Prozessentwicklung zur Herstellung und Reinigung von Adeno-assoziiertem Virus (AAV)2 Vektor mit Baculovirus-Insekten-Zellkultursystem

Zusammenfassung

In diesem Protokoll wird der AAV2-Vektor durch Co-Kultivierung von Spodoptera frugiperda (Sf9) Insektenzellen mit Baculovirus (BV)-AAV2-grün fluoreszierendem Protein (GFP) oder therapeutischem Gen und BV-AAV2-rep-cap infizierten Sf9-Zellen in Suspensionskultur hergestellt. AAV-Partikel werden mittels Reinigungsmittel aus den Zellen freigesetzt, geklärt, durch Affinitätssäulenchromatographie gereinigt und durch tangentiale Strömungsfiltration konzentriert.

Zusammenfassung

Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind vielversprechende Vektoren für gentherapeutische Anwendungen. Hier wird der AAV2-Vektor durch Kokultur von Spodoptera frugiperda (Sf9)-Zellen mit Sf9-Zellen hergestellt, die mit Baculovirus (BV)-AAV2-GFP (oder therapeutischem Gen) und BV-AAV2-rep-cap in serumfreier Suspensionskultur infiziert sind. Zellen werden in einem Kolben in einem Orbitalschüttler oder Wave-Bioreaktor kultiviert. Um die AAV-Partikel freizusetzen, werden die Produzentenzellen in einen reinigungsmittelhaltigen Puffer lysiert, der anschließend durch Zentrifugation und Filtration mit niedriger Geschwindigkeit geklärt wird. AAV-Partikel werden aus dem Zelllysat mit hilfe der AVB Sepharose-Säulenchromatographie gereinigt, die AAV-Partikel bindet. Gebundene Partikel werden mit PBS gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen, und mit Natriumcitratpuffer bei pH 3,0 aus dem Harz eluiert. Das saure Eluat wird mit alkalischem Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) neutralisiert, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt und mit tangentialer Strömungsfiltration (TFF) weiter konzentriert. Das Protokoll beschreibt die kleinmaßstäbliche präklinische Vektorproduktion, die mit der Scale-up- bis zur groß angelegten AAV-Herstellung in klinischer Qualität für humane Gentherapieanwendungen kompatibel ist.

Einleitung

Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind unbehüllte humane Parvoviren, die eine einzelsträngige DNA von 4,6 kb enthalten. AAV-Vektoren haben mehrere Vorteile gegenüber anderen viralen Vektoren für Gentherapieanwendungen^1,2,3,4. AAVs sind von Natur aus replikationsinkompetent und benötigen daher einen Hilfsvirus und eine Host-Maschinerie für die Replikation. AAVs verursachen keine Krankheit und haben eine geringe Immunogenität im infizierten Wirt^3,5. AAV kann sowohl ruhende als auch sich aktiv teilende Zellen infizieren und kann als Episom bestehen bleiben, ohne sich in das Genom der Wirtszellen zu integrieren (AAV integriert sich selten in das Wirtsgenom)^1,3. Diese Eigenschaften haben AAV zu einem wünschenswerten Werkzeug für Gentherapieanwendungen gemacht.

Um einen AAV-Gentransfervektor zu erzeugen, wird die Transgenkassette einschließlich des therapeutischen Gens zwischen zwei internen terminalen Wiederholungen (ITRs) kloniert, die typischerweise vom AAV-Serotyp 2 abgeleitet sind. Die maximale Größe von 5' ITR bis 3' ITR, einschließlich der Transgensequenz, beträgt 4,6 kb⁶. Verschiedene Kapside können einen unterschiedlichen Zell- oder Gewebetropismus haben. Daher sollten Kapside basierend auf dem Gewebe oder Zelltyp ausgewählt werden, der mit dem^{AAV-Vektor 7}anvisiert werden soll.

Rekombinante AAV-Vektoren werden üblicherweise in Säugetierzelllinien wie humanen embryonalen Nierenzellen, HEK293 durch vorübergehende Transfektion des AAV-Gentransfervektors, AAV-Rep-Cap und Helfervirusplasmiden^2,3produziert. Es gibt jedoch mehrere Einschränkungen für die großflächige AAV-Produktion durch transiente Transfektion von adhärenten HEK293-Zellen. Zunächst wird eine große Anzahl von Zellstapeln oder Rollflaschen benötigt. Zweitens werden hochwertige Plasmid-DNA und Transfektionsreagenzien benötigt, was die Herstellungskosten erhöht. Schließlich wird bei der Verwendung von adhärenten HEK293-Zellen das Serum häufig für eine optimale Produktion benötigt, was die nachgelagerte Verarbeitung^{erschwert 1,2,3}. Eine alternative Methode der AAV-Herstellung beinhaltet die Verwendung der Insektenzelllinie, Spodoptera frugiperda (Sf9) -Zellen und eines Insektenvirus namens rekombinantes Autographa californica Multicapsid-Kernpolyedrosevirus (AcMNPV oder Baculovirus)^8,9,10. Sf9-Zellen werden in serumfreier Suspensionskultur gezüchtet, die leicht zu skalieren ist und mit der aktuellen cGMP-Produktion (Good Manufacturing Practice) in großem Maßstab kompatibel ist, die keine Plasmid- oder Transfektionsreagenzien erfordert. Darüber hinaus sind die Kosten für die AAV-Produktion unter Verwendung des Sf9-Baculovirus-Systems niedriger als die Kosten für die vorübergehende Transfektion von Plasmiden in HEK293-Zellen¹¹.

Das ursprüngliche rAAV-Produktionssystem unter Verwendung von Baculovirus-Sf9-Zellen verwendete drei Baculoviren: eine Baculovirus-haltige Gentransferkassette, das zweite Baculovirus-haltiges Rep-Gen und das dritte Baculovirus, das Serotyp-spezifisches Kapsid-Gen^12,13. Das Baculovirus-haltige Rep-Konstrukt war jedoch bei mehreren Passagengängen genetisch instabil, was eine Amplifikation des Baculovirus für die großflächige AAV-Produktion verhinderte. Um dieses Problem zu lösen, wurde ein neuartiges rAAV-Vektorsystem entwickelt, das zwei Baculoviren (TwoBac) enthielt: ein Baculovirus, das die AAV-Gentransferkassette enthielt, und ein anderes Baculovirus, das die AAV-Rep-Cap-Gene zusammen enthält, die genetisch stabiler sind als das ursprüngliche System und bequemer zu produzieren rAAV, da TwoBac anstelle von drei^{14verwendet wird. 15}. Das OneBac-System verwendet die AAV-Gentransferkassette und die Rep-Cap-Gene in einem einzigen Baculovirus, das aufgrund der Verwendung eines Baculovirus anstelle von TwoBac oder ThreeBac 2^,16 ,¹⁷bequemer^ist,um das rAAV herzustellen. In unserer Studie wurde das TwoBac-System zur Optimierung eingesetzt.

Das Baculovirus-System für die AAV-Produktion hat auch Einschränkungen: Baculovirus-Partikel sind instabil für die Langzeitlagerung in serumfreiem Medium¹¹, und wenn der Baculovirus-Titer niedrig ist, wird eine große Menge an Baculovirus-Überstand benötigt, der für das Wachstum von Sf9-Zellen während der AAV-Produktion toxisch werden kann (persönliche Beobachtung). Die Verwendung von TITERLOSEN INFIZIERTEN ZELLKONSERVIERUNGS- UND SCALE-UP-ZELLEN (TIPS) oder Baculovirus-infizierten Insektenzellen (BIIC) bietet eine gute Option für die AAV-Produktion, bei der Baculovirus-infizierte Sf9-Zellen vorbereitet, kryokonserviert und anschließend für die Infektion von frischen Sf9-Zellen verwendet werden. Ein weiterer Vorteil ist die erhöhte Stabilität des Baculovirus (BV) in Sf9-Zellen nach Kryokonservierung^10,11.

Zwei Arten von TIPS-Zellen werden erzeugt, um die AAV-Produktion zu ermöglichen: die erste durch Infektion von Sf9-Zellen mit dem BV-AAV2-GFP oder therapeutischen Gen und die zweite durch Infektion von Sf9-Zellen mit BV-AAV2-rep-cap. TIPS-Zellen werden in kleinen und gebrauchsfertigen Aliquots kryokonserviert. AAV-Vektoren werden in serumfreier Suspensionskultur in einem Kolben hergestellt, der in einem Orbitalschüttler oder Wave-Bioreaktor platziert wird, indem TIPS-Zellen, die Baculoviren und frische Sf9-Zellen produzieren, mitkulturiert werden. Sf9-Zellen sind mit Baculoviren infiziert, die den AAV2-GFP-Vektor und die Rep-Cap-Sequenzen tragen, um AAV zu erzeugen. Vier bis fünf Tage später, wenn die AAV-Ausbeute am höchsten ist, werden die Produzentenzellen mit Reinigungsmittel lysiert, um die AAV-Partikel freizusetzen. Das Zelllysat wird anschließend durch Zentrifugation und Filtration mit niedriger Geschwindigkeit geklärt. AAV-Partikel werden durch AVB-Sepharose-Säulenchromatographie aus dem Lysat gereinigt. Schließlich werden AAV-Vektoren mit TFF konzentriert. Das Protokoll beschreibt die Herstellung von AAV in kleinem Maßstab, nützlich für Forschung und präklinische Studien. Die Methoden sind jedoch skalierbar und kompatibel mit der Herstellung klinischer AAV-Vektoren für Gentherapieanwendungen.

Protokoll

In Abbildung 1 finden Sie eine Abbildung, die das Protokoll zusammenfasst.

1. Erzeugung von Baculovirus-infizierten TIPS-Zellen

1. Tauen Sie eine Durchstechflasche mit Sf9-Zellen auf und säen Sie sie sofort in 50 ml Insektenzellkulturmedium. Es werden Sf9-Zellen in einem Orbital-Shaker-Inkubator bei 125 U/min und 28 °C in Rundkolben mit einer lose angebrachten Kappe zum Luftaustausch^{8,9 gezüchtet.} Vermehren Sie die Zellen in einem 1-Liter-Kolben mit 200 ml Medium, um genügend Zellen für die Produktion von TIPS-Zellen zu erhalten.
2. 50 ml Sf9-Zellen bei 2 x 10 6 Zellen/ml in zwei^Kolben geben: Infizieren Sie einen Kolben Sf9-Zellen mit 0,5 ml Baculovirus (BV)-AAV2-GFP (oder therapeutisches Gen) und den anderen Zellkolben mit 0,5 ml BV-AAV2-rep-cap.
   HINWEIS: AAV-Vektorplasmide wurden großzügig von Dr. Robert M. Kotin (NIH) zur Verfügung gestellt. Die Baculovirus-Produktion aus Bacmid-DNA (Bac-to-Bac-System) wurde bisher beschrieben^8,9. Die Baculovirus-Stabilität während der Passage ist ein kritisches Problem für die Scale-up-Produktion von rAAV. Es ist besser, eine niedrigere Passagenzahl des Baculovirus (bis zur Passage Nummer 4) zu verwenden. Bestimmen Sie das optimale Volumen des Baculovirus-Überstandes empirisch, indem Sie die Baculovirus-Infektionseffizienz mithilfe der Durchflusszytometrie (Abbildung 2) während der TIPS-Zellproduktion überprüfen.
3. Überwachen Sie die Baculovirus-Infektion 3-4 Tage nach der Infektion, indem Sie Baculovirus gp64 in infizierten Sf9-Zellen wie folgt färben.
   1. Färben Sie 2 x 10⁵ Sf9-Zellen (sowohl nicht infizierte als auch Baculovirus-infizierte Zellen) mit 0,5 μg Maus-Anti-Baculovirus-gp64-Antikörper (1:200), der einen fluoreszierenden Farbstoff in 100 μL Blockierpuffer enthält, für 30 min bei Umgebungstemperatur.
   2. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS, um den Antikörper zu entfernen, und resuspendieren Sie die gefärbten Zellen in 300 μL PBS, die 0,5% Rinderserumalbumin enthalten.
   3. Analysieren Sie die Baculovirus gp64-Expression auf Zellen mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 2).
      HINWEIS: Bestimmen Sie die Gating-Strategie für die Erfassung und Analyse der Durchflusszytometrie empirisch. Insgesamt werden 10.000 einzelne lebende Zellen gewonnen. Die Baculovirus gp64-Expression auf Sf9-Zelloberflächen weist auf eine Baculovirus-Infektion hin. Nach 3-4 Tagen infizieren sich die meisten Sf9-Zellen mit dem Baculovirus, wie die Baculovirus gp64-Expression zeigt (Abbildung 2).
4. Wenn die Zellen 80%-90% lebensfähig sind mit einer Erhöhung des Durchmessers(Abbildung 3),ernten sie die Zellen und kryokonservieren 1 x 10⁷ Zellen in 1 ml Insektenkulturmedium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 10% Dimethylsulfoxid in einem langsam gefrierenden Behälter bei -80 °C. Am nächsten Tag das Röhrchen mit TIPS-Zellen zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstoff-Gefrierschrank geben.
   HINWEIS: Führen Sie die Zellkultur in einer Biosicherheitswerkbank nach der standardmäßigen aseptischen Labortechnik der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durch.

2. Herstellung des AAV-Vektors

1. Tag 1: Co-Kultur von Sf9-Zellen mit den Baculovirus-infizierten TIPS-Zellen
   1. Kultivieren und züchten Sie naive Sf9-Zellen bei 1 x^{10 6} Zellen/ml bei 28 °C in mehreren 2-Liter-Kolben mit 400 ml Insektenzellkulturmedium in einem Shaker-Inkubator, der für die AAV-Produktion benötigt wird. Nach 3-4 Tagen wird die Zelldichte auf 5 x 10^{6 -6}x 10⁶ Zellen/ml erhöht.
      HINWEIS: CO₂ und Luftfeuchtigkeit sind keine wichtigen Faktoren für das Wachstum von Sf9-Zellen.
   2. Säen Sie die Sf9-Zellen entweder in Schüttelkolben oder in einem Bioreaktor wie folgt aus.
      1. AAV-Produktion in Kolben in einem Orbital-Shaker-Inkubator: Verwenden Sie eine Pipette oder eine Peristaltikpumpe, um 400 ml Sf9-Kultur bei 2 x 10⁶ Zellen / ml aseptisch in einen 2-Liter-Kolben zu säen. Richten Sie den Orbitalschüttler bei 125 U/min und 28 °C ein.
         HINWEIS Verwenden Sie je nach Umfang der AAV-Produktion eine Peristaltikpumpe oder eine Standardpipette.
      2. AAV-Produktion in einem Bioreaktor: Verwenden Sie eine Peristaltikpumpe, um 1 L Sf9-Kultur bei 2 x 10⁶ Zellen / ml aseptisch in einen 10 L Bioreaktorbeutel zu säen. Laden Sie den Beutel zur Kultivierung bei 28 °C auf die Bioreaktoreinheit. Fügen Sie dem Bioreaktorbeutel bei 0,1 psi 40% Sauerstoff hinzu. Stellen Sie die Bioreaktoreinheit in einem Winkel von 20° auf und schütteln Sie den Beutel mit 25 U / min.
   3. Tauen Sie eine Durchstechflasche mit jedem BV-AAV2-GFP (oder therapeutischen Gen) und BV-AAV2-rep-cap TIPS-Zellen auf. Verdünnen Sie die Zellen mit 20 ml Insektenkulturmedium und führen Sie eine Lebensfähigkeitszählung der Zellen mit Trypanblau durch. Impfen Sie beide TIPS-Zellen in einem Verhältnis von 1:10.000 relativ zu den naiven Sf9-Zellen, die in einem Schüttlerkolben oder Bioreaktor kultiviert wurden.
      HINWEIS: Das Überleben der TIPS-Zellen ist aufgrund der Kryokonservierung reduziert, und die Erholungsrate beträgt ungefähr 50%, wenn die Lebensfähigkeit der Zellen mit der Trypanblaufärbung bestimmt wird. Führen Sie ein Pilotexperiment durch, um das Verhältnis von TIPS-Zellen und naiven Sf9-Zellen vor der groß angelegten rAAV-Produktion empirisch zu bestimmen.
2. Tag 2: Kulturmonitoring
   1. Ernte 1 ml Sf9-Kultur aseptisch. Färben Sie mit dem blauen Farbstoff Trypan, um die Zellzahl, Lebensfähigkeit und Morphologie zu analysieren.
3. Tag 3: Kulturüberwachung und Fütterung
   1. Ernten Sie 1 ml Sf9-Kultur und analysieren Sie die Zellzahl, Lebensfähigkeit und Morphologie. Überprüfen Sie den Status der Baculovirus-Infektion nach dem Färben der Sf9-Zellen wie in Schritt 1.3 beschrieben.
      HINWEIS: Die Zunahme des Zelldurchmessers und die zytopathische Wirkung sind Hinweise auf eine Baculovirus-Infektion. Die Zunahme des Durchmessers geht einer Abnahme der Zelllebensfähigkeit voraus, und diese Parameter werden verwendet, um die Zellerntezeit während der AAV-Produktion zu bestimmen. Ermitteln Sie den optimalen Zeitpunkt empirisch.
   2. Füttern Sie die Sf9-Kultur mit frischem Insektenkulturmedium im Verhältnis 1:5 aseptisch.
4. Tag 4: Kulturmonitoring
   1. Ernten Sie 1 ml Sf9-Kultur und analysieren Sie die Zellzahl, Lebensfähigkeit und Morphologie. Trennen Sie die Sauerstoffzufuhr vom Bioreaktorbeutel.
5. Tag 5: Kulturüberwachung und Ernte
   1. Ernten Sie 1 ml Sf9-Kultur und analysieren Sie die Zellzahl, Lebensfähigkeit und Morphologie. Ernten Sie das Kulturmedium und die Zellen, wenn die Lebensfähigkeit der Sf9-Zellen auf etwa 50% gesunken ist (Abbildung 4).
   2. Die Zellsuspension bei 2100 x g für 15 min bei 4 °C drehen. Sammeln Sie den Überstand und das Zellpellet und lagern Sie sie bei -80 °C.

3. Lyse von Zellen und Freisetzung von AAV

1. Tauen Sie das AAV-Erzeugerzellpellet auf. 100 ml Zelllysepuffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM Natriumchlorid, 0,5 % Triton-X-100) in das Zellpellet geben, kräftig mischen und 30 min bei Umgebungstemperatur inkubieren, um die AAV-Partikel freizusetzen.
2. Zentrifugiere bei 2100 × g für 30 min bei 4 °C und überführe das Zelllysat in einen neuen Behälter. Mischen Sie das Zelllysat und den Zellkulturüberstand nach dem Auftauen.
3. Fügen Sie dem Zelllysat 20 U/ ml Nuklease und 10 mM_MgCl2 hinzu, um die DNA und RNA zu verdauen. 2-4 h bei 37 °C inkubieren.
4. Filtern Sie das Lysat durch ein 0,8 μm und 0,2 μmpolyethersulfon Dualfiltrationssystem mit einer Pumpe.
5. Lagern Sie das geklärte Zelllysat über Nacht bei 4 °C oder reinigen Sie das AAV sofort.

4. Reinigung des AAV-Vektors mit Affinitätssäulenchromatographiesystem

1. Bereiten Sie das Chromatographiegerät vor, indem Sie die Proben- und Pufferleitungen nacheinander mit sterilem Wasser, 1 N Natriumhydroxid, Wasser und phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) bei einer Durchflussrate von 50 ml/min waschen.
2. Montieren Sie die AVB Sepharose-Säule (10,0 ml) in das Chromatographiesystem und führen Sie 100 ml PBS mit einer Durchflussrate von 5 ml/min aus.
   HINWEIS: Verwenden Sie je nach Umfang der AAV-Produktion ein geringeres oder höheres Volumen der AVB Sepharose-Säule und richten Sie die Durchflussrate wie vom Säulen- oder Harzhersteller vorgeschlagen ein (siehe Tabelle der Materialien).
3. Um die Fraktionen der Säulendurchlauflösung, des Waschpuffers und des Elutionspuffers, die AAV-Partikel enthalten, zu sammeln, führen Sie Röhrchen in die Fraktionskollektorschlitze des Chromatographiegeräts ein.
4. Die Säule wird mit PBS bei einer Durchflussrate von 5,0 ml/min ausgeglichen.
5. Laden Sie das gefilterte Zelllysat mit AAV-Partikeln mit der mit einer Probenpumpe ausgestatteten Chromatographiemaschine auf die Säule. Führen Sie die Probe mit einer Durchflussrate von 3,0 ml pro Minute aus.
6. Führen Sie PBS mit einer Durchflussrate von 3,0 ml/min durch die AVB Sepharose-Säule, bis die UV-Absorptionskurve (280 nm) zur Grundlinie zurückkehrt und stabil wird.
7. Eluieren Sie die AAV-Partikel aus der Säule mit 50 mM Natriumcitrat (pH 3,0) Puffer bei einer Durchflussrate von 3,0 ml/min (Abbildung 5).
   HINWEIS: Während die AAV-Partikel vom Harz dissoziieren und den UV-Detektor passieren, ist auf dem Chromatogramm ein Elutionspeak des Proteins zu sehen.
8. Verdünnen Sie den AAV-Überstand sofort mit einem Fünftelvolumen von 500 mM Tris-HCl (pH 8,0), um den pH-Wert des AAV-haltigen Überstands auf etwa pH 5,5 zu erhöhen, um einen pH-vermittelten Abbau mit saurem Elutionspuffer zu verhindern. Verdünnen Sie den AAV-Überstand 10-fach mit PBS, um den pH-Wert vollständig zu neutralisieren.
   HINWEIS: Der pH-Wert beträgt nach Neutralisation der rAAV-Lösung etwa 5,5. Nach der Neutralisation von AAV verdünnen Sie die rAAV-Lösung 10-fach mit PBS (pH 7,4), so dass sich AAV in einem physiologischen Puffer befindet.
9. Lagern Sie 1 ml jeder Säule, den Durchlaufproben, den Waschpuffer und 100 μL des eluierten AAV-Überstands, um das Vorhandensein von AAV durch Infektion der Zielzellen zu bewerten.
10. Reinigen Sie die AVB Sepharose-Säule mit 100 mL 100 mM Zitronensäure (pH 2,1) und 100 mL PBS (pH7,4) bei einem Durchfluss von 5,0 mL/min. Spülen Sie die Säule mit 20% Ethanol bei einem Durchfluss von 5,0 ml/min ab und lagern Sie sie bei 4 °C.
11. Reinigen Sie die Rohrleitungen des Chromatographiegeräts mit der Offline-Position der Säule, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben. Zum Schluss spülen Sie das Chromatographiesystem mit 200 ml 20% Ethanol bei einer Durchflussrate von 50,0 ml/min und lagern Sie es in 20% Ethanol.

5. Konzentration und Diafiltration des AAV-Vektors mittels Tangentialflussfiltration (TFF)

1. Richten Sie das TFF-System ein, das mit einer Polysulfon-Membrankartusche (100 kDa Molecular Weight Cut Off) ausgestattet ist, um den AAV zu konzentrieren.
2. TFF-Modul mit 200 ml PBS für 10 min ausgleichen.
3. Laden Sie die AAV-Probe, indem Sie den Durchfluss der Pumpe steuern, bis die Probe auf das gewünschte Volumen reduziert ist, während ein Transmembrandruck bei 2-3 psi aufrechterhalten wird.
4. Diafiltrieren Sie das Retentat mit 100 ml PBS, wie in dieser Studie verwendet, oder definieren Sie empirisch einen alternativen Puffer, der die Langzeitstabilität von AAV unterstützt.
5. Nachdem Sie die AAV-Probe auf das gewünschte Volumen konzentriert haben, sammeln Sie die AAV-Probe, filtern Sie sie durch einen 0,2 μm Polyethersulfonfilter, Aliquot, und lagern Sie sie dann bei -80 ° C.

6. Infektion von AAV-Proben in die Zielzellen, um das Vorhandensein von AAV in den Reinigungsschritten zu bewerten

1. Impfen Sie 7 x 10⁴ HT1080 Zellen / Well in einer 24-Well-Platte in 500 μL Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 1% L-Glutamin, 1% Natriumpyruvat und 10% fetalem Rinderserum (FBS) am Tag vor der Infektion. Kultivieren Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C und 5%_CO2.
2. Zählen Sie die Zellen vor der Infektion. Fügen Sie die verdünnte ungereinigte AAV-Massenprobe vor dem Säulenlauf, die Säulendurchlaufproben, den Waschpuffer und die eluierte gereinigte AAV-Probe hinzu.
   HINWEIS: Zählen Sie die blau gefärbten Trypan-Zellen mit einem Hämozytometer. Bestimmen Sie den Verdünnungsfaktor und das Volumen (μL) der AAV-Proben empirisch. Je höher die AAV-Titer, desto mehr Verdünnung ist erforderlich. Stellen Sie sicher, dass die Baculoviruspartikel der ungereinigten Großprobe vor dem Säulenlauf, die Säulendurchlaufproben und der Waschpuffer bei 50 °C für 50 min hitzeinaktiviert werden, bevor die Zielzellen infiziert werden, um infektiöse Titer von AAV zu bestimmen.
3. Analysieren Sie zwei Tage nach der Infektion die Proteinexpression (z. B. GFP oder therapeutisches Gen) in den Zellen mit einem Durchflusszytometer.
4. Berechnen Sie infektiöse Titer von AAV unter Verwendung der Anzahl der Zellen zum Zeitpunkt der Infektion, des Verdünnungsfaktors und des Prozentsatzes der GFP+-Zellen mit der Formel: (Gesamtzahl der Zellen x Prozentsätze GFP+-Zellen x Verdünnungsfaktor) / Volumen der AAV in Millilitern.
   HINWEIS: Zum Beispiel ist die Anzahl der Zellen 1 x 10⁵, der Prozentsatz der GFP + -Zellen beträgt 3,4%, der Verdünnungsfaktor beträgt 100 und das Volumen des hinzugefügten AAV beträgt 2 μL. Der Titer von AAV beträgt 1,7 x 10⁸ infektiöse Einheit (IE) / ml. Die Gesamtmenge der gereinigten AAV-Partikel in 25 ml der eluierten Fraktion beträgt 4,3 x 10⁹ infektiöse Einheiten (IE)/ml (Abbildung 6). Die Gesamtzahl der anfänglichen ungereinigten AAV-Partikel beträgt 1,09 x^{10 10} IE / ml und die gereinigten AAV-Partikel 4,3 x 10⁹ IE / ml. Daher beträgt der Prozentsatz der Wiederherstellung 39,4%. Der Prozentsatz der GFP+-Zellen sollte zwischen 1% und 30% liegen, was einem linearen Bereich entspricht, wenn er zur Berechnung des infektiösen Titers von AAV verwendet wird. Wenn konzentriertere AAV-Vektorpartikel in die Zielzellen infiziert werden; Es besteht die Möglichkeit, dass mehrere Kopien der AAV-Partikel eine einzelne Zelle infizieren, die als einzelne Kopie des Vektors angezeigt wird. Verdünnen Sie daher den AAV-Vektorüberstand, um eine Vektorinfektion von 1% -30% in den Zielzellen zu erhalten. Wenn der AAV-Vektor kein Reportergen hat, färben Sie das Transgen oder das therapeutische Gen, das vom AAV-Vektor exprimiert wird, mit einem Antikörper, der einen Fluoreszenzfarbstoff enthält, der mit einem Durchflusszytometer nachgewiesen und quantifiziert werden kann. Nicht alle AAV-Serotypen können HT1080-Zellen effizient infizieren. Um den Infektiositätstest für andere AAV-Serotypen durchzuführen, verwenden Sie daher verschiedene Zelllinien. Titeren Sie die AAV2-GFP-Partikel vor der Reinigung und nach der Reinigung auf HT1080-Zellen und messen Sie die GFP-Expression durch Durchflusszytometrie. Berechnen Sie die Rückgewinnung (%) durch das Verhältnis der Anzahl der gereinigten AAV-Partikel und der Anzahl der AAV-Partikel vor der Reinigung multipliziert mit 100.

Ergebnisse

Hier werden die repräsentativen Ergebnisse der Prozessentwicklung zur Herstellung und Aufreinigung von AAV-Vektoren unter Verwendung des Sf9-Insektenzellsystems gezeigt. Die Methode umfasst die Kokultur von Sf9-Zellen mit Baculovirus-infizierten TIPS-Zellen, die Fütterung der Zellen mit Wachstumsmedium, die Ernte und Lyse der Produzentenzellen zur Freisetzung der AAV-Partikel, die Klärung des Zelllysats mit Nukleasebehandlung, Zentrifugation und Filtration, die Reinigung von AAV mittels AVB-Sepharose-Affinitätschroma...

Diskussion

Die Parameter, die in diesem Protokoll für die Prozessentwicklung der Produktion, Reinigung und Konzentration von AAV-Vektoren verwendet werden, können sowohl auf die Herstellung von AAV-Vektoren im kleinen als auch auf den großen Maßstab für Gentherapieanwendungen angewendet werden. Der gesamte vor- und nachgelagerte Prozess kann in einem geschlossenen System durchgeführt werden, das mit den aktuellen Good Manufacturing Practices (cGMP) kompatibel ist. Die Hauptvorteile des Sf9-Baculovirus-Systems sind die Skalier...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 N Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	1.09137	For Akta Avant cleaning
2 L flasks	ThermoFisher Scientific	431281	Flask for suspension culture
50 ml Conical tube	ThermoFisher Scientific	14-959-49A	For collection of supernatants
24-well plate	ThermoFisher Scientific	07-200-80	Adherent cell culture plate
250 mL flasks	ThermoFisher Scientific	238071	Flask for suspension culture
Akta Avant 150 with Unicorn Software	Cytiva	28976337	Chromatography system
AVB Sepharose High Performance	Cytiva	28411210	Chromatography medium
Baculovirus-AAV-2 GFP	In-house	non-catalog	AAV transfer vector
Baculovirus-AAV-2 rep-cap	In-house	non-catalog	AAV packaging vector
Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	Enzyme to degrade DNA and RNA
Blocking buffer	Santa Cruz Biotechnologies	516214	Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells
Cell lysis buffer	In-house	Non-catalog item	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100
Cellbag, 2 L and 10 L	Cytiva	28937662	Bioreactor bag
Cleaning buffer	In-house	Non-catalog item	100 mM citric acid (pH 2.1)
Cryovial	Thomas Scientific	1222C24	For cryopreservation
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Growth media for cell lines
Elution buffer	In-house	Non-catalog item	50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7073	For disinfection and storage of the chromatography
Filtration unit	Pall Corporation	12941	Membrane filter
HT1080 cell line	ATCC	CCL-121	Fibroblast cell line
HyClone™ SFX-Insect culture media	Cytiva	SH30278.02	Serum-free insect cell growth medium
Peristaltic Pump	Pall Corporation	Non-catalog item	TFF pump
MaxQ 8000 orbital shaker incubator	ThermoFisher Scientific	Non-catalog item	Shaker for suspension culture
Microscope	Nikon	Non-catalog item	Cell monitoring and counting
Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody	Santa Cruz Biotechnologies	65498 PE	Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells
Oxygen tank	Praxair	Non-catalog item	40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth
PBS	ThermoFisher Scientific	20012027	Wash buffer
Silver Staining kit	ThermoFisher Scientific	LC6100	Staining AAV capsid proteins
Sf9 cells	ThermoFisher Scientific	11496-015	Insect cells
Steile water	In-house	Non-catalog item	For Akta Avant cleaning
Table top centrifuge	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	For clarification of Baculovirus supernatant
Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge	Pall Corporation	OA100C12	TFF cartridge to concentrate the AAV
Tris-HCl, pH 8.0	ThermoFisher	15568025	Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV
WAVE Bioreactor System 20/50	Cytiva	28-9378-00	Bioreactor