تقييم استهلاك الأحماض الأمينية في خلايا العظام المستزرعة وأعمدة العظام المعزولة

Summary

يقدم هذا البروتوكول مقايسة امتصاص الأحماض الأمينية المشعة ، وهو مفيد لتقييم استهلاك الأحماض الأمينية إما في الخلايا الأولية أو في العظام المعزولة.

Abstract

يعتمد نمو العظام والتوازن على تمايز ونشاط الخلايا العظمية المكونة للعظام. يتميز تمايز Osteoblast بالتتابع عن طريق الانتشار يليه تخليق البروتين وفي النهاية إفراز مصفوفة العظام. يتطلب الانتشار وتخليق البروتين إمدادات ثابتة من الأحماض الأمينية. على الرغم من ذلك ، لا يعرف سوى القليل جدا عن استهلاك الأحماض الأمينية في الخلايا العظمية. هنا نصف بروتوكولا حساسا للغاية تم تصميمه لقياس استهلاك الأحماض الأمينية باستخدام الأحماض الأمينية المشعة. تم تحسين هذه الطريقة لتحديد التغيرات في امتصاص الأحماض الأمينية المرتبطة بانتشار الخلايا العظمية العظمية أو التمايز أو علاجات الأدوية أو عوامل النمو أو التلاعب الجيني المختلف. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة بالتبادل لتحديد استهلاك الأحماض الأمينية في خطوط الخلايا المستزرعة أو الخلايا الأولية في المختبر أو في أعمدة العظام المعزولة خارج الجسم الحي. أخيرا ، يمكن تكييف طريقتنا بسهولة لقياس نقل أي من الأحماض الأمينية وكذلك الجلوكوز والمواد المغذية الأخرى ذات العلامات الإشعاعية.

Introduction

الأحماض الأمينية هي مركبات عضوية تحتوي على مجموعات وظيفية أمينية (-NH₂) وكربوكسيل (-COOH) مع سلسلة جانبية متغيرة خاصة بكل حمض أميني. بشكل عام ، تعرف الأحماض الأمينية بأنها المكون الأساسي للبروتين. في الآونة الأخيرة ، تم توضيح الاستخدامات الجديدة ووظائف الأحماض الأمينية. على سبيل المثال ، يمكن استقلاب الأحماض الأمينية الفردية لتوليد مستقلبات وسيطة تساهم في الطاقة الحيوية ، أو تعمل كعوامل مساعدة إنزيمية ، أو تنظم أنواع الأكسجين التفاعلية أو تستخدم لتوليف الأحماض الأمينية الأخرى¹،²،³،⁴،⁵،^6،7،⁸،^9،10 . تظهر العديد من الدراسات أن استقلاب الأحماض الأمينية أمر بالغ الأهمية لتعدد قدرات الخلايا وانتشارها وتمايزها في سياقات مختلفة³،⁶،11،12،13^،14،¹⁵،^16،17.

الخلايا العظمية هي خلايا إفرازية تنتج وتفرز مصفوفة العظام الغنية خارج الخلية من النوع 1 من الكولاجين. للحفاظ على معدلات عالية من تخليق البروتين أثناء تكوين العظام ، تتطلب الخلايا العظمية إمدادات ثابتة من الأحماض الأمينية. لتلبية هذا الطلب ، يجب أن تكتسب الخلايا العظمية بنشاط الأحماض الأمينية. تمشيا مع هذا ، تكشف الدراسات الحديثة عن أهمية امتصاص الأحماض الأمينية والتمثيل الغذائي في نشاط الخلايا العظمية العظمية وتكوين العظام¹⁵،^16،17،¹⁸،^19،20.

تكتسب الخلايا العظمية الأحماض الأمينية الخلوية من ثلاثة مصادر رئيسية: الوسط خارج الخلية ، وتدهور البروتين داخل الخلايا ، والتخليق الحيوي للأحماض الأمينية الجديدة. سيركز هذا البروتوكول على تقييم امتصاص الأحماض الأمينية من البيئة خارج الخلية. تعتمد الطرق الأكثر شيوعا لقياس امتصاص الأحماض الأمينية إما على الأحماض الأمينية ذات العلامات الإشعاعية (على سبيل المثال ، ³H أو ¹⁴C) أو النظائر الثقيلة المصنفة (على سبيل المثال ، ¹³C). يمكن لمقايسات النظائر الثقيلة تحليل امتصاص الأحماض الأمينية والتمثيل الغذائي بشكل أكثر شمولا وأمانا ولكنها تستغرق وقتا أطول في إكمالها لعدة أيام حيث يستغرق الأمر يوما لإعداد العينات واشتقاقها وعدة أيام للتحليل على مقياس الطيف الكتلي اعتمادا على عدد العينات^21,22. وعلى سبيل المقارنة، فإن مقايسات امتصاص الأحماض الأمينية المصنفة إشعاعيا ليست مفيدة حول عملية التمثيل الغذائي في المراحل النهائية ولكنها رخيصة وسريعة نسبيا، حيث يمكن إكمالها في غضون 2-3 ساعات من بداية التجربة^23,24. هنا ، نصف بروتوكولا أساسيا قابلا للتعديل بسهولة مصمم لتقييم امتصاص الأحماض الأمينية المشعة في الخلايا الأولية المستزرعة أو خطوط الخلايا في المختبر أو أعمدة العظام الفردية خارج الجسم الحي. يمكن توسيع نطاق تطبيق هذين البروتوكولين ليشمل الأحماض الأمينية الأخرى ذات العلامات الإشعاعية وغيرها من أنواع الخلايا والأنسجة المرتبطة بالعظام.

Protocol

تمت الموافقة على جميع إجراءات الفئران الموضحة هنا من قبل لجان الدراسات الحيوانية في المركز الطبي الجنوبي الغربي بجامعة تكساس في دالاس. تمت الموافقة على بروتوكول الإشعاع من قبل اللجنة الاستشارية للسلامة الإشعاعية في المركز الطبي الجنوبي الغربي بجامعة تكساس في دالاس.

1. امتصاص الأحماض الأمينية في الخلايا (البروتوكول الأول)

1. لوحة 5 × 10⁴ خلايا ST2 في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة 12 بئرا. خلايا صفيحية في α-MEM تحتوي على 10٪ FBS و 100 U / mL البنسلين و 0.1 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (القلم / العقدية). قم بلوحة آبار إضافية من الخلايا لتحديد عدد الخلايا لكل شرط للتطبيع في الخطوة 1.12. احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂.
2. زراعة الخلايا لمدة 2-3 أيام حتى التقاء.
3. في يوم التجربة ، قم بإعداد الحلول التالية: 1x محلول ملحي مخزن مؤقتا بالفوسفات (PBS) ، و pH 7.4 و Krebs Ringers HEPES (KRH) ، ودرجة الحموضة 8.0: (120 mM NaCl ، 5 mM KCl ، و 2 mM CaCl 2 ، و 1 mM MgCl₂ ، و NaHCO₃ ، و 5 mM HEPES ، و 1 mM D-Glucose). السخونة إلى 37 درجة مئوية.
4. شفط الوسط وغسل الخلايا مرتين مع 1 مل من 1x PBS ، درجة الحموضة 7.4.
   ملاحظة: هذا البروتوكول مناسب أيضا للانقسام السريع للخلايا غير الملتقية. في هذه الحالة ، من المهم تطبيع النشاط الإشعاعي إما إلى رقم الخلية المطلق أو محتوى الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك ، ضع في اعتبارك زيادة حجم لوحة أو قارورة الثقافة لزيادة إجمالي عدد الخلايا وقيم cpm. هذا مهم لتحديد تجريبيا على أساس فردي.
5. استنشاق 1x PBS وغسل الخلايا مرة واحدة مع 1 مل KRH.
6. اصنع 4 ميكروسيت / مل L-[3,4-3 H]-الجلوتامين وسائط العمل عن طريق تخفيف 4 ميكرولتر من [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-مخزون الجلوتامين لكل ¹ مل من KRH.
   ملاحظة: قبل استخدام المواد المشعة، يرجى الاتصال بمكتب السلامة الإشعاعية في مؤسستك المنزلية للحصول على الموافقات. يجب تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالإشعاع خلف الدرع الزجاجي الشبكي.
7. احتضان الخلايا مع 0.5 مل من KRH تحتوي على 4 μCi / mL L-[3,4-3 H]-وسائط عمل الجلوتامين لمدة 5 دقائق.
8. جمع الوسط المشع وتوزيعه في حاوية النفايات السائلة. اغسل الخلايا ثلاث مرات لفترة وجيزة باستخدام KRH البارد لإنهاء التفاعل. جمع والتخلص من جميع الغسلات في حاوية النفايات السائلة المشعة.
9. أضف 1 مل من 1٪ SDS إلى كل بئر و triturate 10x لتحليل الخلايا وتجانسها. انقل التحلل الخلوي إلى أنابيب 1.5 مل. تخلص من ألواح زراعة الخلايا والماصات المصلية وأطراف الماصة في حاوية النفايات المشعة الصلبة.
10. جهاز طرد مركزي بسرعة >10,000 × جم لمدة 10 دقائق. انقل المواد الفائقة إلى قوارير تلألؤ تحتوي على 8 مل من محلول اللمعان. اخلطي عن طريق هز قوارير التلألؤ بقوة. تخلص من الأنابيب وأطراف الماصة في حاوية النفايات المشعة الصلبة.
11. اقرأ النشاط الإشعاعي بالأعداد في الدقيقة (cpm) باستخدام عداد اللمعان. تخلص من قوارير التلألؤ في حاوية نفايات قارورة اللمعان.
12. التريبسين وإنعاش وإحصاء الخلايا من الصفائح غير المشعة المتبقية من الخلايا (انظر الخطوة 1.1) لتقدير عدد الخلايا في الثقافات المشعة المحللة. باستخدام مقياس الدم، احسب عدد الخلايا لكل بئر غير مشع لكل حالة تجريبية. تطبيع ال cpm من الخطوة 1.11 إلى رقم الخلية المقدر من الصفائح غير المشعة.
13. بعد الانتهاء من التجربة ، قم بإزالة التلوث من غطاء محرك السيارة ، والمقعد ، وجميع الأدوات باستخدام رذاذ مزيل للملوثات بالنشاط الإشعاعي. وأخيرا، قم بإجراء اختبارات المسح للتأكد من أن منطقة العمل خالية من الإشعاع.

2. امتصاص الأحماض الأمينية في أنسجة العظام المعزولة حديثا (البروتوكول الثاني)

1. قبل تسخين KRH إلى 37 درجة مئوية.
2. القتل الرحيم لماوس عمره 3 أيام وإزالة الجلد على الذراعين. قم بتفكيك الهوميري من الكتف باستخدام المقص وتشريح كل من humeri. قم بإزالة جميع الأنسجة المؤقتة باستخدام مشرط وملقط. إزالة المشاش من العظام.
   ملاحظة: بالإضافة إلى humerii ، يمكن تكييف هذا البروتوكول مع عظم الفخذ الوليدي والظنبوب والكالفاريا وكذلك humerii و femora و tibiae المعزولة من الفئران البالغة من العمر 2 و 4 أشهر (بيانات غير منشورة).
3. اطرد النخاع من العظم وقم بوزن أعمدة العظام لتطبيعها في الخطوة 2.14.
4. غلي عظم العضد في 1x PBS عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا من العظام. يتم استخدام العظم المسلوق decellularized كعنصر تحكم سلبي.
   ملاحظة: كمراقبة للجودة، قام البارافين بتضمين العظام المسلوقة وغير المسلوقة للبقع النسيجية للتأكد بصريا من أن الغليان كان فعالا في إزالة الخلايا من العظام.
5. قم بموازنة كل من هوميري في 1 مل من KRH لمدة 30 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية.
6. قم بعمل حل عملي من 4 μCi / mL L-[2,3,4-3 H]-Arginine في KRH عن طريق تخفيف 4 ميكرولتر من 1μCi / μL L-[2,3,4-3 H]- مخزون أرجينين لكل 1 مل KRH.
   ملاحظة: هذا البروتوكول مناسب لتقييم امتصاص أي من المغذيات ذات العلامات المشعة يتم اختيارها. تم اختبار L-[2,3,4-3 H]-glutamine, L-[¹⁴C_U]-alanine, و L-[2,3-3 H]-proline بنتائج مماثلة. تظهر بيانات أرجينين لتسليط الضوء على فائدة هذا البروتوكول.
   تنبيه: يجب تنفيذ جميع الإجراءات التي تستخدم الإشعاع خلف الدرع الزجاجي الشبكي أثناء استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE).
7. احتضان كل من عظم التحكم التجريبي والمغلي بشكل منفصل في KRH الذي يحتوي على 4 μCi / mL L-[2,3,4-3 H]-Arginine لمدة تصل إلى 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: من المهم تحديد أوقات الحضانة تجريبيا لظروف مختلفة بما في ذلك عمر الفئران وعناصر الهيكل العظمي المختلفة وأنواع الأحماض الأمينية المشعة عن طريق إجراء دورة زمنية. يحدث التشبع في الغالب بعد حوالي 3-4 ساعات. يجب تقييم الامتصاص في نقطة زمنية في الغضب الخطي للامتصاص.
8. قم بإزالة الوسط المشع والتخلص منه في حاوية النفايات المشعة السائلة. اغسل هوميري ثلاث مرات باستخدام الثلج البارد 1 مل من KRH لإنهاء التفاعل. تخلص من جميع الغسلات في حاوية النفايات المشعة السائلة.
9. انقل كل عظمة إلى أنبوب 1.5 مل. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8.0); 0.5٪ NP40 (v/v); 0.5٪ DOX (w/v); 0.1٪ SDS (w/v)]. تخلص من ألواح الاستزراع والماصات المصلية وأطراف الماصة في حاوية نفايات صلبة مشعة.
10. قم بتجانس هوميري عن طريق تقطيع 100 مرة بالمقص في مخزن مؤقت RIPA.
11. سونيكات (السعة: 35 ٪ ، نبض 1 ثانية) العظم المتجانس الناتج لمدة 10 ثوان.
    ملاحظة: من المعروف أيضا أن الصوتنة تنتج الهباء الجوي. يمكن تنفيذ خطوات الصوتنة في خزانة السلامة البيولوجية. للحد من تكوين الهباء الجوي ، من المهم عدم ملء الأنابيب. يمكن أن يؤدي صوتنة أحجام العينات الصغيرة إلى صوتنة غير مكتملة أو فقدان العينة بسبب الرغوة. في حالة حدوث رغوة ، قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 5 دقائق حتى تستقر.
12. قم بتوضيح الليزات عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند >10000 × g في درجة حرارة الغرفة. نقل 200 ميكرولتر من supernatant إلى قوارير تلألؤ تحتوي على 8 مل من محلول اللمعان. اخلطي عن طريق هز قوارير التلألؤ بقوة. تخلص من جميع النفايات المشعة الصلبة (مثل الأنابيب المستعملة، وأطراف الماصة، والألواح، وما إلى ذلك) في حاوية النفايات المشعة الصلبة.
13. اقرأ النشاط الإشعاعي (cpm) باستخدام عداد التلألؤ. تخلص من قوارير التلألؤ المستخدمة في حاوية النفايات المشعة المخصصة لقوارير التلألؤ.
14. اطرح المقطع المكعب للعظم المغلي (القيمة القاعدية) من المقطع في الدقيقة للعظم التجريبي. تطبيع النشاط الإشعاعي مع وزن العظام من الخطوة 2.3.
15. رش غطاء محرك السيارة والأدوات والمقعد المزيل للنشاط الإشعاعي بمحلول إزالة الملوثات من النشاط الإشعاعي. قم بإجراء اختبارات المسح للتأكد من أن منطقة العمل خالية من الإشعاع.

النتائج

يتم تنظيم نقل الأحماض الأمينية من قبل العديد من ناقلات الأحماض الأمينية المرتبطة بالأغشية والتي تم تصنيفها في أنظمة نقل متميزة بناء على العديد من الخصائص ، بما في ذلك خصوصية الركيزة ، والحركيات ، وكذلك الاعتماد على الأيونات والأس الهيدروجيني²⁵. على سبيل المثال ، يمكن التوسط ف...

Discussion

يوفر البروتوكول الموصوف هنا نهجا سريعا وحساسا لتقييم امتصاص الأحماض الأمينية استجابة لمختلف التباديل التجريبية إما في المختبر أو خارج الجسم الحي. بالمقارنة مع المجموعات المتاحة تجاريا (على سبيل المثال ، مجموعة تحديد الجلوتامين والغلوتامات) ، فإن هذه الطريقة أكثر حساسية وأسرع ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200
12-well plate	Corning	3513
1 mL syringe	BD precision	309628
30G Needle	BD precision	305106
Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi	PerkinElmer	NET1123001MC
Beckman LS6500 scintillation counter
Calcium chloride	Sigma	C1016
Choline chloride	Sigma	C7077
D-(+)-Glucose solution	Sigma	G8769
Dissection Tool			Forceps, scissors, scapels
DPBS	Gibco	14190
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E9884
HEPES(1M)	Gibco	15630
L-[3,4-3H(N)]-Glutamine	PerkinElmer	NET551250UC
Liquid scintilation vials	Sigma	Z190535
Lithium chloride solution, 8M	Sigma	L7026
Magnesium chloride	Sigma	M8266
MEMα	Gibco	12561
Microcentrifuge tube, 15mL	Biotix	89511-256
NP-40	Sigma	492016
Potassium chloride	Sigma	P3911
Sodium bicarbonate	Sigma	S6014
Sodium chloride	Sigma	S9888
Sodium Deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	436143
Sonicator	Sonic&Materials	VCX130
Tris Base	Sigma	648311
Ultima Gold (Scintillation solution)	PerkinElmer	6013329
α-(Methylamino)isobutyric acid	Sigma	M2383