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Resumen

Este manuscrito describe un protocolo detallado para la diferenciación de células madres embrionarias humanas (hESCs) en hepatocito-como las células funcionales (HLCs) complementando continuamente Activin A y CHIR99021 durante la diferenciación del hESC en el endodermo definitivo (DE).

Resumen

Las funciones potenciales de las células similares a hepatocitos (HLCs) derivadas de células madre embrionarias humanas (hESCs) son muy prometedoras para el modelado de enfermedades y las aplicaciones de detección de fármacos. Aquí se proporciona un método eficiente y reproducible para la diferenciación de hESCs en HLCs funcionales. El establecimiento de un linaje de endodermo es un paso clave en la diferenciación a hlcs. Por nuestro método, regulamos las vías de señalización clave mediante la suplementación continua de Activin A y CHIR99021 durante la diferenciación de hESC en endodermo definitivo (DE), seguido de la generación de células progenitoras hepáticas, y finalmente HLCs con morfología de hepatocitos típicos en un método stagewise con reactivos completamente definidos. Los HLCs derivados de hESC producidos por este método expresan marcadores específicos de la etapa (incluyendo albúmina, receptor nuclear HNF4α y polipéptido cotransportante de taurocolato de sodio (NTCP)), y muestran características especiales relacionadas con hepatocitos maduros y funcionales (incluyendo tinción verde de indocianina, almacenamiento de glucógeno, tinción de hematoxilina-eosina y actividad cyp3), y pueden proporcionar una plataforma para el desarrollo de aplicaciones basadas en HLC en el estudio de enfermedades hepáticas.

Introducción

El hígado es un órgano altamente metabólico que desempeña varias funciones, incluyendo la desoxidación, el almacenamiento de glucógeno, y la secreción y síntesis de proteínas1. Diversos patógenos, fármacos y herencia pueden causar cambios patológicos en el hígado y afectar sus funciones2,3. Los hepatocitos, como la unidad funcional principal del hígado, desempeñan un papel importante en sistemas artificiales de la ayuda del hígado y la eliminación de la toxicidad de la droga. Sin embargo, el recurso de hepatocitos humanos primarios es limitado en terapia basada en células, así como en la investigación de la enfermedad del higado. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas fuentes de hepatocitos humanos funcionales es una dirección de investigación importante en el campo de la medicina regenerativa. Desde 1998, cuando se han establecido las hESC4,las hESCs han sido ampliamente consideradas por los investigadores debido a su potencial de diferenciación superior (pueden diferenciarse en varios tejidos en un ambiente adecuado) y su alto grado de autorrerenovabilidad, y por lo tanto proporcionan células fuente ideales para hígados bioartificiales, trasplante de hepatocitos e incluso ingeniería de tejido hepático5.

Actualmente, la eficiencia de la diferenciación hepática puede incrementarse en gran medida enriqueciendo el endodermo6. En la diferenciación del linaje de las células madre en endodermo, los niveles del factor de crecimiento transformador β (TGF-β) señalización y WNT vías de señalización son los factores clave en el nodo de la etapa de formación de endodermo. La activación de un alto nivel de señalización de TGF-β y WNT puede promover el desarrollo de endodermo7,8. La activina A es una citoquina perteneciente a la superfamilia TGF-β. Por lo tanto, la activina A es ampliamente utilizada en la inducción de endodermo de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs) y hESCs9,10. GSK3 es una proteína quinasa de serina-treonina. Los investigadores han encontrado que CHIR99021, un inhibidor específico de GSK3β, puede estimular las señales típicas de WNT, y puede promover la diferenciación de células madre bajo ciertas condiciones, lo que sugiere que CHIR99021 tiene potencial para inducir la diferenciación de células madre en endodermo 11,12,13.

Aquí divulgamos un método eficiente y reproducible para inducir con eficacia la diferenciación de hESCs en HLCs funcionales. La adición secuencial de Activin A y CHIR99021 produjo cerca de 89,7±0,8% SOX17 (marcador de DE) - células positivas. Después de ser maduradas más a fondo in vitro,estas células expresaron marcadores específicos hepáticos y ejercieron hepatocito-como la morfología (basada en la coloración de la hematoxylin-eosina (H . E)) y las funciones, tales como absorción del verde del indocyanine (ICG), almacenamiento del glicógeno y actividad CYP3. Los resultados muestran que los hESCs se pueden distinguir con éxito en HLCs funcionales maduros por este método y pueden proporcionar una base para la investigación enfermedad-relacionada del higado y la investigación in vitro de la droga.

Protocolo

1. Mantenimiento de células madre

NOTA: El protocolo de mantenimiento celular descrito a continuación se aplica a la línea celular hES03 mantenida en una monocapa adherente. Para todos los siguientes protocolos en este manuscrito, las células deben manejarse bajo un gabinete de seguridad biológica.

  1. Prepare 1x mTesR stem cell culture medium diluyendo 5x supplementary medium to mTesR basic medium.
  2. Prepare 30x medio Matrigel calificado por hESC diluyendo 5 mL de Matrigel calificado para hESC con 5 mL de DMEM/F12 en el hielo. Conservar a -20 °C.
  3. Prepare 1x medio Matrigel calificado para hESC diluyendo 33.3 μL de Matrigel calificado para hESC de 30x con 1 mL de DMEM/F12.
  4. Recubre estériles 6 placas tratadas con cultivo de tejidos con 1 mL de Matrigel calificado para hESC en cada pozo con anticipación y guárdelo a 4 ° C durante la noche. Dejar a temperatura ambiente (RT) durante al menos 30 min antes de su uso.
  5. Descongelar los hESCs criopreservados en un baño de agua de 37 °C durante 3 min sin agitar. A continuación, transferir inmediatamente las células mediante pipeteo en un tubo de centrífuga de 15 mL que contiene 4 mL precalentados 37 °C mTesR medio, pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente 2 veces.
  6. Centrifugar los hESCs a 200 x g durante 2 min en RT.
  7. Aspirar el sobrenadante y resuspensar suavemente las células en 1 mL de medio mTesR.
  8. Aspirar el medio DMEM/F12 de la placa y sembrar las células en un pozo de placa de 6 pozos a una densidad de 1 x 105 células en 2 mL de mTesR.
  9. Incubar en una incubadora al 5% deCO2 y mantener las células reemplazando diariamente con medio mTesR precalentado. Pase las células en aproximadamente 70-80% de confluencia o cuando las colonias celulares comienzan a hacer contacto.

2. Paso y diferenciación de células madre

  1. Para las células de paso, aspirar el medio e incubar las células con 1 mL por pozo de solución enzimática (por ejemplo, Accutase durante 5 min a 37 °C. A continuación, transfiera las células mediante pipeteo a un tubo centrífugo de 15 mL que contenga 4 mL de DMEM/F12 precalentado a 37 °C.
  2. Centrifugar las células a 200 x g en RT durante 2 min.
  3. Aspirar el medio y resuspensar suavemente el pellet celular en 1 mL de medio mTesR.
  4. Prepare placas de 24 pozos recubriendo con 250 μL de 1x medio Matrigel calificado por hESC de antemano. Semillas hESCs como se describió anteriormente a una densidad de 1 - 1,5 x 105 células por pozo en 500 μL de medio mTesR.
  5. Deje que las células se incuban durante 24 h a 37 °C en una incubadora de CO2.

3. Formación de DE

  1. Preparar soluciones de stock de 100 μg/mL de Activina A con DPBS que contengan 0,2% de BSA y 3 mM de CHIR99021 con DMSO.
  2. Prepare el medio básico de diferenciación de la Etapa I complementando el medio RPMI con 1x B27.
  3. Añadir Activina A a una concentración final de 100 ng/mL y CHIR99021 a una concentración final de 3 μM en un volumen apropiado de medio básico de diferenciación en estadio I precalentado.
  4. Aspirar el medio mTesR de las células y reemplazarlo por medios de diferenciación en estadio I que contengan factores de diferenciación añadidos (por ejemplo, 0,5 mL por pozo de una placa de 24 pozos).
  5. Permita que las células se incuban durante 3 días a 37 °C en una incubadora de CO2, reemplazando diariamente los medios de estadio I con factores de diferenciación recién agregados (días 0-2).
    NOTA: Después de 3 días de diferenciación, las células diferenciadas deben expresar marcadores de células DE, como FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 y FOXA1 (mínimo 80% de SOX17 necesario para continuar).

4. Diferenciación de las células progenitoras hepáticas

  1. Prepare los medios básicos de diferenciación de la etapa II disolviendo el reemplazo del suero del knockout (KOSR) a una concentración final del 20% en knock out DMEM.
  2. Prepare el medio de diferenciación de la etapa II que contenga el 1% DMSO, 1x GlutaMAX, 1x solución del aminoácido no esencial (NEAA), 100 μM 2-mercaptoetanol y 1x penicilina/estreptomicina (P/S) al volumen apropiado de KOSR/knockout DMEM.
  3. En el día 3 de diferenciación, aspire el medio y reemplácelo con el medio de etapa II (por ejemplo, 0,5 mL por pozo de una placa de 24 pozos). A continuación, incubar durante 24 h.
  4. En el día 4 de diferenciación, aspire el medio y reemplácelo con el medio de etapa II (por ejemplo, 1 mL por pozo de una placa de 24 pozos).
  5. Cambie el medio cada dos días (reemplace el medio el día 6).
    NOTA: Después de 8 días de diferenciación, las células diferenciadas deben expresar marcadores apropiados de células progenitoras hepáticas, tales como HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (mínimo 80% de HNF4α necesario para proceder).

5. Diferenciación de hepatocitos

  1. Preparar 10 μg/mL de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), 20 μg/mL de oncostatina (OSM) soluciones de stock con DBPS (que contiene 0,2% de BSA) y filtrar con una membrana de filtro de 0,22 μm.
  2. Preparar el medio básico de diferenciación en estadio III (medio Hepatozyme-SFM (HZM) suplementado con hidrocortisona-21-hemisuccinato de 10 μM y 1x P/S).
  3. Añadir HGF a una concentración final de 10 ng/mL y OSM a una concentración final de 20 ng/mL al volumen apropiado de medio de diferenciación precalentado en etapa III.
  4. En el día 8 de diferenciación, aspire el medio de etapa II de las células y reemplácelo con el medio de etapa III (por ejemplo, 1 mL por pozo de una placa de 24 pozos).
  5. Permita que las células se incuban durante 10 días a 37 °C en una incubadora de CO2, cambiando los medios de etapa III cada dos días con factores de diferenciación recién agregados (días 8-18).
    NOTA: Después de 18 días de diferenciación, las células diferenciadas deben expresar marcadores característicos de hepatocitos, tales como AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4. El porcentaje de células albúmina-positivas es generalmente más el de 90%.

6. Aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y análisis rt-qPCR

  1. Aspirar el medio de las células y añadir la cantidad adecuada de reactivo RNAiso Plus, (por ejemplo, 0,3 mL por pozo de una placa de 24 pozos). Recoger el sobrenadante en un tubo de 1,5 mL y dejar reposar en RT durante 5 min.
  2. Añadir 60 μL de reactivo de cloroformo y dejarlo en RT durante 5 min. Luego centrífuga a 12.000 x g durante 15 min.
  3. Recoja el sobrenadante de 125 μL y transfiéralo a otro tubo de centrífuga. Añadir 160 μL de isopropanol, mezclar bien, y reposar en RT durante 10 min.
  4. Centrífuga a 12.000 x g durante 10 min.
  5. Retire el sobrenadante, agregue etanol al 75% al precipitado y centrífuga a 7,500 x g durante 5 min.
  6. Después de secar en RT, añadir 40 μL de agua tratada con DEPC para disolverla. Para qPCR, transcriba inversamente 2 μg de ARN total con un kit de transcripción inversa de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  7. Realice RT-qPCR utilizando un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  8. Normalizar la expresión génica en relación con las células madre no inducidas y determinar la variación del pliegue después de la normalización a GAPDH.

7. Validación de inmunofluorescencia de la diferenciación

  1. Prepare 1x Tampón de lavado de PBST agregando 0.1% de Tween-20 a PBS.
  2. Aspirar el medio de las células adherentes y lavar brevemente con PBS en RT en una coctelera.
  3. Aspirar PBS e incubar células con 500 μL de metanol helado por pozo de una placa de 24 pozos para fijar las células a -20 °C durante la noche.
  4. Retire el metanol y lave las células 3 veces con PBS en una coctelera durante 10 min cada vez en RT.
  5. Células de bloque con 500 μL de BSA al 5% preparadas en PBS durante 1-2 h a RT en una coctelera.
  6. Diluir el anticuerpo primario a 1: 200 en la misma solución utilizada para el bloqueo.
  7. Incubar las células fijas en una solución de anticuerpos primarios de 300 μL durante la noche a 4 °C en una coctelera.
  8. Después de la incubación durante la noche, lave las células 3 veces con PBST durante 10 min cada vez en RT en una coctelera.
  9. Prepare la solución secundaria del anticuerpo en la solución de bloqueo en 1:1000.
  10. Incubar en 300 μL de solución de anticuerpos secundarios protegida de la luz durante 1 h a RT en una coctelera.
  11. Aspirar la solución de anticuerpos secundarios y lavar las células 3 veces con PBST durante 10 min cada vez en RT en una coctelera.
  12. Incubar las células con 300 μL de 1 μg/mL DAPI durante 3-5 min, y luego lavar dos veces con PBST.
  13. Después de aspirar PBST, agregue una cantidad adecuada de PBS para tomar fotografías bajo un microscopio de fluorescencia.

8. Análisis de Western blot

  1. Prepare 1x Tampón de lavado TBST agregando 0.1% Tween-20 a solución salina tamponada tris (TBS).
  2. Prepare el tampón de electroforesis SDS-PAGE y el tampón de transferencia occidental utilizando un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  3. Resuelva la proteína total de la célula (40 μg) en un gel de la poliacrilamida del sulfato del dodecil del sodio del 10% y funcione en almacenador intermediario de la electroforesis de SDS-PAGE en la corriente constante de 15 mA por cerca de 2 h.
  4. Transfiera el gel a una membrana de difluoruro de polivinidideno (PVDF) a 300 mA de corriente constante durante 2 h a baja temperatura.
    NOTA: El tiempo de ejecución y el tiempo de transferencia pueden variar dependiendo del equipo utilizado y del tipo y porcentaje del gel.
  5. Bloquee la membrana con BSA al 3% preparado en TBST durante 1 h a RT en una coctelera.
  6. Incubar en solución de anticuerpos primarios (dilución 1:1000) durante la noche a 4 °C en una coctelera.
  7. Después de la incubación durante la noche, lave la membrana secante 3 veces con TBST durante 15 minutos por vez en RT en una coctelera.
  8. Incubar en solución de anticuerpos secundarios (dilución 1:2000) durante 2 h en RT en una coctelera.
  9. Deseche la solución de anticuerpos secundarios y lave la membrana 3 veces con TBST, durante 15 minutos cada vez, en RT en una coctelera.
  10. Visualice las vendas immunoreactive usando un reactivo de la quimioluminiscencia seguido por la autordiografía. Utilice β-actina como control de carga.

9. Absorción verde de indocyanine

  1. Preparar 200 mg/mL de solución verde de culata de indocianina en DMSO.
  2. Prepare una solución de trabajo complementando el medio de diferenciación de la etapa III con la solución verde de la indocyanina a una concentración final de 1 mg/mL.
  3. Incubar en una incubadora de 37 °C, 5% deCO2 durante 1-2 h.
  4. Aspirar el medio y lavar las células 3 veces con PBS.
  5. Fotografía bajo un microscopio.

10. Tinción periódica de Ácido-Schiff (PAS) y tinción de hematoxilina-eosina (H&E)

  1. Aspirar el medio de las células adherentes y lavar brevemente dos veces con PBS.
  2. Para la fijación celular, aspirar PBS e incubar células con metanol helado a -20 °C durante la noche.
  3. Visualice el almacenamiento de glucógeno por tinción PAS y observe las células binucleadas por tinción H + E utilizando un kit siguiendo las instrucciones del fabricante.
  4. Tome imágenes con un microscopio de fluorescencia.

11. Ensayo para la actividad del CYP

  1. Mida la actividad del CYP450 utilizando ensayos basados en células disponibles en el comercio (ensayos P450-Glo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Utilice tres repeticiones independientes para las pruebas. Los datos se representan como la media ± DE.

Resultados

El diagrama esquemático de la inducción de HLC a partir de hESCs y las imágenes representativas de campo brillante de cada etapa de diferenciación se muestran en la Figura 1. En la etapa I, Activin A y CHIR99021 fueron agregados por 3 días para inducir a las células madres para formar las células del endodermo. En la etapa II, las células del endodermo diferenciadas en células progenitoras hepáticas después de ser tratadas con medio de diferenciación durante 5 días. En el estadi...

Discusión

Aquí, presentamos un método gradual que induce HLCs de hESCs en tres etapas. En la primera etapa, Activin A y CHIR99021 se utilizaron para diferenciar hESCs en DE. En la segunda etapa, KO-DMEM y DMSO fueron utilizados para distinguir DE en las células hepáticas del progenitor. En la tercera etapa, HZM más HGF, OSM y la sal de sodio del hemisuccinate 21 de la hidrocortisona fueron utilizados para continuar diferenciando las células hepáticas del progenitor en HLCs.

Los siguientes pasos c...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta labor contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81870432 y 81570567 a X.L.Z.), (Nº 81571994 a P.N.S.); the Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (No. 2020A1515010054 to P.N.S.), The Li Ka Shing Shantou University Foundation (No. L1111 2008 a P.N.S.). Nos gustaría agradecer al Prof. Stanley Lin de la Facultad de Medicina de la Universidad de Shantou por sus útiles consejos.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigmaM7522For hepatic progenitor differentiation
488 labeled goat against mouse IgGZSGB-BIOZF-0512For IF,second antibody
488 labeled goat against Rabbit IgGZSGB-BIOZF-0516For IF,second antibody
AccutaseStem Cell Technologies7920For cell passage
Activin ApeproTech120-14EFor definitive endoderm formation
Anti - Albumin (ALB)Sigma-AldrichA6684For IF and WB, primary antibody
Anti - Human Oct4AbcamAb19587For IF, primary antibody
Anti - α-Fetoprotein (AFP)Sigma-AldrichA8452For IF and WB, primary antibody
Anti -SOX17Abcamab224637For IF, primary antibody
Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α)Sigma-AldrichSAB1412164For IF, primary antibody
B-27 SupplementGibco17504-044For definitive endoderm formation
BSABeyotimeST023-200gFor cell blocking
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046For definitive endoderm formation
DAPIBeyotimeC1006For nuclear staining
DEPC-waterBeyotimeR0021For RNA dissolution
DM3189MCEHY-12071For definitive endoderm formation
DMEM/F12Gibco11320-033For cell culture
DMSOSigma-AldrichD5879For hepatic progenitor differentiation
DPBSGibco14190-144For cell culture
GlutaMAXGibco35050-061For hepatic progenitor differentiation
H&E staining kitBeyotimeC0105SFor H&E staining
Hepatocyte growth factor (HGF)peproTech100-39For hepatocyte differentiation
HepatoZYME-SFM (HZM)Gibco17705-021For hepatocyte differentiation
Hydrocortisone-21-hemisuccinateSigma-AldrichH4881For hepatocyte differentiation
IndocyanineSangon BiotechA606326For Indocyanine staining
Knock Out DMEMGibco10829-018For hepatic progenitor differentiation
Knock Out SR Multi-SpeciesGibcoA31815-02For hepatic progenitor differentiation
Matrigel hESC-qualifiedCorning354277For cell culture
MEM NeAAGibco11140-050For hepatic progenitor differentiation
mTesR 5X SupplementStem Cell Technologies85852For cell culture
mTesR Basal MediumStem Cell Technologies85851For cell culture
Oncostatin (OSM)peproTech300-10For hepatocyte differentiation
P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)PromegaV8901For CYP450 activity
PAS staining kitSolarbioG1281For PAS staining
Pen/StrepGibco15140-122For cell differentiation
Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgGZSGB-BIOZB-2305For WB,second antibody
Primary Antibody Dilution Buffer for Western BlotBeyotimeP0256For primary antibody dilution
ReverTraAce qPCR RT KitTOYOBOFSQ-101For cDNA Synthesis
RNAiso PlusTaKaRa9109For RNA Isolation
RPMI 1640Gibco11875093For definitive endoderm formation
Skim milkSangon BiotechA600669For second antibody preparation
SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742For RT-PCR Analysis
Torin2MCEHY-13002For definitive endoderm formation
TweenSigma-AldrichWXBB7485VFor washing buffer preparation

Referencias

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