JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) إلى خلايا وظيفية تشبه خلايا الكبد (HLCs) من خلال استكمال أكتيفين A وCHIR99021 باستمرار أثناء التمايز hESC إلى بطانة الرحم النهائية (DE).

Abstract

الوظائف المحتملة للخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية (HLCs) المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) تبشر بالكثير لنمذجة الأمراض وتطبيقات فحص الأدوية. 10- إن هذه الطريقة هي طريقة فعالة وقابلة للاستنساخ لتمايز مركبات الكربون الهيدروفلورية إلى مركبات سداسية الهكربون الوظيفية. ويعتبر إنشاء سلالة من الاندوديرم خطوة رئيسية في التمايز بين المراكز العليا. من خلال طريقتنا، ونحن تنظيم مسارات الإشارات الرئيسية من خلال استكمال مستمر أكتيفين A وCHIR99021 خلال التمايز hESC إلى endoderm نهائي (DE)، تليها جيل من خلايا السلف الكبدي، وأخيرا HLCs مع مورفولوجيا خلايا الكبد نموذجية في طريقة حكمية مع الكواشف محددة تماما. وHESC المشتقة من HLCs التي تنتجها هذه الطريقة التعبير عن علامات مرحلة محددة (بما في ذلك الألبومين، مستقبلات HNF4α النووية، وتوروشولات الصوديوم cotransporting polypeptide (NTCP))، وتظهر خصائص خاصة تتعلق خلايا الكبد ناضجة والوظيفية (بما في ذلك تلطيخ الأخضر إيندوكيانين، تخزين الجليكوجين، تلطيخ hematoxylin-eosin والنشاط CYP3)، ويمكن أن توفر منصة لتطوير التطبيقات القائمة على HLC في دراسة أمراض الكبد.

Introduction

الكبد هو جهاز الأيضية للغاية التي تلعب عدة أدوار, بما في ذلك السمية, تخزين الجليكوجين, وإفراز وتوليف البروتينات1. مسببات الأمراض المختلفة والأدوية والوراثة يمكن أن يسبب تغيرات مرضية في الكبد وتؤثر على وظائفه2،3. تلعب خلايا الكبد ، باعتبارها الوحدة الوظيفية الرئيسية للكبد ، دورا مهما في أنظمة دعم الكبد الاصطناعي والقضاء على سمية الدواء. ومع ذلك ، فإن مورد خلايا الكبد البشرية الأولية محدود في العلاج القائم على الخلايا ، وكذلك في أبحاث أمراض الكبد. لذلك ، فإن تطوير مصادر جديدة للخلايا الكبدية البشرية الوظيفية هو اتجاه بحثي مهم في مجال الطب التجديدي. منذ عام 1998 عندما تم إنشاء hESCs4، وقد تم النظر على نطاق واسع hESCs من قبل الباحثين بسبب إمكاناتها التمايز متفوقة (أنها يمكن أن تفرق في أنسجة مختلفة في بيئة مناسبة) ودرجة عالية من التجديد الذاتي، وبالتالي توفير خلايا المصدر المثالي للكبد الاصطناعي الحيوي، وزرع خلايا الكبد وحتىهندسة أنسجةالكبد 5 .

حاليا، يمكن زيادة كفاءة التمايز الكبدي بشكل كبير من خلال إثراء اندوديرم6. في تمايز النسب من الخلايا الجذعية إلى بطانة الرحم، ومستويات عامل النمو تحويل β (TGF-β) الإشارات ومسارات الإشارات WNT هي العوامل الرئيسية في عقدة مرحلة تشكيل بطانة الرحم. تفعيل مستوى عال من TGF-β وWNT الإشارات يمكن أن تعزز تطوير endoderm7,8. أكتيفين A هو السيتوكين تنتمي إلى عائلة فائقة TGF-β. لذلك ، يستخدم Activin A على نطاق واسع في تحريض الإندوديرم للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs) وhESCs9،10. GSK3 هو بروتين سيرين ثريونين كيناز. وقد وجد الباحثون أن CHIR99021، مثبط محدد من GSK3β، يمكن أن تحفز إشارات WNT نموذجية، ويمكن أن تعزز تمايز الخلايا الجذعية في ظل ظروف معينة، مما يشير إلى أن CHIR99021 لديه القدرة على تحفيز تمايز الخلايا الجذعية في endoderm 11،12،13.

هنا نبلغ عن طريقة فعالة وقابلة للاستنساخ لتحفيز التمايز الفعال للمركبات الهيدروفلورية إلى مركبات إتش إل سي وظيفية. أنتجت الإضافة المتتابعة ل Activin A و CHIR99021 حوالي 89.7±0.8٪ SOX17 (DE marker) خلايا إيجابية. بعد أن نضجت هذه الخلايا في المختبر، عبرت عن علامات محددة كبدية ومارست مورفولوجيا تشبه الخلايا الكبدية (استنادا إلى تلطيخ الهيماتوكسيلين -إيوزين (H و E)) ووظائف ، مثل امتصاص الأخضر الإندوسيانين (ICG) وتخزين الجليكوجين ونشاط CYP3. وتبين النتائج أن hESCs يمكن تمييزها بنجاح إلى HLCs وظيفية ناضجة بهذه الطريقة ويمكن أن توفر أساسا للبحوث المتعلقة بأمراض الكبد وفحص الأدوية في المختبر.

Protocol

1. صيانة الخلايا الجذعية

ملاحظة: بروتوكول صيانة الخلية الموضحة أدناه ينطبق على خط الخلية hES03 الاحتفاظ بها في أحادية تابعة. بالنسبة لجميع البروتوكولات التالية في هذه المخطوطة، يجب التعامل مع الخلايا تحت خزانة السلامة البيولوجية.

  1. إعداد 1x mTesR الخلايا الجذعية ثقافة المتوسطة عن طريق تخفيف 5x المتوسطة التكميلية إلى mTesR المتوسطة الأساسية.
  2. إعداد 30x hESC المؤهلين Matrigel المتوسطة عن طريق تمييع 5 مل من ماتريجل hESC المؤهلين مع 5 مل من DMEM/F12 على الجليد. يخزن عند -20 درجة مئوية.
  3. إعداد 1x hESC المؤهلين Matrigel المتوسطة عن طريق تخفيف 33.3 ميكروغرام من 30x hESC المؤهلين Matrigel مع 1 مل من DMEM/F12.
  4. معطف معقم 6 جيدا، لوحات الأنسجة المعالجة بزراعة مع 1 مل من 1x hESC المؤهلين Matrigel في كل بئر مقدما وتخزينها في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. اتركيه في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
  5. إذابة hESCs المبردة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق دون اهتزاز. ثم نقل الخلايا فورا عن طريق الأنابيب في أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على 4 مل prewarmed 37 °C mTesR المتوسطة، pipet صعودا وهبوطا بلطف 2 مرات.
  6. أجهزة الطرد المركزي hESCs في 200 × ز لمدة 2 دقيقة في RT.
  7. يستنشق supernatant وإعادة إنفاق الخلايا بلطف في 1 مل من المتوسط mTesR.
  8. يستنشق المتوسط DMEM/F12 من لوحة والبذور الخلايا في بئر من لوحة 6-جيدا في كثافة 1 × 105 خلايا في 2 مل من mTesR.
  9. احتضان في حاضنة 5٪ CO2 والحفاظ على الخلايا عن طريق استبدال مع mTesR المتوسطة مسخن يوميا. مرور الخلايا في التقاء ما يقرب من 70-80٪ أو عندما تبدأ مستعمرات الخلية لإجراء اتصال.

2. مرور الخلايا الجذعية والتمايز

  1. بالنسبة للخلايا الممرة، يستنشق الوسط ويحتضن الخلايا ب 1 مل لكل بئر من محلول الإنزيم (على سبيل المثال، أكوتاسي لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية). ثم نقل الخلايا عن طريق الأنابيب إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على 4 مل من DMEM/F12 prewarmed إلى 37 درجة مئوية.
  2. الطرد المركزي الخلايا في 200 × ز في RT لمدة 2 دقيقة.
  3. يستنشق المتوسطة وإعادة بلطف بيليه الخلية في 1 مل من المتوسط mTesR.
  4. إعداد لوحات 24 جيدا عن طريق طلاء مع 250 ميكروغرام من 1x hESC المؤهلين Matrigel المتوسطة مقدما. البذور hESCs كما هو موضح أعلاه في كثافة 1-1.5 × 105 خلايا لكل بئر في 500 ميكرولتر من المتوسط mTesR.
  5. السماح للخلايا باحتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية فيحاضنة ثاني أكسيد الكربون.

3. تشكيل دي

  1. إعداد حلول المخزون من 100 ميكروغرام / مل أكتيفين A مع DPBS تحتوي على 0.2٪ BSA و 3 M CHIR99021 مع DMSO.
  2. إعداد المرحلة الأولى التمايز المتوسطة الأساسية عن طريق استكمال RPMI المتوسطة مع B27 1x.
  3. إضافة أكتيفين ألف إلى تركيز نهائي من 100 نانوغرام / مل وCHIR99021 إلى تركيز نهائي قدره 3 ميكرومتر في حجم مناسب من المرحلة الأولى مسخن التمايز المتوسطة الأساسية.
  4. أسبيرات mTesR المتوسطة من الخلايا واستبدال المرحلة الأولى وسائل الإعلام التمايز التي تحتوي على عوامل التمايز المضافة (على سبيل المثال، 0.5 مل لكل بئر من لوحة 24 جيدا).
  5. السماح للخلايا باحتضان لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية فيحاضنة ثاني أكسيد الكربون، واستبدال المرحلة الأولى من الوسائط يوميا بعوامل تمايز مضافة حديثا (الأيام من 0 إلى 2).
    ملاحظة: بعد 3 أيام من التمايز، يجب أن تعبر الخلايا المتمايزة عن علامات خلايا DE، مثل FOXA2 و SOX17 و GATA4 و CRCR4 و FOXA1 (الحد الأدنى 80٪ من SOX17 اللازمة للمضي قدما).

4. التفريق بين خلايا السلف الكبدي

  1. إعداد المرحلة الثانية التمايز وسائل الإعلام الأساسية عن طريق حل استبدال المصل بالضربة القاضية (KOSR) إلى تركيز النهائي من 20٪ في Knock Out DMEM.
  2. إعداد المرحلة الثانية وسيطة التمايز التي تحتوي على 1٪ DMSO، 1x GlutaMAX، 1x الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) الحل، 100 ميكرومتر 2-ميركابتوثانول و1x البنسلين / العقدية (P / S) إلى الحجم المناسب من KOSR / خروج المغلوب DMEM.
  3. في اليوم الثالث من التمايز، قم بترطيب الوسط واستبداله بالمرحلة الثانية المتوسطة (على سبيل المثال، 0.5 مل لكل بئر من لوحة بئر 24). ثم احتضان لمدة 24 ساعة.
  4. في اليوم الرابع من التمايز، قم بترطيب الوسط واستبداله بالمرحلة الثانية المتوسطة (على سبيل المثال، 1 مل لكل بئر من لوحة بئر 24).
  5. تغيير المتوسطة كل يومين (استبدال المتوسطة في اليوم 6).
    ملاحظة: بعد 8 أيام من التمايز، يجب على الخلايا المتمايزة التعبير عن العلامات المناسبة لخلايا السلف الكبدية، مثل HNF4α، AFP، TBX3، TTR، ALB، NTCP، CEBPA (الحد الأدنى 80٪ من HNF4α اللازمة للمضي قدما).

5. تمايز خلايا الكبد

  1. إعداد 10 ميكروغرام / مل عامل نمو خلايا الكبد (HGF)، 20 ميكروغرام / مل أونكوستاتين (OSM) حلول الأسهم مع DBPS (التي تحتوي على 0.2٪ BSA) ومرشح مع غشاء مرشح 0.22 ميكرومتر.
  2. إعداد المرحلة الثالثة التمايز المتوسطة الأساسية (HepatoZYME-SFM (HZM) المتوسطة تكملها مع 10 ميكرومتر هيدروكورتيزون-21-hemisuccinate و 1x P /S).
  3. إضافة HGF إلى تركيز نهائي من 10 نانوغرام / مل وOSM إلى تركيز نهائي من 20 نانوغرام / مل إلى الحجم المناسب من المرحلة الثالثة مسخن وسيطة التمايز.
  4. في اليوم الثامن من التمايز، يستنشق المرحلة الثانية المتوسطة من الخلايا ويستبدل بالمرحلة الثالثة المتوسطة (على سبيل المثال، 1 مل لكل بئر من لوحة بئر 24).
  5. السماح للخلايا باحتضان لمدة 10 أيام عند 37 درجة مئوية فيحاضنة ثاني أكسيد الكربون، وتغيير وسائط المرحلة الثالثة كل يومين مع عوامل تمايز مضافة حديثا (الأيام 8-18).
    ملاحظة: بعد 18 يوما من التمايز، يجب على الخلايا المتمايزة التعبير عن علامات مميزة للخلايا الكبدية، مثل AAT، ALB، TTR، HNF4α، NTCP، ASGR1، CYP3A4. النسبة المئوية للخلايا الإيجابية الألبومين عادة ما تكون أكثر من 90٪.

6. عزل الحمض النووي الريبي، توليف cDNA وتحليل RT-qPCR

  1. أسبيرات المتوسطة من الخلايا وإضافة كمية مناسبة من كاشف RNAiso Plus، (على سبيل المثال، 0.3 مل لكل بئر من لوحة 24 بئرا). جمع supernatant في أنبوب 1.5 مل والسماح للوقوف في RT لمدة 5 دقائق.
  2. أضف 60 ميكرولتر من كاشف الكلوروفورم واتركه في RT لمدة 5 دقائق. ثم الطرد المركزي في 12،000 × ز لمدة 15 دقيقة.
  3. جمع 125 ميكرولتر supernatant ونقله إلى أنبوب آخر الطرد المركزي. إضافة 160 ميكرولتر من ايزوبروبانول، مزيج جيدا، والوقوف في RT لمدة 10 دقيقة.
  4. جهاز طرد مركزي عند 12,000 x g لمدة 10 دقائق.
  5. إزالة supernatant، إضافة الإيثانول 75٪ إلى عجلت، والطرد المركزي في 7500 × ز لمدة 5 دقائق.
  6. بعد التجفيف في RT، أضف 40 ميكرولتر من المياه المعالجة ب DEPC لتذوب. بالنسبة إلى qPCR، عكس نسخ 2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي مع عدة النسخ العكسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  7. قم بإجراء RT-qPCR باستخدام مجموعة أدوات تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  8. تطبيع التعبير الجيني بالنسبة للخلايا الجذعية غير المستحثة وتحديد تباين الطي بعد التطبيع إلى GAPDH.

7. التحقق من المناعة من التمايز

  1. إعداد 1x مخزن الغسيل PBST بإضافة 0.1٪ توين-20 إلى برنامج تلفزيوني.
  2. يستنشق المتوسطة من الخلايا الملتصقة ويغسل لفترة وجيزة مع برنامج تلفزيوني في RT على شاكر.
  3. اسبيرات برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا مع 500 ميكرولتر من الميثانول الجليد الباردة لكل بئر من لوحة 24 جيدا لإصلاح الخلايا في -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  4. إزالة الميثانول وغسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني على شاكر لمدة 10 دقيقة في كل مرة في RT.
  5. كتلة الخلايا مع 500 ميكرولتر من 5٪ BSA أعدت في برنامج تلفزيوني لمدة 1-2 ساعة في RT على شاكر.
  6. تمييع الأجسام المضادة الأولية في 1: 200 في نفس الحل المستخدم لمنع.
  7. احتضان الخلايا الثابتة في 300 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على شاكر.
  8. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، وغسل الخلايا 3 مرات مع PBST لمدة 10 دقيقة في كل مرة في RT على شاكر.
  9. إعداد حل الأجسام المضادة الثانوية في حل حظر في 1:1000.
  10. احتضان في 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية المحمية من الضوء لمدة 1 ساعة في RT على شاكر.
  11. يستنشق حل الأجسام المضادة الثانوية وغسل الخلايا 3 مرات مع PBST لمدة 10 دقائق في كل مرة في RT على شاكر.
  12. احتضان الخلايا مع 300 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / مل DAPI لمدة 3-5 دقائق، ومن ثم يغسل مرتين مع PBST.
  13. بعد التجسس PBST، إضافة كمية مناسبة من برنامج تلفزيوني لالتقاط الصور تحت المجهر مضان.

8. تحليل لطخة الغربية

  1. إعداد مخزن غسيل TBST 1x بإضافة 0.1٪ Tween-20 إلى المالحة ذات المخزن المؤقت Tris (TBS).
  2. إعداد المخزن المؤقت للكهربائية SDS-PAGE وحاجز النقل الغربي باستخدام عدة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  3. حل بروتين الخلية الكلي (40 ميكروغرام) على 10٪ الصوديوم دودسيل كبريتات هلام البولي أكريلاميد وتشغيلها في SDS-PAGE العازلة الكهربائي في التيار المستمر 15 ما لحوالي 2 ساعة.
  4. نقل الجل إلى غشاء ثنائي فلوريد متعدد الفينيل (PVDF) في تيار ثابت 300 mA لمدة 2 ساعة في درجة حرارة منخفضة.
    ملاحظة: قد يختلف وقت التشغيل ووقت النقل حسب المعدات المستخدمة ونوع الجل ونسبته المئوية.
  5. كتلة الغشاء مع 3٪ BSA أعدت في TBST لمدة 1 ساعة في RT على شاكر.
  6. احتضان في حل الأجسام المضادة الأولية (1:1000 التخفيف) بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على شاكر.
  7. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، غسل غشاء النشاف 3 مرات مع TBST لمدة 15 دقيقة في المرة الواحدة في RT على شاكر.
  8. احتضان في حل الأجسام المضادة الثانوية (1:2000 التخفيف) لمدة 2 ساعة في RT على شاكر.
  9. تجاهل محلول الأجسام المضادة الثانوية وغسل الغشاء 3 مرات مع TBST، لمدة 15 دقيقة في كل مرة، في RT على شاكر.
  10. تصور العصابات المناعية باستخدام كاشف chemiluminescence تليها الأشعة الذاتية. استخدم β-actin كعنصر تحكم التحميل.

9. إندوسياناين امتصاص الأخضر

  1. إعداد 200 ملغ / مل indocyanine حل الأسهم الخضراء في DMSO.
  2. إعداد حل العمل عن طريق استكمال المرحلة الثالثة التمايز المتوسطة مع محلول أخضر indocyanine إلى تركيز النهائي من 1 ملغم / مل.
  3. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة لمدة 1-2 ساعة.
  4. يستنشق المتوسطة وغسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
  5. صورة تحت المجهر.

10. دوري حمض شيف (PAS) تلطيخ وهيماتوكسيلين-إيوزين (H &؛ E) تلطيخ

  1. يستنشق المتوسطة من الخلايا الملتصقة وغسل لفترة وجيزة مرتين مع برنامج تلفزيوني.
  2. لتثبيت الخلايا، يستنشق برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا مع الميثانول الجليد الباردة في -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. تصور تخزين الجليكوجين بواسطة PAS تلطيخ ومراقبة الخلايا الثنائية بواسطة H &؛ E تلطيخ باستخدام عدة اتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  4. التقاط الصور مع المجهر مضان.

11. المقايسة لنشاط CYP

  1. قياس نشاط CYP450 باستخدام المقايسات المستندة إلى الخلايا المتاحة تجاريا (P450-Glo Assays) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. استخدم ثلاث تكرارات مستقلة للاختبار. يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ± SD.

النتائج

الرسم التخطيطي لحث HLC من hESCs والصور التمثيلية ذات المجال الساطع لكل مرحلة تمايز تظهر في الشكل 1. في المرحلة الأولى، تمت إضافة أكتيفين A وCHIR99021 لمدة 3 أيام لحث الخلايا الجذعية على تشكيل خلايا إندوديرم. في المرحلة الثانية ، تمايزت خلايا بطانة الرحم إلى خلايا سلف كبدية بعد علاجه?...

Discussion

هنا، نقدم طريقة تدريجية تحفز HLCs من hESCs على ثلاث مراحل. وفي المرحلة الأولى، استخدمت أكتيفين ألف وCHIR99021 لتمييز مركبات الكربون الهيدروفلورية إلى DE. وفي المرحلة الثانية، استخدمت الخلايا السلفية KO-DMEM وDMSO لتمييز DE إلى خلايا سلف كبدية. وفي المرحلة الثالثة، استخدمت HZM بالإضافة إلى HGF وOSM وهيدروكورت...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81870432 81570567 إلى شركة X.L.Z. (رقم 81571994 إلى شركة P.N.S.)؛ مؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة غوانغدونغ، الصين (رقم 2020A1515010054 إلى P.N.S.)، مؤسسة جامعة لي كا شينغ شانتو (رقم L1111 2008 إلى P.N.S.). نود أن نشكر البروفيسور ستانلي لين من كلية الطب بجامعة شانتو على المشورة المفيدة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigmaM7522For hepatic progenitor differentiation
488 labeled goat against mouse IgGZSGB-BIOZF-0512For IF,second antibody
488 labeled goat against Rabbit IgGZSGB-BIOZF-0516For IF,second antibody
AccutaseStem Cell Technologies7920For cell passage
Activin ApeproTech120-14EFor definitive endoderm formation
Anti - Albumin (ALB)Sigma-AldrichA6684For IF and WB, primary antibody
Anti - Human Oct4AbcamAb19587For IF, primary antibody
Anti - α-Fetoprotein (AFP)Sigma-AldrichA8452For IF and WB, primary antibody
Anti -SOX17Abcamab224637For IF, primary antibody
Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α)Sigma-AldrichSAB1412164For IF, primary antibody
B-27 SupplementGibco17504-044For definitive endoderm formation
BSABeyotimeST023-200gFor cell blocking
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046For definitive endoderm formation
DAPIBeyotimeC1006For nuclear staining
DEPC-waterBeyotimeR0021For RNA dissolution
DM3189MCEHY-12071For definitive endoderm formation
DMEM/F12Gibco11320-033For cell culture
DMSOSigma-AldrichD5879For hepatic progenitor differentiation
DPBSGibco14190-144For cell culture
GlutaMAXGibco35050-061For hepatic progenitor differentiation
H&E staining kitBeyotimeC0105SFor H&E staining
Hepatocyte growth factor (HGF)peproTech100-39For hepatocyte differentiation
HepatoZYME-SFM (HZM)Gibco17705-021For hepatocyte differentiation
Hydrocortisone-21-hemisuccinateSigma-AldrichH4881For hepatocyte differentiation
IndocyanineSangon BiotechA606326For Indocyanine staining
Knock Out DMEMGibco10829-018For hepatic progenitor differentiation
Knock Out SR Multi-SpeciesGibcoA31815-02For hepatic progenitor differentiation
Matrigel hESC-qualifiedCorning354277For cell culture
MEM NeAAGibco11140-050For hepatic progenitor differentiation
mTesR 5X SupplementStem Cell Technologies85852For cell culture
mTesR Basal MediumStem Cell Technologies85851For cell culture
Oncostatin (OSM)peproTech300-10For hepatocyte differentiation
P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)PromegaV8901For CYP450 activity
PAS staining kitSolarbioG1281For PAS staining
Pen/StrepGibco15140-122For cell differentiation
Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgGZSGB-BIOZB-2305For WB,second antibody
Primary Antibody Dilution Buffer for Western BlotBeyotimeP0256For primary antibody dilution
ReverTraAce qPCR RT KitTOYOBOFSQ-101For cDNA Synthesis
RNAiso PlusTaKaRa9109For RNA Isolation
RPMI 1640Gibco11875093For definitive endoderm formation
Skim milkSangon BiotechA600669For second antibody preparation
SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742For RT-PCR Analysis
Torin2MCEHY-13002For definitive endoderm formation
TweenSigma-AldrichWXBB7485VFor washing buffer preparation

References

  1. Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
  2. Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
  3. Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity. Archives of Toxicology. , (2021).
  4. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  5. Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763 (2019).
  6. Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
  7. Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
  8. Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
  9. Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
  10. Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
  11. Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).
  12. Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
  13. Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
  14. Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
  15. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
  16. Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
  17. Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212 (2015).
  18. Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
  19. Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
  20. Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
  21. Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
  22. Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
  23. Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
  24. Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
  25. Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

171 CHIR99021

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved