使用杆状病毒-昆虫细胞培养系统生产和纯化腺相关病毒（AAV）2载体的工艺开发

摘要

在该协议中，通过将 Spodoptera frugiperda（Sf9） 昆虫细胞与杆状病毒（BV）-AAV2-绿色荧光蛋白（GFP）或治疗基因和BV-AAV2-rep-cap感染的Sf9细胞在悬浮培养物中共同培养来产生AAV2载体。使用洗涤剂从细胞中释放AAV颗粒，澄清，通过亲和柱色谱纯化，并通过切向流过滤浓缩。

摘要

腺相关病毒（AAV）是基因治疗应用的有前途的载体。在这里，AAV2载体是通过在无血清悬浮培养物中共培养 Spodoptera frugiperda（Sf9） 细胞与感染杆状病毒（BV）-AAV2-GFP（或治疗基因）和BV-AAV2-rep-cap的Sf9细胞共培养产生的。细胞在轨道振荡器或Wave生物反应器的烧瓶中培养。为了释放AAV颗粒，将生产者细胞裂解在含有洗涤剂的缓冲液中，随后通过低速离心和过滤进行澄清。使用AVB Sepharose柱色谱法从细胞裂解物中纯化AAV颗粒，其结合AAV颗粒。用PBS洗涤结合的颗粒以除去污染物，并使用柠檬酸钠缓冲液在pH 3.0下从树脂中洗脱。酸性洗脱液用碱性Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中和，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释，并用切向流动过滤（TFF）进一步浓缩。该协议描述了小规模的临床前载体生产与用于人类基因治疗应用的大规模临床级AAV制造相容。

引言

腺相关病毒（AAV）是非包膜的人类细小病毒，含有4.6 kb的单链DNA。对于基因治疗应用，AAV载体比其他病毒载体具有几个优点^{1，2，3，4。}AAV自然是复制无能的，因此，需要帮助病毒和主机进行复制。AAV不会引起任何疾病，并且在受感染的宿主^3，5中具有低免疫原性。AAV可以感染静止和主动分裂的细胞，并且可以持续作为表观体而不整合到宿主细胞的基因组中（AAV很少整合到宿主基因组中^）1，3。这些特性使AAV成为基因治疗应用的理想工具。

为了生成AAV基因转移载体，在两个内部末端重复序列（ITR）之间克隆转基因盒，包括治疗基因，这两个重复序列通常来自AAV血清型2。从5'ITR到3'ITR的最大尺寸，包括转基因序列，为4.6 kb^6。不同的衣壳可能具有不同的细胞或组织向性。因此，应根据拟用AAV载体靶向的组织或细胞类型选择衣壳^7。

重组AAV载体通常在哺乳动物细胞系中产生，例如人胚胎肾细胞，HEK293通过AAV基因转移载体，AAV rep-cap和辅助病毒质粒^2，3的瞬时转染。然而，通过贴壁HEK293细胞的瞬时转染进行大规模AAV生产存在一些局限性。首先，需要大量的电池堆或滚瓶。其次，需要高质量的质粒DNA和转染试剂，这增加了制造成本。最后，当使用贴壁HEK293细胞时，血清经常需要最佳生产，使下游处理^1，2，3复杂化。AAV制造的替代方法涉及使用昆虫细胞系，Spodoptera frugiperda（Sf9）细胞，以及称为重组Autographa californica多衣壳核多肝病病毒（AcMNPV或杆状病毒）的昆虫病毒^{8，9，10。}Sf9细胞在无血清悬浮培养物中生长，易于放大，并且与当前大规模的良好生产规范（cGMP）生产兼容，不需要质粒或转染试剂。此外，使用Sf9-杆状病毒系统的AAV生产成本低于使用质粒瞬时转染到HEK293细胞^{的成本11。}

原来的rAAV生产系统使用杆状病毒-Sf9细胞，使用三种杆状病毒:一种是含有基因转移盒的杆状病毒，第二种是含有重复基因的杆状病毒，第三种杆状病毒含有血清型特异性衣壳基因^12、13。然而，含有重复构建体的杆状病毒在多轮传代时遗传不稳定，这阻止了杆状病毒在大规模AAV生产中的扩增。为了解决这个问题，开发了一种新型的rAAV载体系统，其中包含两种杆状病毒（TwoBac）:一种含有AAV基因转移盒的杆状病毒和另一种含有AAV重集基因的杆状病毒，它们在遗传上比原始系统更稳定，并且由于使用TwoBac而不是三个^14，因此更方便产生rAAV。 ¹⁵.OneBac系统使用单个杆状病毒中的AAV基因转移盒和rep-cap基因，由于使用一种杆状病毒而不是使用TwoBac或ThreeBac^{2，16，17，}因此更方便地产生rAAV。在我们的研究中，TwoBac系统用于优化。

用于AAV生产的杆状病毒系统也有局限性:杆状病毒颗粒在无血清培养基¹¹中长期储存不稳定，如果杆状病毒滴度低，则需要大量的杆状病毒上清液，这可能在AAV生产过程中对Sf9细胞的生长产生毒性（个人观察）。使用无滴度感染细胞保存和放大（TIPS）细胞或杆状病毒感染的昆虫细胞（BIIC）为AAV生产提供了一个很好的选择，其中制备杆状病毒感染的Sf9细胞，冷冻保存，随后用于感染新鲜的Sf9细胞。另一个优点是冷冻保存后Sf9细胞中杆状病毒（BV）的稳定性增加^10，11。

产生两种类型的TIPS细胞以实现AAV的产生:第一种是通过感染具有BV-AAV2-GFP或治疗基因的Sf9细胞，第二种是通过具有BV-AAV2-rep-cap的Sf9细胞感染的。TIPS细胞被冷冻保存在小型和即用型等分试样中。AAV载体通过共培养产生杆状病毒和新鲜Sf9细胞的TIPS细胞，在置于轨道振荡器或Wave生物反应器的烧瓶中以无血清悬浮培养物产生。Sf9细胞被携带AAV2-GFP载体和重复帽序列以产生AAV的杆状病毒感染。四到五天后，当AAV产量最高时，用洗涤剂裂解生产细胞以释放AAV颗粒。随后通过低速离心和过滤澄清细胞裂解物。AAV颗粒通过AVB琼脂糖柱色谱法从裂解物中纯化。最后，使用TFF浓缩AAV载体。该协议描述了AAV的小规模生产，可用于研究和临床前研究。然而，这些方法是可扩展的，并且与制造用于基因治疗应用的临床级AAV载体兼容。

研究方案

有关概述该协议的插图，请参见图 1。

1. 杆状病毒感染的TIPS细胞的产生

1. 解冻一小瓶Sf9细胞，并立即将其接种在50 mL昆虫细胞培养基中。在轨道振荡器培养箱中以125rpm和28°C在圆底烧瓶中培养Sf9细胞，带有松散的盖子以交换空气^8，9。在含有200mL培养基的1L烧瓶中繁殖细胞，以获得足够的细胞用于TIPS细胞的产生。
2. 在两个烧瓶中以2×10⁶ 个细胞/ mL加入50 mL Sf9细胞:用0.5mL杆状病毒（BV）-AAV2-GFP（或治疗基因）感染一个Sf9细胞瓶，另一个用0.5mL BV-AAV2-rep-cap感染另一个细胞瓶。
   注:AAV载体质粒由Robert M. Kotin博士（NIH）慷慨提供。从Bacmid DNA（Bac-to-Bac系统）中产生杆状病毒已经在^8，9中进行了描述。杆状病毒在传代过程中的稳定性是rAAV放大生产的关键问题。最好使用杆状病毒的较低通道数（最多为4号通道）。在TIPS细胞生产过程中，通过使用流式细胞术检查杆状病毒感染效率，根据经验确定杆状病毒上清液的最佳体积（图2）。
3. 通过在受感染的Sf9细胞中染色杆状病毒gp64，在感染后3-4天监测杆状病毒感染，如下所示。
   1. 用0.5μg小鼠抗杆状病毒gp64抗体（1:200）染色2×10⁵ 个Sf9细胞（未感染和杆状病毒感染的细胞），该抗体含有荧光染料，在环境温度下在100μL封闭缓冲液中30分钟。
   2. 用1mL PBS洗涤细胞以除去抗体，并将染色的细胞重悬于含有0.5%牛血清白蛋白的300μLPBS中。
   3. 使用流式细胞术分析杆状病毒gp64在细胞上的表达（图2）。
      注:根据经验确定流式细胞术采集和分析的门控策略。总共获得10，000个单活细胞。杆状病毒gp64在Sf9细胞表面的表达提示杆状病毒感染。3-4天后，大多数Sf9细胞感染杆状病毒，如杆状病毒gp64表达所证明的那样（图2）。
4. 当细胞随着直径的增加而存活80%-90%时（图3），收获细胞并在1mL昆虫培养基中冷冻保存1×10⁷ 个细胞，其中补充有10%胎牛血清和10%二甲基亚砜在-80°C的慢速冷冻容器中。 第二天，将含有TIPS细胞的管转移到液氮冰箱中长期储存。
   注意:按照生物安全级别2（BSL-2）的标准无菌实验室技术在生物安全柜中进行细胞培养。

2. AAV载体的生产

1. 第1天:将Sf9细胞与杆状病毒感染的TIPS细胞共同培养
   1. 在28°C下以1×10⁶个细胞/mL在含有400mL昆虫细胞培养基的几个2L烧瓶中培养并培养幼稚的Sf9细胞，该培养箱是AAV生产所需的。3-4天后，细胞密度增加到5×10^6-6×106个细胞/mL。
      注意:CO₂ 和湿度不是Sf9细胞生长的重要因素。
   2. 将Sf9细胞接种在摇瓶或生物反应器中，如下所示。
      1. 在轨道振荡器培养箱中的烧瓶中产生AAV:使用移液管或蠕动泵以2×10⁶ 个细胞/ mL无菌方式将400 mL Sf9培养物接种到2 L烧瓶中。将轨道式振动器设置为125 rpm和28°C。
         注意:使用蠕动泵或标准移液器，具体取决于AAV生产的规模。
      2. 生物反应器中的AAV生产:使用蠕动泵以2×10⁶ 个细胞/ mL将1 L Sf9培养物无菌接种到10 L生物反应器袋中。将袋子装入生物反应器装置，在28°C下培养。 在0.1 psi下向生物反应器袋中加入40%的氧气。以20°角设置生物反应器单元，并以25 rpm的速度摇动袋子。
   3. 解冻每个BV-AAV2-GFP（或治疗基因）和BV-AAV2-rep-cap TIPS细胞的一小瓶。用20mL昆虫培养基稀释细胞，并使用台盼蓝对细胞进行活力计数。相对于在摇摇瓶或生物反应器中培养的朴素Sf9细胞，以1:10，000的比例接种两个TIPS细胞。
      注意:由于低温保存，TIPS细胞的存活率降低，当使用台盼蓝染色确定细胞活力时，回收率约为50%。在大规模rAAV生产之前，进行试点实验以经验确定TIPS细胞和朴素Sf9细胞的比例。
2. 第2天:培养监测
   1. 收获1 mL Sf9无菌培养物。用台盼蓝染料染色，以分析细胞计数，活力和形态。
3. 第3天:培养监测和喂养
   1. 收获1 mL Sf9培养物并分析细胞计数，活力和形态。如步骤1.3所述，在染色Sf9细胞后检查杆状病毒感染的状态。
      注意:细胞直径增加和细胞病变作用是杆状病毒感染的指示。直径的增加先于细胞活力的降低，这些参数用于确定AAV生产过程中的细胞收获时间。根据经验确定最佳时间点。
   2. 用新鲜的昆虫培养基以1:5的比例无菌喂养Sf9培养物。
4. 第4天:文化监测
   1. 收获1 mL Sf9培养物并分析细胞计数，活力和形态。断开生物反应器袋的氧气供应。
5. 第5天:养殖监测和收获
   1. 收获1 mL Sf9培养物并分析细胞计数，活力和形态。当Sf9细胞活力降至50%左右时，收获培养基和细胞（图4）。
   2. 在4°C下以2100×g旋转细胞悬浮液15分钟。 收集上清液和细胞沉淀，并将它们储存在-80°C。

3. 细胞裂解和AAV释放

1. 解冻AAV生产者细胞沉淀。向细胞沉淀中加入100mL细胞裂解缓冲液（20mM Tris-HCl pH 8.0，150mM氯化钠，0.5%Triton-X-100），剧烈混合，并在环境温度下孵育30分钟以释放AAV颗粒。
2. 在4°C下以2100×g离心30分钟，并将细胞裂解物转移到新容器中。 解冻后混合细胞裂解物和细胞培养物上清液。
3. 向细胞裂解物中加入20 U / mL核酸酶和10 mM MgCl₂ 以消化DNA和RNA。在37°C下孵育2-4小时。
4. 使用泵通过0.8μm和0.2μm聚醚砜双过滤系统过滤裂解物。
5. 将澄清的细胞裂解物储存在4°C过夜或立即纯化AAV。

4. 使用亲和柱色谱系统纯化AAV载体

1. 通过以50 mL / min的流速依次用无菌水，1 N氢氧化钠，水和磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）洗涤样品和缓冲管路来制备色谱仪。
2. 将 AVB 琼脂糖色谱柱 （10.0 mL） 安装到色谱系统中，并以 5 mL/min 的流速运行 100 mL PBS。
   注意:根据AAV生产的规模，使用较低或较高体积的AVB Sepharose柱，并按照色谱柱或树脂制造商的建议设置流速（见 材料表）。
3. 为了收集柱直通溶液，洗涤缓冲液和含有AAV颗粒的洗脱缓冲液的馏分，将管插入色谱仪的馏分收集器槽中。
4. 用PBS以5.0 mL/min的流速平衡色谱柱。
5. 使用配备样品泵的色谱机将含有AAV颗粒的过滤细胞裂解物加载到色谱柱上。以每分钟3.0 mL的流速运行样品。
6. 以 3.0 mL/min 的流速通过 AVB 琼脂糖柱运行 PBS，直到紫外线 （UV） 吸光度曲线 （280 nm） 返回基线并变得稳定。
7. 用50 mM柠檬酸钠（pH 3.0）缓冲液以3.0 mL / min的流速从色谱柱中洗脱AAV颗粒（图5）。
   注意:当AAV颗粒与树脂解离并通过紫外线检测器时，可以在色谱图上看到蛋白质的洗脱峰。
8. 立即用五分之一体积的500mM Tris-HCl（pH 8.0）稀释AAV上清液，将含有上清液的AAV的pH值提高到约pH 5.5，以防止pH介导的降解与酸性洗脱缓冲液。此外，用PBS稀释AAV上清液10倍以完全中和pH值。
   注意:中和rAAV溶液后，pH值约为5.5。中和AAV后，用PBS（pH 7.4）稀释rAAV溶液10倍，使AAV处于生理缓冲液中。
9. 储存1 mL每个柱的径通样品，洗涤缓冲液和100μL洗脱的AAV上清液，以评估靶细胞感染的AAV的存在。
10. 用100 mL柠檬酸（pH 2.1）和100 mL PBS（pH7.4）以5.0 mL / min的流速清洁AVB Sepharose柱。以5.0 mL / min的流速用20%乙醇冲洗色谱柱，并储存在4°C。
11. 按照第4.1节所述，使用柱离线位置清洁色谱仪的管道。最后，用200 mL 20%乙醇以50.0 mL / min的流速冲洗色谱系统，并储存在20%乙醇中。

5. 使用切向流过滤（TFF）对AAV载体进行浓缩和渗滤

1. 设置配备聚砜膜盒（100 kDa分子量截止值）的TFF系统以浓缩AAV。
2. 将TFF模块与200 mL PBS平衡10分钟。
3. 通过控制泵的流量来加载AAV样品，直到样品减小到所需的体积，同时保持跨膜压力在2-3 psi。
4. 本研究中使用的 100 mL PBS 透析滞留物，或根据经验定义支持 AAV 长期稳定性的替代缓冲液。
5. 将AAV样品浓缩至所需体积后，收集AAV样品，通过0.2μm聚醚砜过滤器过滤，等分试样，然后将其储存在-80°C。

6.将AAV样品感染到靶细胞中，以评估AAV在纯化步骤中的存在

1. 在感染前一天，将7 x 10^{4 HT1080} 细胞接种在24孔板中，加入500μLDulbecco改性鹰培养基（DMEM），补充1%L-谷氨酰胺，1%丙酮酸钠和10%胎牛血清（FBS）。将细胞在37°C和5%CO₂的培养箱中培养。
2. 在感染前对细胞进行计数。在色谱柱运行前加入稀释的未纯化AAV散装样品、柱运行样品、洗涤缓冲液和洗脱的纯化AAV样品。
   注意:用血细胞计数器计数台盼蓝染细胞。根据经验确定AAV样品的稀释因子和体积（μL）。AAV滴度越高，需要的稀释度就越高。确保在柱运行前将未纯化的散装样品的杆状病毒颗粒，柱运行样品，洗涤缓冲液在感染靶细胞之前在50°C下热灭活50分钟，以确定AAV的感染性滴度。
3. 感染后两天，使用流式细胞仪分析细胞中的蛋白表达（例如，GFP或治疗基因）。
4. 使用感染时的细胞数量，稀释因子和GFP +细胞的百分比计算AAV的感染性滴度，公式为:（细胞总数x百分比GFP +细胞x稀释因子）/AAV体积（毫升）。
   注意:例如，细胞数为1×10^5，GFP+细胞的百分比为3.4%，稀释因子为100，加入的AAV体积为2μL。AAV 的滴度为 1.7 x 10⁸ 个感染单位 （IU）/mL。25 mL洗脱馏分中纯化的AAV颗粒的总量为4.3 x 10⁹ 个感染单位（IU）/ mL（图6）。初始未纯化的AAV颗粒总数为1.09 x 10¹⁰ IU / mL，纯化的AAV颗粒为4.3 x 10⁹ IU / mL。因此，回收百分比为39.4%。GFP +细胞的百分比应在1%-30%之间，当用于计算AAV的感染滴度时，对应于线性范围。如果更浓缩的AAV载体颗粒感染到靶细胞中;AAV颗粒的多个拷贝有可能感染单个细胞，该细胞将显示为载体的单个拷贝。因此，稀释AAV载体上清液以获得靶细胞中1%-30%的载体感染。如果AAV载体没有报告基因，则用含有荧光染料的抗体对AAV载体表达的转基因或治疗基因进行染色，该抗体可以使用流式细胞仪进行检测和定量。并非所有AAV血清型都能有效地感染HT1080细胞。因此，要对其他AAV血清型进行感染性测定，请使用不同的细胞系。在HT1080细胞上纯化前和纯化后滴定AAV2-GFP颗粒，并通过流式细胞术测量GFP表达。通过将纯化的AAV颗粒数与纯化的AAV颗粒数乘以100的比率计算回收率（%）。

结果

这里展示了使用Sf9昆虫细胞系统生产和纯化AAV载体的工艺开发的代表性结果。该方法包括将Sf9细胞与杆状病毒感染的TIPS细胞共培养，用生长培养基喂养细胞，收获和裂解生产细胞以释放AAV颗粒，用核酸酶处理澄清细胞裂解物，离心和过滤，使用AVB Sepharose亲和色谱法纯化AAV，并用TFF浓缩（图1）。

TIPS细胞通过感染BV-AAV2-GFP或治疗基因和BV-AAV2-rep-cap分别进?...

讨论

该协议中用于AAV载体生产，纯化和浓缩过程开发的参数可应用于基因治疗应用的AAV载体的小型和大规模制造。整个上游和下游过程可以在与当前良好生产规范（cGMP）兼容的封闭系统中执行。Sf9-杆状病毒系统的主要优点是可扩展性，能够以可承受的成本进行大规模的GMP级AAV生产。该系统不需要昂贵的质粒和转染试剂，而使用HEK293细胞生产AAV则需要这些质粒和转染试剂。据报道，HEK293细胞和Sf9细胞?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 N Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	1.09137	For Akta Avant cleaning
2 L flasks	ThermoFisher Scientific	431281	Flask for suspension culture
50 ml Conical tube	ThermoFisher Scientific	14-959-49A	For collection of supernatants
24-well plate	ThermoFisher Scientific	07-200-80	Adherent cell culture plate
250 mL flasks	ThermoFisher Scientific	238071	Flask for suspension culture
Akta Avant 150 with Unicorn Software	Cytiva	28976337	Chromatography system
AVB Sepharose High Performance	Cytiva	28411210	Chromatography medium
Baculovirus-AAV-2 GFP	In-house	non-catalog	AAV transfer vector
Baculovirus-AAV-2 rep-cap	In-house	non-catalog	AAV packaging vector
Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	Enzyme to degrade DNA and RNA
Blocking buffer	Santa Cruz Biotechnologies	516214	Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells
Cell lysis buffer	In-house	Non-catalog item	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100
Cellbag, 2 L and 10 L	Cytiva	28937662	Bioreactor bag
Cleaning buffer	In-house	Non-catalog item	100 mM citric acid (pH 2.1)
Cryovial	Thomas Scientific	1222C24	For cryopreservation
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Growth media for cell lines
Elution buffer	In-house	Non-catalog item	50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7073	For disinfection and storage of the chromatography
Filtration unit	Pall Corporation	12941	Membrane filter
HT1080 cell line	ATCC	CCL-121	Fibroblast cell line
HyClone™ SFX-Insect culture media	Cytiva	SH30278.02	Serum-free insect cell growth medium
Peristaltic Pump	Pall Corporation	Non-catalog item	TFF pump
MaxQ 8000 orbital shaker incubator	ThermoFisher Scientific	Non-catalog item	Shaker for suspension culture
Microscope	Nikon	Non-catalog item	Cell monitoring and counting
Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody	Santa Cruz Biotechnologies	65498 PE	Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells
Oxygen tank	Praxair	Non-catalog item	40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth
PBS	ThermoFisher Scientific	20012027	Wash buffer
Silver Staining kit	ThermoFisher Scientific	LC6100	Staining AAV capsid proteins
Sf9 cells	ThermoFisher Scientific	11496-015	Insect cells
Steile water	In-house	Non-catalog item	For Akta Avant cleaning
Table top centrifuge	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	For clarification of Baculovirus supernatant
Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge	Pall Corporation	OA100C12	TFF cartridge to concentrate the AAV
Tris-HCl, pH 8.0	ThermoFisher	15568025	Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV
WAVE Bioreactor System 20/50	Cytiva	28-9378-00	Bioreactor