート(両方とも脱樹プロセスと互換性がある)の間の相互作用がはるかに悪いことを反映しています。ここに示す場合、神経フィラメントのリン酸化および非リン酸化形態が神経末レベルで検出されたので、リン酸化/非リン酸化前シナプス信号比およびリン酸化/非リン酸化被覆率を計算した。

結果

このプロトコルは、2種類の異なる筋肉から筋線維を分離および免疫する簡単な方法を提供します(高速および遅い筋、図1を参照)。正しいマーカーおよび/またはプローブを使用して、NMJ成分は、疾患進行または特定の薬物治療の結果として起こり得る形態学的変化の一部を評価するために定量的観点から検出および評価することができる。本研究では、NMJのシナプス前?...

ディスカッション

本稿では、2つのラット骨格筋(1つの遅いけいれんと他の速いけいれん)、線維筋分離およびNMJの変化および組み立て/分解プロセスを定量的に評価するための前および後回しマーカーの免疫蛍光検出の解剖のための詳細なプロトコルを提示する。この種のプロトコルは、ALS hSOD1G93Aラットに見られるような運動ニューロン変性のモデルでここで例示される生理学的または病理学的プロセス中にNMJ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope with cool light illumination	Nikon	SMZ-10A
Rocking platform	Biometra (WT 16)	042-500
Cover glasses (24 x 32 mm)	Deltalab	D102432
Premium (Plus) microscope slides	PORLAB	PC-201-16
Tweezers	F.S.T	11253-20
Uniband LA-4C Scissors 125mm	E.M.S	77910-26
Disponsable surgical blades #10	Sakira Medical	1567
Disponsable sterile syringe (1 ml)	Sakira Medical	1569
Super PAP pen	E.M.S	71310
100 μl or 200 μl pipette	Finnpipette	9400130
Confocal microscope	Zeiss	LSM 800 - AiryScan
NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats	Taconic	2148-M
1X PBS (Dulbecco)	Gibco	21600-010
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Triton X-100	Sigma	T8787
Glycine	Amresco	167
BSA	Bio Basic INC.	9048-46-8
Glycerol	Mallinckrodt	5092
Tris	Amresco	497
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody	BioLegend	801601	Previously Covance # SMI 31P
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody	BioLegend	801701	Previously Covance # SMI-32P
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L)	Thermo Scientific	A11029
α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate	Invitrogen	B1196
Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate	Invitrogen	S32355
Diaminophenylindole (DAPI)	Sigma	D8417