인간 배아 줄기 세포에서 헤파토세포와 같은 세포 유도를 위한 효율적인 방법

요약

이 원고는 hESC 분화 시 활성A및 CHIR99021을 최종 엔도덤(DE)으로 분화하여 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 기능성 간세포와 같은 세포(HLC)로 분화하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

초록

인간 배아 줄기 세포 (hESC)에서 파생 된 간세포와 같은 세포 (HLC)의 잠재적 인 기능은 질병 모델링 및 약물 선별 응용 프로그램에 대한 큰 약속을 보유하고 있습니다. 여기에 제공 기능 용 HLC로 hESC의 분화를위한 효율적이고 재현 가능한 방법이 있습니다. 엔도름 혈통의 확립은 HLC와 차별화의 핵심 단계입니다. 우리의 방법에 의해, 우리는 지속적으로 최종 엔도담 (DE)로 hESC 분화 하는 동안 Activin A와 CHIR99021을 보충 하 여 주요 신호 경로를 조절 하 고, 간 선조 세포의 생성 에 이어, 그리고 마지막으로 완전히 정의 된 시약을 가진 단계 별 방법으로 전형적인 간세포 형태와 HLCs. 이 방법에 의해 생성된 hESC 유래 HLC는 단계별 마커(알부민 포함) 및 HNF4α 핵수용체 및 타우로콜레이트 응수송 폴리펩티드(NTCP)는 성숙하고 기능적인 간세포(인도시아닌 그린 염색, 글리코겐 저장, 헤마톡시린-에신 염색 및 CYP3 활성 포함)와 관련된 특별한 특성을 나타내며, HLC 기반의 응용 분야의 개발을 위한 플랫폼을 제공할 수 있다.

서문

간은 탈산화, 글리코겐 저장, 단백질^1의분비 및 합성을 포함하여 여러 가지 역할을 하는 매우 신진 대사 기관이다. 각종 병원균, 약물 및 항종은 간에서 병리학적 변화를 일으킬 수 있으며 그 기능에 영향을 미칠 수^{있습니다2,3.} 간장의 주요 기능 단위인 간세포는 인공 간 지원 시스템 및 약물 독성 제거에 중요한 역할을 합니다. 그러나, 1 차적인 인간 간세포의 자원은 간 질병 연구에서 뿐만 아니라 세포 기지를 둔 치료에서 제한됩니다. 따라서 기능성 인간 간세포의 새로운 소스를 개발하는 것은 재생 의학 분야에서 중요한 연구 방향입니다. 1998년 hESC가 설립된 이래^4년이래, hESC는 우수한 분화 잠재력(적절한 환경에서 다양한 조직으로 분화할 수 있음) 및 높은 수준의 자기 갱신성 으로 인해 연구자들이 널리 고려해 왔으며, 따라서 생체인공간, 간세포 이식, 심지어 간 조직 공학^5에이상적인 공급세포를 제공한다.

현재, 간 분화 효율은 엔도름^6을농축함으로써 크게 증가할 수 있다. 줄기 세포의 혈통 분화에서 엔데담으로, β 변형 성장 인자 (TGF-β) 신호 및 WNT 신호 경로의 수준은 엔도름 형성 단계의 노드의 핵심 요소입니다. 높은 수준의 TGF-β 및 WNT 시그널링의 활성화는 엔도름^7,8의개발을 촉진할 수 있다. 액티빈 A는 TGF-β 슈퍼 패밀리에 속하는 사이토카인입니다. 따라서, 액티빈 A는 인간 유도만능 줄기세포(hiPSC) 및 hESC^9,10의엔도름^유도에널리 사용된다. GSK3는 세린-토닌 단백질 키나아제입니다. 연구원은 CHIR99021, GSK3β의 특정 억제제, 전형적인 WNT 신호를 자극할 수 있고, 특정 조건하에서 줄기 세포 분화를 촉진할 수 있다는 것을 것을을 발견했습니다, CHIR99021는 endoderm ^11,12,13로줄기 세포 분화를 유도하기위한 잠재력을 가지고 있음을 시사.

여기서 는 hESC를 기능형 HLC로 효과적으로 차별화하는 효율적이고 재현 가능한 방법을 보고합니다. 액티빈 A와 CHIR99021의 순차적 첨가는 약 89.7±0.8% SOX17(DE 마커)-양성 세포를 생산하였다. 시험관에서추가 로 소화 된 후, 이들 세포는 간 특이적 마커를 발현하고 간세포와 같은 형태 (헤마톡시린 -eosin 염색 (H & E)에 기초하여) 및 기능, 인도시아닌 녹색 (ICG), 글리코겐 저장 및 CYP3 활성등의 섭취와 같은 기능. 결과는 hESC가 이 방법에 의해 성숙한 기능적인 HLC로 성공적으로 분화될 수 있고 간 질병 관련 연구 및 체외약 검열을 위한 기초를 제공할 수 있다는 것을 보여줍니다.

프로토콜

1. 줄기 세포 유지 보수

참고: 아래에 설명된 세포 유지 보수 프로토콜은 부착된 단층에서 유지되는 hES03 세포주에 적용됩니다. 이 원고의 모든 다음 프로토콜에 대해 세포는 생물학적 안전 캐비닛에서 처리되어야합니다.

1. mTesR 기본 배지에 5배 보충 배지를 희석하여 1배 mTesR 줄기 세포 배양 배지를 준비한다.
2. 얼음 에 DMEM / F12의 5 mLhESC 자격을 갖춘 5 mL을 희석하여 30 배 hESC 자격을 갖춘 Matrigel 배지를 준비하십시오. -20 °C에 보관하십시오.
3. DMEM/F12의 1mL로 30x hESC 인증 된 Matrigel의 33.3 μL을 희석하여 1 x hESC 자격을 갖춘 마모젤 배지를 준비하십시오.
4. 코팅 멸균 6 잘, 조직 배양 처리 플레이트 1 x hESC 자격을 갖춘 Matrigel의 1 mL을 사전에 저장하고 하룻밤 4 °C에 저장합니다. 사용하기 전에 실온(RT)에서 최소 30분 동안 그대로 둡니다.
5. 37°C 수조에서 저온 보존 된 hESC를 흔들어서 3 분 동안 해동하십시오. 그런 다음 즉시 4mL 을 포함하는 15 mL 원심분리기 튜브로 피펫팅하여 세포를 37°C mTesR 배지로 이송하고, 2회 위아래로 부드럽게 피펫을 한다.
6. RT에서 2 분 동안 200 x g에서 hESC원심분리합니다.
7. 수퍼내트를 흡인하고 mTesR 배지의 1mL에서 세포를 부드럽게 재보종한다.
8. 플레이트에서 DMEM/F12 배지를 흡인하고 2mL의 mTesR에서 1 x 10⁵ 세포의 밀도로 세포를 6웰 플레이트의 우물로 시드한다.
9. 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하고 매일 예열된 mTesR 배지로 교체하여 세포를 유지한다. 약 70-80%의 합류 또는 세포 식민지가 접촉하기 시작할 때 세포를 통과합니다.

2. 줄기 세포 통로 및 분화

1. 세포 전달의 경우, 배지를 흡인하고 효소 용액당 1mL로 세포를 배양한다(예를 들어, 37°C에서 5분 동안 Accutase) 그런 다음 37°C로 예온된 DMEM/F12의 4mL을 포함하는 15mL 원심분리기 튜브로 피펫팅하여 세포를 이송한다.
2. 2 분 동안 RT에서 200 x g에서 세포를 원심 분리합니다.
3. 매체를 흡인시키고 mTesR 배지의 1mL에서 세포 펠릿을 부드럽게 재봉보냅니다.
4. 1x hESC 자격을 갖춘 55gel 배지의 250 μL로 코팅하여 24웰 플레이트를 미리 준비합니다. 상술한 바와 같이 종자 hESC는 mTesR 배지의 500 μL에서 웰당 1- 1.5 x 10⁵ 세포의 밀도로 한다.
5. CO₂ 인큐베이터에서 세포가 37°C에서 24시간 동안 배양하도록 허용합니다.

3. DE 형성

1. DMSO를 사용하여 0.2% BSA 및 3mM CHIR99021을 포함하는 DPBS로 100 μg/mL 액티빈 A의 스톡 솔루션을 준비합니다.
2. 1x B27로 RPMI 매체를 보충하여 단계 I 차별화 기본 매체를 준비합니다.
3. 액티빈 A를 100 ng/mL 및 CHIR99021의 최종 농도에 예열된 단계 I 분화 기본 배지의 적절한 부피에 3 μM의 최종 농도에 추가합니다.
4. 세포로부터 mTesR 배지를 흡인하고 추가 분화 인자를 포함하는 단계 I 분화 매체로 대체한다(예를 들어, 24웰 플레이트의 웰당 0.5mL).
5. CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 3일 동안 세포를 배양할 수 있도록 하여, 매일 스테이지 I 미디어를 갓 추가된 분화 인자(일 0-2)로 대체한다.
   참고: 3일간의 분화 후, 분화세포는 FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 및 FOXA1(진행에 필요한 SOX17의 최소 80%)과 같은 DE 세포의 마커를 발현해야 합니다.

4. 간 선조 세포의 분화

1. 녹아웃 세럼 교체(KOSR)를 녹아웃 DMEM에서 20%의 최종 농도로 용해하여 스테이지 II 차별화 기본 미디어를 준비하십시오.
2. 1% DMSO, 1x 글루타맥스, 1x 비필수 아미노산(NEAA) 용액, 100μM 2-메르카포에탄올 및 1x 페니실린/연쇄절제술(P/S)을 함유한 단계 II 분화 배지를 코스피/녹아웃 DMEM의 적절한 부피에 준비한다.
3. 차별화 3일째에, 매체를 흡기하고 스테이지 II 배지(예: 24웰 플레이트의 웰당 0.5mL)로 교체한다. 그런 다음 24 시간 동안 배양하십시오.
4. 차별화의 4 일째에, 매체를 흡인하고 스테이지 II 매체로 대체하십시오(예: 24웰 플레이트의 웰당 1mL).
5. 격일로 배지를 변경합니다(6일째에 매체를 교체).
   참고: 8일간의 분화 후, 분화세포는 HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA(진행에 필요한 HNF4α의 최소 80%)와 같은 간 전구 세포의 적절한 마커를 발현해야 한다.

5. 간구 분화

1. DBPS(0.2% BSA 포함) 및 0.22 μm 필터 멤브레인을 사용하여 10 μg/mL 간세포 성장 인자(HGF), 20 μg/mL 온코스타틴(OSM) 스톡 솔루션을 준비합니다.
2. 스테이지 III 분화 기본 매체(HepatoZYME-SFM(HZM) 배지를 10μM 하이드로코르티손-21-헤미쿠치네이트 및 1x P/S로 보충한다.
3. 예열된 단계 III 분화 배지의 적절한 부피에 20 ng/mL의 최종 농도에 10 ng/mL 및 OSM의 최종 농도에 HGF를 추가합니다.
4. 분화의 8 일째에, 세포로부터 의흡 단계 II 배지및 스테이지 III 배지로 대체 (예를 들어, 24 웰 플레이트의 웰 당 1 mL).
5. CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 10일 동안 세포를 배양할 수 있게 하고, 갓 추가된 분화 인자(일 8-18일)로 격일마다 Stage III 미디어를 변경합니다.
   참고: 18일간의 분화 후, 분화세포는 AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4와 같은 간세포의 특징적인 마커를 발현해야 한다. 알부민 양성 세포의 백분율은 일반적으로 90% 이상입니다.

6. RNA 절연, cDNA 합성 및 RT-qPCR 분석

1. 세포로부터 배지를 흡인하고 적절한 양의 RNAiso Plus 시약(예를 들어, 24웰 플레이트의 웰당 0.3mL)을 추가한다. 1.5 mL 튜브에서 상체를 수집하고 5 분 동안 RT에 서보자.
2. 클로로폼 시약 60μL을 추가하고 5분 동안 RT에 둡니다. 그런 다음 12,000 x g에서 15 분 동안 원심 분리기.
3. 125 μL 상체를 수집하고 다른 원심 분리 튜브로 전송합니다. 160 μL의 이소프로판올을 넣고 잘 섞은 후 RT에서 10분 간 서 있습니다.
4. 12,000 x g에서 10 분 동안 원심 분리기.
5. 상체를 제거하고 침전된 에탄올에 75% 에탄올을 넣고 7,500 x g에서 5분 동안 원심분리기를 추가합니다.
6. RT에서 건조한 후 DEPC 처리된 물 40μL을 추가하여 용해합니다. qPCR의 경우 제조업체의 프로토콜에 따라 역전사 키트를 사용하여 총 RNA의 2 μg를 역전사한다.
7. 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 키트를 사용하여 RT-qPCR을 수행합니다.
8. 비유도 줄기 세포에 비해 유전자 발현을 정상화하고 GAPDH로의 정상화에 따라 접이식 변이를 결정한다.

7. 분화의 면역형광 검증

1. PBS에 0.1% Tween-20을 추가하여 1배 PBST 세척 버퍼를 준비합니다.
2. 부착 된 세포에서 배지를 흡인하고 셰이커에 RT에서 PBS로 간단히 씻어.
3. PBS를 흡인하고 24웰 플레이트당 500μL의 얼음-차가운 메탄올로 세포를 배양하여 하룻밤 사이에 -20°C에서 세포를 고정시한다.
4. 메탄올을 제거하고 RT에서 매번 10 분 동안 셰이커에 PBS로 세포를 3 번 씻으시다.
5. 5% BSA의 500 μL를 가진 블록 셀은 셰이커에 RT에서 1-2 시간 PBS에서 제조.
6. 1에서 1: 200에서 차단에 사용되는 동일한 용액에 희석하십시오.
7. 300 μL 1차 항체 용액에서 셰이커에 4°C에서 하룻밤 사이에 고정 된 세포를 배양한다.
8. 하룻밤 잠복 후, 셰이커에 RT에서 매번 10 분 동안 PBST와 함께 3 번 셀을 씻으라.
9. 1:1000에서 차단 용액에 이차 항체 용액을 준비합니다.
10. 셰이커에서 RT에서 1h에 대한 빛으로부터 보호되는 이차 항체 용액의 300 μL에서 배양합니다.
11. 이차 항체 용액을 흡기하고 셰이커에 RT에서 매번 10 분 동안 PBST로 세포를 3 번 세척합니다.
12. 3-5 분 동안 1 μg / mL DAPI의 300 μL로 세포를 배양 한 다음 PBST로 두 번 세척하십시오.
13. PBST를 심은 후 형광 현미경으로 사진을 찍기 위해 적절한 양의 PBS를 추가하십시오.

8. 웨스턴 블롯 분석

1. 트리스 버퍼식염수(TBS)에 0.1% Tween-20을 추가하여 1배 TBST 세척 버퍼를 준비합니다.
2. 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 키트를 사용하여 SDS-PAGE 전기 전도 버퍼 및 서부 전달 버퍼를 준비합니다.
3. 총 세포 단백질(40 μg)을 10% 나트륨 도데실 황산 폴리아크라이아미드 젤에 분해하고 SDS-PAGE 전기포고리 완충에서 약 2시간 동안 일정한 전류로 실행한다.
4. 젤을 300mA상수 전류에서 300mA상수전류로 2시간 동안 저온에서 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 이송한다.
   참고: 사용 장비및 젤의 종류 및 비율에 따라 실행 시간 및 전송 시간이 달라질 수 있습니다.
5. 셰이커에서 RT에서 1 시간 동안 TBST에서 3 % BSA로 멤브레인을 차단하십시오.
6. 1차 항체 용액(1:1000 희석)에서 하룻밤 사이에 4°C에서 셰이커에 배양한다.
7. 하룻밤 잠복 후, 셰이커에 RT에서 시간 당 15 분 동안 TBST와 블로팅 멤브레인을 3 번 세척합니다.
8. 이차 항체 용액 (1:2000 희석)에서 셰이커에 RT에서 2 시간 동안 배양하십시오.
9. 이차 항체 용액을 버리고 TBST로 멤브레인을 3 번 세척하여 매번 15 분 동안, 쉐이커의 RT에서 세척하십시오.
10. 화학 발광 시약을 사용하여 면역 반응성 밴드를 시각화한 다음 사인 방사선 촬영이 뒤따릅니다. β 액틴을 로딩 컨트롤로 사용합니다.

9. 인도시아닌 그린 섭취

1. DMSO에서 200 mg/mL indocyanine 녹색 재고 솔루션을 준비하십시오.
2. 1 mg/mL의 최종 농도에 indocyanine 녹색 용액단계 III 분화 매체를 보충 하 여 작업 솔루션을 준비.
3. 37°C,_1-2h용 5% CO 2 인큐베이터에서 인큐베이터.
4. PBS로 세포를 3번 흡입하여 세척합니다.
5. 현미경으로 사진.

10. 주기적인 산성 쉬프 (PAS) 염색 및 헤마톡실린 -Eosin (H&E) 염색

1. 부착 된 세포에서 배지를 흡인하고 PBS로 두 번 간략하게 씻으세요.
2. 세포 고정을 위해 PBS를 흡인하고 하룻밤 동안 -20 °C에서 얼음 차가운 메탄올로 세포를 배양하십시오.
3. PAS 염색에 의한 글리코겐 저장을 시각화하고 제조업체의 지시에 따라 키트를 사용하여 H & E 염색에 의해 이중 핵세포를 관찰합니다.
4. 형광 현미경으로 이미지를 가져 가라.

11. CYP 활동을 위한 분석

1. 제조업체의 지침에 따라 시판되는 세포 기반 어약(P450-Glo Assays)을 사용하여 CYP450 활성을 측정합니다.
2. 테스트에 세 개의 독립적인 반복을 사용합니다. 데이터는 SD에 ± 평균으로 표시됩니다.

결과

각 분화 단계의 HESC 유도 및 대표 밝은 필드 이미지의 HLC 유도의 회로도는 도 1에표시됩니다. 1단계에서, 액티빈 A와 CHIR99021은 줄기 세포를 형성하여 엔도름 세포를 형성하도록 유도하기 위해 3일 동안 첨가되었다. 단계 II에서, 엔데담 세포는 5 일 동안 분화 배지로 처리 된 후 간 선조 세포로 분화. 스테이지 III에서는 HGF 및 OSM(그림1A)에서10일 만에 초기 ?...

토론

여기서는 hESC에서 HLC를 3단계로 유도하는 단계적 방법을 제시합니다. 첫 번째 단계에서액티빈 A와 CHIR99021은 hESC를 DE로 차별화하는 데 사용되었습니다. 두 번째 단계에서, KO-DMEM 및 DMSO는 간 선조 세포로 DE를 분화하기 위하여 이용되었습니다. 제 3 단계에서, HZM 플러스 HGF, OSM 및 하이드로 코르티손 21-hemisuccinate 나트륨 소금은 HLC로 간 선조 세포를 계속 분화하는 데 사용되었다.

?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma	M7522	For hepatic progenitor differentiation
488 labeled goat against mouse IgG	ZSGB-BIO	ZF-0512	For IF,second antibody
488 labeled goat against Rabbit IgG	ZSGB-BIO	ZF-0516	For IF,second antibody
Accutase	Stem Cell Technologies	7920	For cell passage
Activin A	peproTech	120-14E	For definitive endoderm formation
Anti - Albumin (ALB)	Sigma-Aldrich	A6684	For IF and WB, primary antibody
Anti - Human Oct4	Abcam	Ab19587	For IF, primary antibody
Anti - α-Fetoprotein (AFP)	Sigma-Aldrich	A8452	For IF and WB, primary antibody
Anti -SOX17	Abcam	ab224637	For IF, primary antibody
Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α)	Sigma-Aldrich	SAB1412164	For IF, primary antibody
B-27 Supplement	Gibco	17504-044	For definitive endoderm formation
BSA	Beyotime	ST023-200g	For cell blocking
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046	For definitive endoderm formation
DAPI	Beyotime	C1006	For nuclear staining
DEPC-water	Beyotime	R0021	For RNA dissolution
DM3189	MCE	HY-12071	For definitive endoderm formation
DMEM/F12	Gibco	11320-033	For cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879	For hepatic progenitor differentiation
DPBS	Gibco	14190-144	For cell culture
GlutaMAX	Gibco	35050-061	For hepatic progenitor differentiation
H&E staining kit	Beyotime	C0105S	For H&E staining
Hepatocyte growth factor (HGF)	peproTech	100-39	For hepatocyte differentiation
HepatoZYME-SFM (HZM)	Gibco	17705-021	For hepatocyte differentiation
Hydrocortisone-21-hemisuccinate	Sigma-Aldrich	H4881	For hepatocyte differentiation
Indocyanine	Sangon Biotech	A606326	For Indocyanine staining
Knock Out DMEM	Gibco	10829-018	For hepatic progenitor differentiation
Knock Out SR Multi-Species	Gibco	A31815-02	For hepatic progenitor differentiation
Matrigel hESC-qualified	Corning	354277	For cell culture
MEM NeAA	Gibco	11140-050	For hepatic progenitor differentiation
mTesR 5X Supplement	Stem Cell Technologies	85852	For cell culture
mTesR Basal Medium	Stem Cell Technologies	85851	For cell culture
Oncostatin (OSM)	peproTech	300-10	For hepatocyte differentiation
P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)	Promega	V8901	For CYP450 activity
PAS staining kit	Solarbio	G1281	For PAS staining
Pen/Strep	Gibco	15140-122	For cell differentiation
Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG	ZSGB-BIO	ZB-2305	For WB,second antibody
Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot	Beyotime	P0256	For primary antibody dilution
ReverTraAce qPCR RT Kit	TOYOBO	FSQ-101	For cDNA Synthesis
RNAiso Plus	TaKaRa	9109	For RNA Isolation
RPMI 1640	Gibco	11875093	For definitive endoderm formation
Skim milk	Sangon Biotech	A600669	For second antibody preparation
SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742	For RT-PCR Analysis
Torin2	MCE	HY-13002	For definitive endoderm formation
Tween	Sigma-Aldrich	WXBB7485V	For washing buffer preparation