Évaluation de la consommation d’acides aminés dans les cellules osseuses en culture et les arbres osseux isolés

Résumé

Ce protocole présente un test d’absorption d’acides aminés radiomarqués, utile pour évaluer la consommation d’acides aminés dans les cellules primaires ou dans les os isolés.

Résumé

Le développement osseux et l’homéostasie dépendent de la différenciation et de l’activité des ostéoblastes formant des os. La différenciation des ostéoblastes est caractérisée séquentiellement par une prolifération suivie d’une synthèse protéique et, finalement, d’une sécrétion de matrice osseuse. La prolifération et la synthèse des protéines nécessitent un apport constant en acides aminés. Malgré cela, on sait très peu de choses sur la consommation d’acides aminés dans les ostéoblastes. Nous décrivons ici un protocole très sensible conçu pour mesurer la consommation d’acides aminés à l’aide d’acides aminés radiomarqués. Cette méthode est optimisée pour quantifier les changements dans l’absorption des acides aminés qui sont associés à la prolifération ou à la différenciation des ostéoblastes, aux traitements médicamenteux ou aux facteurs de croissance, ou à diverses manipulations génétiques. Il est important de noter que cette méthode peut être utilisée de manière interchangeable pour quantifier la consommation d’acides aminés dans des lignées cellulaires cultivées ou des cellules primaires in vitro ou dans des puits osseux isolés ex vivo. Enfin, notre méthode peut être facilement adaptée pour mesurer le transport de l’un des acides aminés ainsi que du glucose et d’autres nutriments radiomarqués.

Introduction

Les acides aminés sont des composés organiques qui contiennent un groupe fonctionnel amino (-_NH2) et carboxyle (-COOH) avec une chaîne latérale variable spécifique à chaque acide aminé. En général, les acides aminés sont bien connus comme le constituant de base des protéines. Plus récemment, de nouvelles utilisations et fonctions des acides aminés ont été élucidées. Par exemple, les acides aminés individuels peuvent être métabolisés pour générer des métabolites intermédiaires qui contribuent à la bioénergétique, fonctionnent comme cofacteurs enzymatiques, régulent les espèces réactives de l’oxygène ou sont utilisés pour synthétiser d’autres acides aminés 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . De nombreuses études démontrent que le métabolisme des acides aminés est essentiel pour la pluripotence, la prolifération et la différenciation cellulaires dans divers contextes 3,6,11,12,13,14,15,16,17.

Les ostéoblastes sont des cellules sécrétoires qui produisent et sécrètent la matrice osseuse extracellulaire riche en collagène de type 1. Pour maintenir des taux élevés de synthèse des protéines pendant la formation osseuse, les ostéoblastes exigent un apport constant en acides aminés. Pour répondre à cette demande, les ostéoblastes doivent acquérir activement des acides aminés. Conformément à cela, des études récentes révèlent l’importance de l’absorption et du métabolisme des acides aminés dans l’activité des ostéoblastes et la formation osseuse 15,16,17,18,19,20.

Les ostéoblastes acquièrent des acides aminés cellulaires à partir de trois sources principales: le milieu extracellulaire, la dégradation des protéines intracellulaires et la biosynthèse de novo des acides aminés. Ce protocole se concentrera sur l’évaluation de l’absorption des acides aminés à partir de l’environnement extracellulaire. Les méthodes les plus courantes pour mesurer l’absorption des acides aminés reposent sur des acides aminés radiomarqués (p. ex., ³H ou ¹⁴C) ou des isotopes lourds marqués (p. ex. ¹³C). Les dosages d’isotopomères lourds peuvent analyser l’absorption et le métabolisme des acides aminés de manière plus approfondie et plus sûre, mais ils prennent plus de temps et prennent plusieurs jours à compléter car il faut une journée pour préparer et dérivatiser les échantillons et plusieurs jours pour analyser sur le spectromètre de masse en fonction du nombre d’échantillons^21,22. En comparaison, les tests d’absorption des acides aminés radiomarqués ne sont pas informatifs sur le métabolisme en aval, mais sont peu coûteux et relativement rapides, pouvant être achevés dans les 2-3 heures suivant le début de l’expérience^23,24. Ici, nous décrivons un protocole de base facilement modifiable conçu pour évaluer l’absorption d’acides aminés radiomarqués dans des cellules primaires en culture ou des lignées cellulaires in vitro ou des arbres osseux individuels ex vivo. L’application de ces deux protocoles peut être étendue à d’autres acides aminés radiomarqués et à d’autres types de cellules et de tissus associés aux os.

Protocole

Toutes les procédures de souris décrites ici ont été approuvées par les comités d’études animales du Southwestern Medical Center de l’Université du Texas à Dallas. Le protocole de radioprotection a été approuvé par le Comité consultatif de radioprotection du Southwestern Medical Center de l’Université du Texas à Dallas.

1. Absorption d’acides aminés dans les cellules (Protocole I)

1. Plaque 5 x 10⁴ cellules ST2 dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits. Cellules en plaques dans α-MEM contenant 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 0,1 μg/mL de streptomycine (Pen/Strep). Plaquer des puits supplémentaires de cellules pour quantifier le nombre de cellules par condition pour les normalisations de l’étape 1.12. Incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C avec 5% de CO₂.
2. Culture des cellules pendant 2-3 jours jusqu’à confluence.
3. Le jour de l’expérience, préparer les solutions suivantes : 1x tampon phosphate salé (PBS), pH 7,4 et tampon Krebs Ringers HEPES (KRH), pH 8,0 : (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, _NaHCO3, 5 mM HEPES_{, 1} mM D-Glucose). Préchauffer à 37 °C.
4. Aspirer le milieu et laver les cellules deux fois avec 1 mL de 1x PBS, pH 7,4.
   REMARQUE: Ce protocole est également approprié pour diviser rapidement les cellules non confluentes. Dans ce cas, il est important de normaliser la radioactivité en fonction du nombre absolu de cellules ou du contenu de l’ADN. De plus, envisagez d’augmenter la taille de la plaque de culture ou du flacon pour augmenter le nombre global de cellules et les valeurs de cpm. Il est important de le déterminer empiriquement sur une base individuelle.
5. Aspirer 1x PBS et laver les cellules une fois avec 1 mL KRH.
6. Faire 4 μCi/mL de milieu de travail L-[3,4-3 H]-glutamine en diluant 4 μL de [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]^-Glutamine par 1 mL de KRH.
   REMARQUE : Avant d’utiliser des matières radioactives, veuillez communiquer avec le Bureau de la radioprotection de votre établissement d’attache pour obtenir des approbations. Toutes les procédures liées au rayonnement doivent être effectuées derrière le blindage en plexiglas.
7. Incuber des cellules avec 0,5 mL de KRH contenant 4 μCi/mL de milieu de travail L-[3,4-3 H]-glutamine pendant 5 min.
8. Recueillir le milieu radioactif et le distribuer dans le conteneur à déchets liquides. Lavez brièvement les cellules trois fois avec du KRH glacé pour mettre fin à la réaction. Recueillir et jeter tous les lavages dans le conteneur à déchets liquides radioactifs.
9. Ajouter 1 mL de SDS à 1% à chaque puits et triturer 10x pour lyser et homogénéiser les cellules. Transférer les lysats cellulaires dans des tubes de 1,5 mL. Jeter les plaques de culture cellulaire, les pipettes sérologiques et les pointes de pipettes dans le conteneur de déchets radioactifs solides.
10. Centrifuger à 10 000 > x g pendant 10 min. Transférer les surnageants dans des flacons à scintillation contenant 8 mL de la solution de scintillation. Mélanger en agitant vigoureusement les flacons de scintillation. Jeter les tubes et les embouts de pipettes dans un conteneur à déchets radioactifs solides.
11. Lire la radioactivité en comptage par minute (cpm) à l’aide d’un compteur à scintillation. Jeter les flacons de scintillation dans le récipient à déchets pour flacons à scintillation.
12. Trypsiniser, remettre en suspension et compter les cellules des plaques non radioactives restantes des cellules (voir étape 1.1) pour estimer le nombre de cellules dans les cultures radioactives lysées. À l’aide d’un hémocytomètre, compter le nombre de cellules par puits non radioactif pour chaque condition expérimentale. Normalisez le cpm de l’étape 1.11 au nombre de cellules estimé à partir des plaques non radioactives.
13. Une fois l’expérience terminée, décontaminer la hotte de culture cellulaire, le banc et tous les instruments avec un spray décontaminant radioactif. Enfin, effectuez des tests d’essuyage pour vous assurer que la zone de travail est exempte de rayonnement.

2. Absorption d’acides aminés dans les tissus osseux fraîchement isolés (Protocole II)

1. Préchauffer KRH à 37 °C.
2. Euthanasier une souris de 3 jours et enlever la peau des bras. Désarticulez l’huméru de l’épaule à l’aide de ciseaux et disséquez les deux humérus. Enlevez tous les tissus extemporanés à l’aide d’un scalpel et d’une pince. Retirez les épiphyses de l’os.
   NOTE: En plus de l’humerii, ce protocole peut être adapté aux fémurs, tibias et calvariae néonatals ainsi qu’aux humerii, fémurs et tibias isolés de souris âgées de 2 et 4 mois (données non publiées).
3. Rincer la moelle osseuse et peser les tiges osseuses pour normaliser à l’étape 2.14.
4. Faire bouillir un humérus dans 1x PBS à 100 °C pendant 10 min pour décellulariser l’os. L’os bouilli décellularisé est utilisé comme témoin négatif.
   REMARQUE: Comme contrôle de la qualité, la paraffine incorpore les os bouillis et non bouillis pour les taches histologiques afin de confirmer visuellement que l’ébullition était efficace pour décellulariser l’os.
5. Équilibrer les deux humérus dans 1 mL de KRH pendant 30 min dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C.
6. Faire une solution de travail de 4 μCi/mL de L-[2,3,4-3 H]-Arginine dans KRH en diluant 4 μL de 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- Stock d’arginine par 1 mL de KRH.
   REMARQUE : Ce protocole est approprié pour évaluer l’absorption de l’élément nutritif radiomarqué choisi. La L-[2,3,4-3 H]-glutamine, la L-[¹⁴C_U]-alanine et la L-[2,3-3 H]-proline ont été testées avec des résultats similaires. Les données d’arginine sont montrées pour mettre en évidence l’utilité de ce protocole.
   ATTENTION : Toutes les procédures utilisant des radiations doivent être effectuées derrière le blindage en plexiglas tout en utilisant un équipement de protection individuelle (EPI) approprié.
7. Incuber séparément l’os témoin expérimental et bouilli dans du KRH contenant 4 μCi/mL de L-[2,3,4-3 H]-Arginine pendant 90 minutes à 37 °C.
   REMARQUE: Il est important de déterminer empiriquement les temps d’incubation pour différentes conditions, y compris l’âge des souris, les différents éléments squelettiques et les types d’acides aminés radiomarqués en effectuant un cycle de temps. La saturation se produit principalement après environ 3-4 h. L’absorption devrait être évaluée à un moment donné dans la rage linéaire de l’absorption.
8. Retirer le milieu radioactif et le jeter dans le conteneur de déchets radioactifs liquides. Lavez l’humérium trois fois en utilisant 1 mL de KRH glacé pour mettre fin à la réaction. Jetez tous les lavages dans le conteneur de déchets radioactifs liquides.
9. Transférer chaque os dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 500 μL de tampon RIPA [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8,0); 0,5% NP40 (v/v); 0,5% DOX (p/v); 0,1% SDS (p/v)]. Jetez les plaques de culture, les pipettes sérologiques et les pointes de pipettes dans un conteneur à déchets solides radioactifs.
10. Homogénéiser l’humérium en hachant 100 fois avec des ciseaux dans un tampon RIPA.
11. Sonicate (Amplitude: 35%, Pulse 1 s) l’os homogénéisé résultant pendant 10 s.
    REMARQUE: La sonication est également connue pour produire des aérosols. Les étapes de sonication peuvent être effectuées dans une armoire de sécurité biologique. Pour réduire la formation d’aérosols, il est important de ne pas trop remplir les tubes. La sonication de petits volumes d’échantillons peut entraîner une sonication incomplète ou une perte d’échantillon due à la formation de mousse. En cas de moussage, centrifuger l’échantillon pendant 5 minutes pour qu’il se dépose.
12. Clarifier le lysat par centrifugation pendant 10 min à >10 000 x g à température ambiante. Transférer 200 μL du surnageant dans des flacons de scintillation contenant 8 mL de solution de scintillation. Mélanger en agitant vigoureusement les flacons de scintillation. Jeter tous les déchets radioactifs solides (p. ex. tubes usagés, embouts de pipettes, plaques, etc.) dans le contenant de déchets radioactifs solides.
13. Lire la radioactivité (cpm) à l’aide du compteur Scintillation. Jeter les flacons de scintillation usagés dans le conteneur de déchets radioactifs désigné pour les flacons de scintillation.
14. Soustrayez le cpm de l’os bouilli (valeur basale) du cpm de l’os expérimental. Normaliser la radioactivité avec le poids osseux de l’étape 2.3.
15. Vaporiser la cagoule de culture cellulaire, les instruments et le banc avec un décontaminant radioactif. Effectuez des tests d’essuyage pour confirmer que la zone de travail est exempte de rayonnement.

Résultats

Le transport des acides aminés est régulé par de nombreux transporteurs d’acides aminés liés à la membrane qui ont été classés en systèmes de transport distincts en fonction de nombreuses caractéristiques, notamment la spécificité du substrat, la cinétique, ainsi que la dépendance aux ions et au pH²⁵. Par exemple, l’absorption de glutamine peut être médiée par les systèmes de transport dépendants de Na+ A, ASC, γ+L et N ou le système L indépendant de Na^+<...

Discussion

Le protocole décrit ici fournit une approche rapide et sensible pour évaluer l’absorption des acides aminés en réponse à diverses permutations expérimentales in vitro ou ex vivo. Par rapport aux kits disponibles dans le commerce (par exemple, les kits de détermination de la glutamine et du glutamate), cette méthode est beaucoup plus sensible, plus rapide et moins exigeante en main-d’œuvre^16,17,25. ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200
12-well plate	Corning	3513
1 mL syringe	BD precision	309628
30G Needle	BD precision	305106
Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi	PerkinElmer	NET1123001MC
Beckman LS6500 scintillation counter
Calcium chloride	Sigma	C1016
Choline chloride	Sigma	C7077
D-(+)-Glucose solution	Sigma	G8769
Dissection Tool			Forceps, scissors, scapels
DPBS	Gibco	14190
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E9884
HEPES(1M)	Gibco	15630
L-[3,4-3H(N)]-Glutamine	PerkinElmer	NET551250UC
Liquid scintilation vials	Sigma	Z190535
Lithium chloride solution, 8M	Sigma	L7026
Magnesium chloride	Sigma	M8266
MEMα	Gibco	12561
Microcentrifuge tube, 15mL	Biotix	89511-256
NP-40	Sigma	492016
Potassium chloride	Sigma	P3911
Sodium bicarbonate	Sigma	S6014
Sodium chloride	Sigma	S9888
Sodium Deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	436143
Sonicator	Sonic&Materials	VCX130
Tris Base	Sigma	648311
Ultima Gold (Scintillation solution)	PerkinElmer	6013329
α-(Methylamino)isobutyric acid	Sigma	M2383