Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذا البروتوكول ، يتم إنتاج ناقل AAV2 عن طريق زراعة خلايا الحشرات Spodoptera frugiperda (Sf9) مع فيروس الكولو (BV) - AAV2 - بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) أو الجين العلاجي وBV-AAV2-rep-cap المصابة خلايا Sf9 في ثقافة التعليق. يتم تحرير جزيئات AAV من الخلايا باستخدام المنظفات ، وتوضيحها ، وتنقيتها عن طريق الكروماتوغرافيا عمود تقارب ، وتتركز عن طريق ترشيح تدفق عرضي.

Abstract

تعد الفيروسات المرتبطة بالأدينو (AAV) ناقلات واعدة لتطبيقات العلاج الجيني. هنا، يتم إنتاج ناقلات AAV2 من قبل الثقافة المشتركة للخلايا Spodoptera frugiperda (Sf9) مع خلايا Sf9 المصابة بفيروس الباكولو (BV) - AAV2 - GFP (أو الجينات العلاجية) وBV-AAV2-rep-cap في ثقافة التعليق الخالية من المصل. يتم استزراع الخلايا في قارورة في شاكر مداري أو مفاعل حيوي للموجة. لإطلاق جزيئات AAV ، يتم lysed الخلايا المنتجة في العازلة التي تحتوي على المنظفات ، والتي يتم توضيحها لاحقا عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة والترشيح. يتم تنقية جزيئات AAV من lysate الخلية باستخدام الكروماتوغرافيا عمود AVB Sepharose ، الذي يربط جزيئات AAV. يتم غسل الجسيمات المقيدة مع برنامج تلفزيوني لإزالة الملوثات و eluted من الراتنج باستخدام العازلة سيترات الصوديوم في pH 3.0. يتم تحييد الإيلوات الحمضي مع العازلة القلوية Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0)، المخفف مع المالحة العازلة بالفوسفات (PBS)، وتتركز بشكل أكبر مع ترشيح التدفق العرضي (TFF). يصف البروتوكول إنتاج ناقلات ما قبل السريرية على نطاق صغير متوافق مع التوسع في تصنيع AAV على نطاق واسع من الدرجة السريرية لتطبيقات العلاج الجيني البشري.

Introduction

الفيروسات المرتبطة أدينو (AAV) هي غير مغلفة parvoviruses الإنسان التي تحتوي على الحمض النووي واحد تقطعت بهم السبل من 4.6 kb. ناقلات AAV لها العديد من المزايا على ناقلات الفيروسية الأخرى لتطبيقات العلاج الجيني1،2،3،4. AAVs بشكل طبيعي النسخ المتماثل غير كفء، وبالتالي، تتطلب فيروس مساعد والآلات المضيفة للنسخ المتماثل. AAVs لا تسبب أي مرض وانخفاض المناعة في المضيف المصاب3،5. AAV يمكن أن تصيب كل من الخلايا هادئة وتقسيم بنشاط ويمكن أن تستمر كما episome دون الاندماج في الجينوم من الخلايا المضيفة (AAV نادرا ما تدمج في الجينوم المضيف)1،3. جعلت هذه الميزات AAV أداة مرغوبة لتطبيقات العلاج الجيني.

لتوليد ناقل نقل الجينات AAV، يتم استنساخ كاسيت المتحولين جنسيا، بما في ذلك الجين العلاجي، بين اثنين من التكرارات الطرفية الداخلية (ITRs)، والتي عادة ما تكون مشتقة من النمط المصلي AAV 2. الحد الأقصى لحجم من 5 'ITR إلى 3' ITR، بما في ذلك تسلسل transgene، هو 4.6 كيلو بايت6. قد يكون لدى القبعات المختلفة خلية أو أنسجة مختلفة. لذلك ، يجب اختيار capsids استنادا إلى نوع الأنسجة أو الخلية المقصود استهدافه بمتجه AAV7.

وعادة ما تنتج ناقلات AAV المؤتلفة في خطوط خلايا الثدييات مثل خلايا الكلى الجنينية البشرية، HEK293 عن طريق العدوى العابرة لنقل نقل الجينات AAV، AAV إعادة الغطاء، ومساعد فيروس plasmids2،3. ومع ذلك، هناك العديد من القيود لإنتاج AAV على نطاق واسع عن طريق العدوى العابرة للخلايا HEK293 الملتصقة. أولا، هناك حاجة إلى عدد كبير من مداخن الخلايا أو زجاجات الأسطوانة. ثانيا، هناك حاجة إلى الحمض النووي عالي الجودة وواشف العدوى، مما يزيد من تكلفة التصنيع. وأخيرا، عند استخدام خلايا HEK293 الملتصقة، غالبا ما تكون هناك حاجة إلى المصل لإنتاج الأمثل، مما يعقد معالجة المصب1،2،3. طريقة بديلة لتصنيع AAV ينطوي على استخدام خط الخلية الحشرية، Spodoptera frugiperda (Sf9) الخلايا، وفيروس حشرة يسمى المؤتلف أوتوغرافا californica فيروس متعدد الكبسولات النووية متعددة الخلايا (AcMNPV أو فيروس baculovirus)8،9،10. تزرع خلايا Sf9 في ثقافة التعليق الخالية من المصل التي يسهل توسيع نطاقها وتتوافق مع إنتاج ممارسة التصنيع الجيدة الحالية (cGMP) على نطاق واسع ، والتي لا تتطلب بلازميد أو كاشفات العدوى. وعلاوة على ذلك، فإن تكلفة إنتاج AAV باستخدام نظام الفيروسات الكولوية Sf9 أقل من تكلفة استخدام العدوى العابرة للبلازميدات في خلايا HEK29311.

استخدم نظام إنتاج rAAV الأصلي باستخدام خلايا baculovirus-Sf9 ثلاثة فيروسات باكولو: فيروس باكولو واحد يحتوي على كاسيت نقل الجينات ، والثاني فيروس باكولو يحتوي على جين مندوب ، والثالث فيروس باكولو يحتوي على جين capsid خاص بالنمط المصلي12،13. ومع ذلك ، كان فيروس الباكولو الذي يحتوي على بناء مندوب غير مستقر وراثيا عند جولات متعددة من الممرات ، مما منع تضخيم فيروس الباكولو لإنتاج AAV على نطاق واسع. لحل هذه المشكلة، تم تطوير نظام ناقلات rAAV جديدة، والتي تحتوي على اثنين من الفيروسات الكولوجينية (TwoBac): واحد baculovirus تحتوي على كاسيت نقل الجينات AAV وآخر baculovirus تحتوي على الجينات AAV إعادة الغطاء معا والتي هي وراثيا أكثر استقرارا من النظام الأصلي وأكثر ملاءمة لإنتاج rAAV بسبب استخدام TwoBac بدلا من ثلاثة14، 15. يستخدم نظام OneBac كاسيت نقل الجينات AAV وجينات إعادة الغطاء في فيروس باكولو واحد وهو أكثر ملاءمة لإنتاج rAAV بسبب استخدام فيروس باكولو واحد بدلا من استخدام TwoBac أو ThreeBac2،16،17. في دراستنا ، تم استخدام نظام TwoBac للتحسين.

نظام الفيروسات الكولوية لإنتاج AAV له أيضا قيود: جزيئات فيروس الكولو غير مستقرة للتخزين على المدى الطويل في المتوسط الخالي من المصل11، وإذا كان تاتر فيروس الباكولو منخفضا ، ف هناك حاجة إلى كمية كبيرة من الفيروس الكولوفيروسي الفائق ، والتي قد تصبح سامة لنمو خلايا Sf9 أثناء إنتاج AAV (الملاحظة الشخصية). استخدام خلايا الحفاظ على الخلايا المصابة أقل تيتر وتوسيع نطاق (TIPS) الخلايا، أو خلايا الحشرات المصابة بفيروس الكولو (BIIC)، ويوفر خيارا جيدا لإنتاج AAV التي يتم إعداد خلايا Sf9 المصابة بفيروس الباكولو، cryopreserved، وتستخدم في وقت لاحق لعدوى خلايا Sf9 الطازجة. ميزة أخرى هي زيادة استقرار فيروس الباكولو (BV) في خلايا Sf9 بعد التبريد10،11.

يتم إنشاء نوعين من خلايا TIPS لتمكين إنتاج AAV: الأول عن طريق عدوى خلايا Sf9 مع BV-AAV2-GFP أو الجين العلاجي ، والثاني عن طريق عدوى خلية Sf9 مع BV-AAV2-rep-cap. يتم تقديم خلايا TIPS في الاقتباسات الصغيرة والجاهزة للاستخدام. يتم إنتاج ناقلات AAV في ثقافة التعليق الخالية من المصل في قارورة توضع في شاكر مداري أو مفاعل حيوي Wave عن طريق زراعة خلايا TIPS المشتركة التي تنتج الفيروسات الكولوئية وخلايا Sf9 الطازجة. يتم إصابة خلايا Sf9 بفيروسات الباكولو التي تحمل ناقل AAV2-GFP وتسلسلات إعادة الغطاء لتوليد AAV. بعد أربعة إلى خمسة أيام ، عندما تكون عوائد AAV هي الأعلى ، يتم زفر الخلايا المنتجة بالمنظفات لإطلاق جزيئات AAV. يتم توضيح lysate الخلية في وقت لاحق عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة والترشيح. يتم تنقية جزيئات AAV من اللستات بواسطة الكروماتوغرافيا عمود AVB Sepharose. وأخيرا، تتركز ناقلات AAV باستخدام TFF. يصف البروتوكول إنتاج AAV على نطاق صغير ، مفيد للأبحاث والدراسات ما قبل السريرية. ومع ذلك ، فإن الأساليب قابلة للتطوير ومتوافقة مع تصنيع ناقلات AAV من الدرجة السريرية لتطبيقات العلاج الجيني.

Protocol

انظر الشكل 1 للحصول على رسم توضيحي يلخص البروتوكول.

1. جيل من خلايا TIPS المصابة بفيروس باكولو

  1. تذوب قارورة واحدة من خلايا Sf9 وبذورها على الفور في 50 مل من وسيطة زراعة خلايا الحشرات. تنمو خلايا Sf9 في حاضنة شاكر المدارية في 125 دورة في الدقيقة و 28 درجة مئوية في قوارير القاع الجولة مع غطاء تعلق فضفاضة لتبادل الهواء8،9. نشر الخلايا في قارورة 1 لتر تحتوي على 200 مل من المتوسطة للحصول على خلايا كافية لإنتاج خلايا TIPS.
  2. إضافة 50 مل من خلايا Sf9 في 2 × 106 خلايا / مل في قارورتين: تصيب قارورة واحدة من خلايا Sf9 مع 0.5 مل من فيروس الكولو (BV) - AAV2 - GFP (أو الجين العلاجي) وقارورة أخرى من الخلايا مع 0.5 مل من BV-AAV2-rep-cap.
    ملاحظة: تم توفير البلازميدات ناقلات AAV بسخاء من قبل الدكتور روبرت M. كوتين (المعاهد القومية للصحة). وقد وصفت إنتاج فيروس Baculo من الحمض النووي bacmid (نظام البكالوريا إلى البكالوريا) سابقا8،9. استقرار الفيروس الكولو أثناء المرور هو مشكلة حرجة لتوسيع إنتاج rAAV. فمن الأفضل استخدام عدد أقل من مرور baculovirus (حتى مرور عدد 4). تحديد الحجم الأمثل للناقم الفيروس الكولوني تجريبيا عن طريق التحقق من كفاءة العدوى بالفيروسات الباكولو باستخدام قياس التدفق الخلوي(الشكل 2)أثناء إنتاج خلايا TIPS.
  3. رصد العدوى بالفيروسات الكولوية 3-4 أيام بعد العدوى عن طريق تلطيخ gp64 baculovirus في خلايا Sf9 المصابة على النحو التالي.
    1. وصمة عار 2 × 105 خلايا SF9 (كل من الخلايا غير المصابة وفيروس baculo) مع 0.5 ميكروغرام من الأجسام المضادة للفأرة المضادة للفيروسات الكولوبولية gp64 (1:200) التي تحتوي على صبغة الفلورسنت في 100 ميكروغرام من العازلة حجب لمدة 30 دقيقة في درجة الحرارة المحيطة.
    2. غسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة الأجسام المضادة وإعادة إنفاق الخلايا الملطخة في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5٪ ألبوم مصل البقري.
    3. تحليل التعبير gp64 فيروس baculo على الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي (الشكل 2).
      ملاحظة: تحديد استراتيجية gating للحصول على قياس التدفق الخلوي وتحليل تجريبيا. يتم الحصول على ما مجموعه 10،000 خلية حية واحدة. يشير تعبير فيروس باكولو gp64 على أسطح خلايا Sf9 إلى عدوى فيروس الباكولو. بعد 3-4 أيام، معظم الخلايا SF9 تصبح مصابة بالفيروس الباكولو، كما يتضح من التعبير gp64 فيروس baculo (الشكل 2).
  4. عندما تكون الخلايا 80٪ -90٪ قابلة للحياة مع زيادة في القطر(الشكل 3)،حصاد الخلايا والتبريد 1 × 107 خلايا في 1 مل من الحشرات ثقافة المتوسطة تكملها 10٪ مصل البقر الجنين و 10٪ ديميثيل سلفوإكسيد في حاوية بطيئة التجمد في -80 درجة مئوية. في اليوم التالي، نقل أنبوب يحتوي على خلايا TIPS إلى ثلاجة النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
    ملاحظة: إجراء زراعة الخلايا في خزانة السلامة البيولوجية باتباع تقنية المختبر العقيم القياسية في مستوى السلامة البيولوجية 2 (BSL-2).

2. إنتاج ناقلات AAV

  1. اليوم الأول: الخلايا Sf9 المشاركة في الثقافة مع خلايا TIPS المصابة بفيروس الباكولو
    1. زراعة وزراعة خلايا Sf9 ساذجة في 1 × 106 خلايا / مل في 28 درجة مئوية في عدة قوارير 2 لتر تحتوي على 400 مل من الخلايا الحشرية المتوسطة في حاضنة شاكر التي هي مطلوبة لإنتاج AAV. بعد 3-4 أيام، يتم زيادة كثافة الخلية تصل إلى 5 × 106-6 × 106 خلايا / مل.
      ملاحظة: CO2 والرطوبة ليست عوامل هامة لنمو خلايا SF9.
    2. البذور الخلايا SF9 إما في قوارير اهتزاز أو في مفاعل حيوي على النحو التالي.
      1. إنتاج AAV في قوارير في حاضنة شاكر المدارية: استخدام ماصة أو مضخة معج للبذور 400 مل من ثقافة Sf9 في 2 × 106 خلايا / مل في قارورة 2 L aseptically. إعداد شاكر المداري في 125 دورة في الدقيقة و 28 درجة مئوية.
        ملاحظة استخدم مضخة معمومة أو ماصة قياسية اعتمادا على حجم إنتاج AAV.
      2. إنتاج AAV في مفاعل حيوي: استخدم مضخة تعلجية لزرع 1 لتر من ثقافة Sf9 عند 2 × 106 خلايا / مل في كيس مفاعل حيوي 10 لتر بشكل مطهر. قم بتحميل الكيس على وحدة المفاعل الحيوي للاستزراع عند 28 درجة مئوية. أضف 40٪ من الأكسجين إلى كيس المفاعل الحيوي عند 0.1 psi. قم بإعداد وحدة المفاعل الحيوي بزاوية 20 درجة وهز الحقيبة عند 25 دورة في الدقيقة.
    3. إذابة قارورة واحدة من كل BV-AAV2-GFP (أو الجين العلاجي) وBV-AAV2-rep-cap TIPS الخلايا. تمييع الخلايا مع 20 مل من الحشرات المتوسطة والثقافة وإجراء عدد صلاحية الخلايا باستخدام الأزرق تريبان. تلقيح كل من الخلايا TIPS بنسبة 1:10،000 بالنسبة للخلايا Sf9 السذاجة المستزرعة في قارورة شاكر أو مفاعل حيوي.
      ملاحظة: يتم تقليل بقاء خلايا TIPS بسبب التبريد، ومعدل الاسترداد هو حوالي 50٪ عندما يتم تحديد صلاحية الخلية مع تلطيخ الأزرق تريبان. إجراء تجربة تجريبية لتحديد تجريبي لنسبة خلايا TIPS وخلايا Sf9 السذاجة قبل إنتاج rAAV على نطاق واسع.
  2. اليوم الثاني: رصد الثقافة
    1. حصاد 1 مل من ثقافة Sf9 بشكل مطهر. وصمة عار مع صبغة تريبان الزرقاء لتحليل عدد الخلايا، وقابلية البقاء، ومورفولوجيا.
  3. اليوم الثالث: رصد الثقافة والتغذية
    1. حصاد 1 مل من ثقافة Sf9 وتحليل عدد الخلايا، وقابلية البقاء، ومورفولوجيا. تحقق من حالة عدوى فيروس الكولو بعد تلطيخ خلايا Sf9 كما هو مذكور في الخطوة 1.3.
      ملاحظة: الزيادة في قطر الخلية وتأثير الخلايا هي مؤشرات على عدوى فيروس الكولو. الزيادة في القطر يسبق انخفاض في صلاحية الخلية، وتستخدم هذه المعلمات لتحديد وقت حصاد الخلية أثناء إنتاج AAV. تحديد نقطة الوقت الأمثل تجريبيا.
    2. تغذية ثقافة Sf9 مع الحشرات الطازجة المتوسطة زراعة بنسبة 1:5 aseptically.
  4. اليوم الرابع: رصد الثقافة
    1. حصاد 1 مل من ثقافة Sf9 وتحليل عدد الخلايا، وقابلية البقاء، ومورفولوجيا. قطع إمدادات الأكسجين من كيس المفاعل الحيوي.
  5. اليوم الخامس: رصد الثقافة وحصادها
    1. حصاد 1 مل من ثقافة Sf9 وتحليل عدد الخلايا، وقابلية البقاء، ومورفولوجيا. حصاد ثقافة المتوسطة والخلايا عندما Sf9 خلية البقاء قد انخفض إلى حوالي 50 ٪ (الشكل 4).
    2. تدور تعليق الخلية في 2100 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية. جمع supernatant بيليه الخلية ، وتخزينها في -80 درجة مئوية.

3. تحلل الخلايا والإفراج عن AAV

  1. إذابة بيليه الخلية المنتج AAV. إضافة 100 مل من العازلة تحلل الخلية (20 mM تريس-HCl درجة الحموضة 8.0، 150 mM كلوريد الصوديوم، 0.5 ٪ تريتون-X-100) إلى بيليه الخلية، مزيج بقوة، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة الحرارة المحيطة للافراج عن جزيئات AAV.
  2. جهاز الطرد المركزي في 2100 × غرام لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية ونقل lysate الخلية إلى حاوية جديدة. خلط الخلية lysate والثقافة الخلية supernatant بعد ذوبان الجليد.
  3. إضافة 20 U / مل النيوكليز و 10 مللي متر MgCl2 إلى lysate الخلية لهضم الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي. حضانة لمدة 2-4 ساعة في 37 درجة مئوية.
  4. تصفية lysate من خلال 0.8 ميكرومتر و 0.2 μmpolyethersulfone نظام الترشيح المزدوج باستخدام مضخة.
  5. تخزين lysate الخلية الموضحة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو تنقية AAV فورا.

4. تنقية ناقلات AAV باستخدام نظام الكروماتوغرافيا عمود تقارب

  1. إعداد أداة الكروماتوغرافيا عن طريق غسل العينة والخطوط العازلة بالماء العقيم، 1 N هيدروكسيد الصوديوم، والماء، والمحلول الملحي العازل بالفوسفات (PBS، درجة الحموضة 7.4) بمعدل تدفق 50 مل/دقيقة.
  2. قم بتركيب عمود AVB Sepharose (10.0 مل) في نظام الكروماتوغرافيا، وتشغيل 100 مل من برنامج تلفزيوني بمعدل تدفق 5 مل/دقيقة.
    ملاحظة: استخدم حجم أقل أو أعلى من عمود AVB Sepharose اعتمادا على مقياس إنتاج AAV وإعداد معدل التدفق كما اقترح من قبل الشركة المصنعة للعمود أو الراتنج (انظر جدول المواد).
  3. لجمع كسور العمود من خلال حل التمرير، وغسل العازلة، ومخازن مؤقتة elution تحتوي على جزيئات AAV، إدراج أنابيب في فتحات جامع الكسور من الصك الكروماتوغرافيا.
  4. إعادة توازن العمود مع برنامج تلفزيوني بمعدل تدفق 5.0 مل / دقيقة.
  5. قم بتحميل lysate الخلية المصفاة التي تحتوي على جزيئات AAV على العمود باستخدام آلة الكروماتوغرافيا المجهزة بمضخة عينة. تشغيل العينة بمعدل تدفق 3.0 مل لكل دقيقة.
  6. تشغيل برنامج تلفزيوني من خلال العمود سيفاروز AVB بمعدل تدفق 3.0 مل / دقيقة حتى منحنى امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (UV) (280 نانومتر) يعود إلى خط الأساس ويصبح مستقرا.
  7. Elute جزيئات AAV من العمود مع 50 mM سيترات الصوديوم (الرقم الحموضة 3.0) العازلة بمعدل تدفق 3.0 مل / دقيقة (الشكل 5).
    ملاحظة: في حين أن جزيئات AAV تنأى بنفسها عن الراتنج وتمر عبر كاشف الأشعة فوق البنفسجية ، يمكن رؤية ذروة elution من البروتين على الكروماتوجرام.
  8. تخفيف فورا AAV supernatant مع حجم خمس 500 mM تريس-HCl (pH 8.0) لزيادة pH من AAV تحتوي على supernatant إلى ما يقرب من pH 5.5 لمنع تدهور بH بوساطة مع العازلة elution الحمضية. علاوة على ذلك ، تمييع AAV supernatant 10 أضعاف مع برنامج تلفزيوني لتحييد كامل لحاء.
    ملاحظة: قيمة pH حوالي 5.5 بعد تحييد الحل rAAV. بعد تحييد AAV، تمييع الحل rAAV 10 أضعاف مع برنامج تلفزيوني (pH 7.4) بحيث AAV هو في المخزن المؤقت الفسيولوجي.
  9. تخزين 1 مل من كل عينة من العمود من خلال تشغيل، وغسل العازلة، و 100 ميكرولتر من الناسخ AAV eluted لتقييم وجود AAV عن طريق العدوى من الخلايا المستهدفة.
  10. تنظيف العمود سيفاروز AVB مع 100 مل من حمض الستريك 100 mM (درجة الحموضة 2.1) و 100 مل من برنامج تلفزيوني (pH7.4) بمعدل تدفق 5.0 مل / دقيقة. شطف العمود مع الإيثانول 20٪ بمعدل تدفق 5.0 مل / دقيقة وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  11. تنظيف خطوط أنابيب أداة الكروماتوغرافيا مع وضع العمود دون اتصال كما هو موضح في القسم 4.1. وأخيرا، شطف نظام الكروماتوغرافيا مع 200 مل من الإيثانول 20٪ بمعدل تدفق 50.0 مل / دقيقة وتخزينها في الإيثانول 20٪.

5. تركيز و diafiltration من ناقلات AAV باستخدام ترشيح تدفق عرضية (TFF)

  1. إعداد نظام TFF مجهزة خرطوشة غشاء البولي سلفون (100 كيلودا خفض الوزن الجزيئي) لتركيز AAV.
  2. وحدة TFF متساوية مع 200 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.
  3. قم بتحميل عينة AAV عن طريق التحكم في تدفق المضخة حتى يتم تقليل العينة إلى الحجم المطلوب مع الحفاظ على ضغط عبر الغشاء عند 2-3 psi.
  4. Diafiltrate retentate مع 100 مل من برنامج تلفزيوني ، كما هو مستخدم في هذه الدراسة ، أو تحديد تجريبيا عازلة بديلة تدعم الاستقرار على المدى الطويل من AAV.
  5. بعد تركيز عينة AAV على الحجم المطلوب، قم بجمع عينة AAV، وتصفية من خلال البولي إيثيليفلتر 0.2 ميكرومتر، أليكوت، ومن ثم تخزينه في -80 درجة مئوية.

6. عدوى عينات AAV في الخلايا المستهدفة لتقييم وجود AAV في خطوات تنقية

  1. تلقيح 7 × 104 خلايا HT1080 / جيدا في لوحة 24 جيدا في 500 ميكرولتر من متوسط النسر المعدلة دولبيكو (DMEM) تكملها مع 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ بيروفاتي الصوديوم، و 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) في اليوم السابق للعدوى. زراعة الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  2. عد الخلايا قبل العدوى. إضافة عينة مجمع AAV المخفف غير منقى قبل تشغيل العمود، العمود تشغيل من خلال العينات، غسل العازلة، وعينة AAV تنقية eluted.
    ملاحظة: عد الخلايا الملونة الزرقاء تريبان مع مقياس الدم. تحديد عامل التخفيف وحجم (μL) من عينات AAV تجريبيا. كلما ارتفع الثدي AAV، وهناك حاجة إلى مزيد من التخفيف. تأكد من أن جزيئات الفيروس الكولو من العينة السائبة غير المتحققة قبل تشغيل العمود ، عينات تشغيل العمود ، يتم تعطيل عازل الغسيل عند 50 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة قبل إصابة الخلايا المستهدفة لتحديد المعايرة المعدية من AAV.
  3. بعد يومين من العدوى، قم بتحليل تعبير البروتين (على سبيل المثال، GFP أو الجين العلاجي) في الخلايا باستخدام مقياس تدفق الخلايا.
  4. حساب titers المعدية من AAV باستخدام عدد من الخلايا في وقت العدوى، عامل التخفيف، والنسبة المئوية للخلايا GFP + مع الصيغة: (العدد الإجمالي للخلايا x النسب المئوية GFP + الخلايا x عامل التخفيف) / حجم AAV في ملليلتر.
    ملاحظة: على سبيل المثال، عدد الخلايا هو 1 × 105،النسبة المئوية لخلايا GFP+ هي 3.4٪، وعامل التخفيف هو 100، وحجم AAV المضافة هو 2 ميكرولتر. titer من AAV هو 1.7 × 108 وحدة المعدية (IU)/مل. الكمية الإجمالية من الجسيمات AAV المنقى في 25 مل من الكسر eluted هو 4.3 × 109 وحدات المعدية (IU) / مل (الشكل 6). ويبلغ العدد الإجمالي للجسيمات الأولية غير المنقوطة من الطائرات بدون طيار 1.09 × 1010 وحدة IU/mL، وتبلغ جزيئات AAV المنقى 4.3 × 109 وحدة IU/mL. ولذلك، فإن النسبة المئوية للاسترداد هي 39.4٪. يجب أن تكون النسبة المئوية لخلايا GFP + بين 1٪ -30٪، وهو ما يتوافق مع نطاق خطي عند استخدامه لحساب titer المعدية من AAV. إذا كانت الجسيمات المتجهة AAV أكثر تركيزا مصابة في الخلايا المستهدفة؛ هناك احتمال أن نسخ متعددة من جزيئات AAV قد تصيب خلية واحدة من شأنها أن تظهر على أنها نسخة واحدة من المتجه. لذلك، تمييع ناقل AAV الفائق للحصول على عدوى ناقل 1٪-30٪ في الخلايا المستهدفة. إذا لم يكن لدى ناقل AAV جين مراسل، لطخ المتحول أو الجين العلاجي الذي يعبر عنه ناقل AAV بأجسام مضادة تحتوي على صبغة فلورية يمكن اكتشافها وكميتها باستخدام مقياس تدفق الخلايا. ليس كل الأنماط المصلية AAV يمكن أن تصيب بكفاءة خلايا HT1080. لذلك، لإجراء اختبار العدوى للأنماط المصلية AAV الأخرى، استخدم خطوط الخلايا المختلفة. تأليه الجسيمات AAV2-GFP قبل تنقية وبعد تنقية على خلايا HT1080 وقياس التعبير GFP عن طريق قياس التدفق الخلوي. احسب الاستعادة (٪) بنسبة عدد جزيئات AAV المنقى وعدد جزيئات AAV قبل التنقية مضروبة في 100.

النتائج

هنا ، تظهر النتائج التمثيلية لتطوير العملية لإنتاج وتنقية ناقلات AAV باستخدام نظام خلايا الحشرات Sf9. وتشمل هذه الطريقة الثقافة المشتركة للخلايا SF9 مع خلايا TIPS المصابة بفيروس الكولو، وتغذية الخلايا مع متوسط النمو، والحصاد وتحلل الخلايا المنتجة للافراج عن جزيئات AAV، وتوضيح ليسات الخلية مع ع?...

Discussion

يمكن تطبيق المعلمات المستخدمة في هذا البروتوكول لتطوير عملية إنتاج وتنقية وتركيز ناقلات AAV على كل من التصنيع الصغير والكبير لنواقل AAV لتطبيقات العلاج الجيني. يمكن تنفيذ عملية المنبع والمصب بالكامل في نظام مغلق متوافق مع ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (cGMP). المزايا الرئيسية لنظام الفيروسا...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نود أن نشكر الدكتور روبرت م. كوتين (المعهد الوطني للقلب والدم والرئة، المعاهد القومية للصحة) على توفير بسخاء لنا البلازميدات AAV ودانييل ستيل وريبيكا ارنست (مستشفى سينسيناتي للأطفال) لمساعدتهم التقنية. ويدعم هذا العمل صندوق بدء التشغيل من مؤسسة سينسيناتي لأبحاث الأطفال إلى M.N.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 N Sodium HydroxideSigma-Aldrich1.09137For Akta Avant cleaning
2 L flasksThermoFisher Scientific431281Flask for suspension culture
50 ml Conical tubeThermoFisher Scientific14-959-49AFor collection of supernatants
24-well plateThermoFisher Scientific07-200-80Adherent cell culture plate
250 mL flasksThermoFisher Scientific238071Flask for suspension culture
Akta Avant 150 with Unicorn SoftwareCytiva28976337Chromatography system
AVB Sepharose High PerformanceCytiva28411210Chromatography medium
Baculovirus-AAV-2 GFPIn-housenon-catalogAAV transfer vector
Baculovirus-AAV-2 rep-capIn-housenon-catalogAAV packaging vector
NucleaseSigma-AldrichE1014Enzyme to degrade DNA and RNA
Blocking bufferSanta Cruz Biotechnologies516214Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells
Cell lysis bufferIn-houseNon-catalog item20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100
Cellbag, 2 L and 10 LCytiva28937662Bioreactor bag
Cleaning bufferIn-houseNon-catalog item100 mM citric acid (pH 2.1) 
CryovialThomas Scientific1222C24For cryopreservation
DMEMSigma-AldrichD6429Growth media for cell lines
Elution bufferIn-houseNon-catalog item50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)
EthanolSigma-AldrichE7073For disinfection and storage of the chromatography
Filtration unit Pall Corporation12941Membrane filter
HT1080 cell lineATCCCCL-121Fibroblast cell line
HyClone™ SFX-Insect culture mediaCytivaSH30278.02Serum-free insect cell growth medium
Peristaltic PumpPall CorporationNon-catalog itemTFF pump
MaxQ 8000 orbital shaker incubator ThermoFisher ScientificNon-catalog itemShaker for suspension culture
MicroscopeNikonNon-catalog itemCell monitoring and counting 
Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibodySanta Cruz Biotechnologies65498 PEMonitoring baculovirus infection in Sf9 cells
Oxygen tankPraxairNon-catalog item40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth
PBSThermoFisher Scientific20012027Wash buffer
Silver Staining kitThermoFisher ScientificLC6100Staining AAV capsid proteins
Sf9 cellsThermoFisher Scientific11496-015Insect cells
Steile waterIn-houseNon-catalog itemFor Akta Avant cleaning
Table top centrifugeThermoFisher Scientific75253839/433607For clarification of Baculovirus supernatant
Tangential Flow Filtration (TFF) cartridgePall CorporationOA100C12TFF cartridge to concentrate the AAV
Tris-HCl, pH 8.0ThermoFisher15568025Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV
WAVE Bioreactor System 20/50Cytiva28-9378-00Bioreactor

References

  1. Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
  2. Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
  3. Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
  4. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  5. Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 122 (1), 23-36 (2013).
  6. Grieger, J. C., Samulski, R. J. Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps. Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).
  7. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).
  8. Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 16071 (2016).
  9. Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).
  10. Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System. Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).
  11. Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures. Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).
  12. Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors. Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).
  13. Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).
  14. Chen, H. Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells. Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).
  15. Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. Chromatography-based purification of adeno-associated virus. Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).
  16. Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).
  17. Wu, Y., et al. Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes. Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).
  18. Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).
  19. Joshi, P. R. H., et al. Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 341-356 (2021).
  20. Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography. Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).
  21. Wright, J. F. Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies. Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).
  22. Tomono, T., et al. highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 180-190 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

179 AAV SF9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved