JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم طريقة اقتصادية وفعالة لعزل وتوليد خلايا تغصنية عالية النقاء مشتقة من نخاع العظام من الفئران بعد 7 أيام من الزراعة مع 10 نانوغرام / مل GM-CSF / IL-4.

Abstract

يتزايد الطلب على الخلايا المتغصنة (DCs) تدريجيا مع تقدم أبحاث علم المناعة. ومع ذلك ، فإن DCs نادرة في جميع الأنسجة. تتضمن الطريقة التقليدية لعزل DCs في المقام الأول تحفيز تمايز نخاع العظم (BM) إلى DCs عن طريق حقن جرعات كبيرة (>10 نانوغرام / مل) من عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة - البلاعم / interleukin-4 (GM-CSF / IL-4) ، مما يجعل الإجراء معقدا ومكلفا. في هذا البروتوكول ، باستخدام جميع الخلايا BM المستزرعة في وسط 10 نانوغرام / مل GM-CSF / IL-4 ، بعد 3-4 تبادلات نصف مستزرعة ، تم حصاد ما يصل إلى2.7 × 10 7 خلايا CD11c + (DCs) لكل فأر (عظم الفخذ) بنقاء 80٪ -95٪. بعد 10 أيام في الثقافة ، زاد التعبير عن CD11c و CD80 و MHC II ، في حين انخفض عدد الخلايا. بلغ عدد الخلايا ذروته بعد 7 أيام من الثقافة. علاوة على ذلك ، استغرقت هذه الطريقة 10 دقائق فقط لحصاد جميع خلايا نخاع العظم ، وتم الحصول على عدد كبير من DCs بعد أسبوع واحد من الثقافة.

Introduction

الخلايا المتغصنة (DCs) هي أقوى الخلايا التي تقدم المستضدات (APCs) لتنشيط الخلايا التائية الساذجة وتحفيز استجابات محددة للخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا (CTL) ضد الأمراض المعدية وأمراض الحساسية والخلايا السرطانية1،2،3. DCs هي الرابط الرئيسي بين المناعة الفطرية والمناعة التكيفية وتلعب دورا أساسيا في الدفاع المناعي والحفاظ على التسامح المناعي. في السنوات ال 40 الماضية ، سعى العديد من الباحثين إلى تحديد المجموعات الفرعية من DCs ووظائفها في الالتهاب والمناعة. وفقا لتلك الدراسات ، تتطور DCs على طول السلالات النخاعية واللمفاوية من خلايا نخاع العظام. اكتسبت لقاحات الأورام معالم مهمة في السنوات الأخيرة ولها مستقبل واعد. ميكانيكيا، تقوم لقاحات الأورام بتعديل الاستجابة المناعية ومنع نمو الورم عن طريق تنشيط الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا باستخدام مستضدات الورم. يلعب اللقاح القائم على DCs دورا مهما في العلاج المناعي للورم وقد تم تحديده كواحد من أكثر العلاجات المضادة للورم الواعدة 1,4. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام DCs على نطاق واسع في اختبار الأدوية الجديدة المستهدفة جزيئيا ومثبطات نقاط التفتيش المناعية5.

يحتاج الباحثون بشكل عاجل إلى عدد كبير من DCs عالية النقاء لمواصلة دراسة دور DCs. ومع ذلك ، فإن DCs نادرة في الأنسجة المختلفة والدم ، حيث تمثل 1٪ فقط من خلايا الدم في البشر والحيوانات. تعد زراعة الخلايا المتغصنة لنخاع العظم في المختبر (BMDC) طريقة مهمة للحصول على كميات كبيرة من خلايا DC. وفي الوقت نفسه ، تم استخدام بروتوكول Lutz لتوليد DCs من نخاع العظم على نطاق واسع من قبل الباحثين6. على الرغم من أن البروتوكول فعال في الحصول على خلايا DC ، إلا أنه معقد ومكلف ، حيث يتضمن إضافة تركيزات عالية من السيتوكينات وتحلل خلايا الدم الحمراء.

في هذه الدراسة ، أبلغنا عن طريقة لعزل جميع خلايا نخاع العظم تقريبا من نخاع عظم الفأر (BM) وتحفيز التمايز في BMDC بعد 7-9 أيام من الحضانة في المختبر ، مع تركيز أقل من GM-CSF و IL-4. يستغرق هذا الإجراء 10 دقائق فقط لحصاد جميع خلايا نخاع العظم تقريبا وتعليقها في وسط كامل. باختصار ، نحن نقدم طريقة زراعة فعالة وفعالة من حيث التكلفة لشركة BMDC في هذا البحث.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات بجامعة نانجينغ الطبية.

1. عزل نخاع العظم وإعداد الخلايا BM

  1. التضحية C57BL / 6 الفئران (18-22 غرام ، 6-8 أسابيع من العمر) عن طريق الاختناق CO2 . إصلاح الماوس على طاولة تشغيل الماوس. تطهير الأسطح بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  2. قطع جلد الساق لفضح العضلات والشريان الفخذي. قم بتثبيت الشريان الفخذي وتمزيقه باستخدام ملقطين ، ثم اسحب الطرف القريب نحو البطن.
    ملاحظة: لا تقطع الشريان الفخذي مباشرة. خلاف ذلك ، فإنه سوف يسبب نزيفا مفرطا ويلوث مجال الرؤية.
  3. قطع جميع العضلات حول عظم الفخذ.
  4. قم بتمديد الأطراف السفلية للفأر ببطء إلى الخارج حتى يتم سماع صوت خلع مفصل الورك ويكون هبوط رأس الفخذ مرئيا.
  5. افصل الأطراف السفلية عن الجسم باستخدام مقص على طول الجزء الداخلي من رأس الفخذ.
  6. قطع الساقين الخلفيتين من نهاية مفصل الركبة للحصول على عظم الفخذ الحر والكامل.
  7. إزالة العضلات المرتبطة بعظم الفخذ باستخدام الشاش.
    ملاحظة: لا تمزق العضلات مباشرة. عظم الفخذ من الفئران دقيق ، يجب الحفاظ على سلامته.
  8. اغمري عظم الفخذ في 75٪ من الكحول لمدة 2-5 دقائق.

2. الثقافة التعريفية ل BMDC

  1. شطف الكحول المتبقي مع PBS. استخدم ملقط مرقئ لتثبيت الجزء الأوسط والسفلي من عظم الفخذ ومجموعة أخرى لتثبيت الطرف السفلي من عظم الفخذ. يتم تطبيق ملقط مرقئ أفقيا على عظم الفخذ ، ويتم فصل عظم الفخذ عن خط المشاش.
    ملاحظة: لا يمكن رؤية خط المشاش بسهولة حتى كسور عظم الفخذ. يتم تنفيذ كل هذه الخطوات والخطوات التالية في بيئة معقمة.
  2. استخدم حقنة 1 مل (إبرة: 0.6 مم × 25 مم) لاختراق تجويف نخاع العظم من كسر خط المشاش وتدوير الإبرة لاختراق رأس الفخذ ومن خلال تجويف نخاع العظم. اخفق واغسل تجويف نخاع العظم باستخدام 1 مل من الوسط الكامل الذي يحتوي على GM-CSF / IL-4 حتى يصبح العظم أبيض.
    ملاحظة: وسط الاستزراع الكامل: 10٪ FBS ، 1٪ البنسلين الستربتومايسين ، 55 ميكرومتر β-Mercaptoethanol ، 10 نانوغرام / مل GM-CSF ، و 10 نانوغرام / مل IL-4.
  3. أعد تعليق جميع الخلايا في 24 مل من وسط الثقافة الكامل (~ 5 × 105 خلايا / مل). بعد الخلط ، تم زرع جميع الوسائط على طبق من 6 آبار مع 4 مل / بئر ، ثم تم تحضينها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة يومين.
    ملاحظة: ليس من الضروري تحليل كريات الدم الحمراء.
  4. استبدل كل الوسط بعد 2 أيام بوسط يحتوي على GM-CSF / IL-47. في الأيام الرابع والسادس والثامن ، استبدل نصف الوسط بالوسط الكامل الذي يحتوي على 10 نانوغرام / مل GM-CSF / IL-4.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، تتم إزالة الخلايا المعلقة مثل كريات الدم الحمراء والخلايا الليمفاوية.
  5. التقط صورا كل يوم لتسجيل نمو الخلايا. بدءا من اليوم السادس ، قم بحصاد بئر واحد من الخلايا يوميا لحساب رقم الخلية واكتشاف التعبير CD11c و CD80 و MHC II 6,7.

3. الكشف عن التدفق الخلوي للتعبير عن CD11c و CD80 و MHC II

  1. بعد غسل DCs باستخدام PBS ، أعد تعليق 1 × 106 خلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، وأضف 0.5 ميكروغرام من الأجسام المضادة CD16/32 المضادة للفأر ، واحتضنها لمدة 10 دقائق على الجليد لمنع مواقع المستضدات غير المحددة.
  2. أضف 1 ميكروغرام من Percp/cy5.5-CD11c، و0.5 ميكروغرام من PE-CD80، و0.04 ميكروغرام من الأجسام المضادة APC-MHC II، واحتضنها على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  3. جهاز طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وإزالة supernatant ، وإضافة 1 مل من 4٪ paraformaldehyde ، وإصلاح لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وإعادة التعليق في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
  4. إجراء قياس التدفق الخلوي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم استخراج الخلايا 1 × 10 7-1.7 × 107 من عظمي الفخذ وأعيد تعليقها في 24 مل من الوسط قبل زرعها في صفيحة من 6 آبار (الشكل 1 أ). بعد 2 أيام ، تمت إزالة الخلايا غير الملتصقة عن طريق تغيير وسط الثقافة بالكامل. قبل تغيير الوسط ، لوحظ وجود عدد كبير من الخلايا المعلقة (ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

لدى البشر والفئران مجموعات فرعية مختلفة من DC ، بما في ذلك DCs الكلاسيكية (cDCs ، بما في ذلك cDC1s و cDC2s) و plasmacytoid DCs (pDCs) ، و DCs المشتقة من الخلية الأحادية (MoDCs) 9،10،11. من المقبول عموما أن cDC1s تنظم استجابات الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا (CTL) ل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم تضارب في المصالح وأنه ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج خطة تيانجين للعلوم والتكنولوجيا (20JCQNJC00550) ، ومشروع تيانجين للعلوم والتكنولوجيا الصحية (TJWJ202021QN033 و TJWJ202021QN034).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
β-MercaptoethanolSolarbioM8211
6-well plateCorning3516
APC-MHC IIBiolegend116417
FBSGibco10100
PE-CD80Biolegend104707
Penicillin-StreptomycinSolarbioP1400
Percp/cy5.5-CD11cBiolegend117327
PRMI-1640Thermo11875093
Recombinant Mouse GM-CSFSolarbioP00184
Recombinant Mouse IL-4SolarbioP00196
TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) AntibodyBiolegend156603

References

  1. Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
  2. Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo. Biomaterials. 182, 92-103 (2018).
  3. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  4. Jiang, P. L., et al. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).
  5. Shi, Y., et al. Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity. Frontiers in Pharmacology. 11, 566401(2020).
  6. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  7. Son, Y. I., et al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).
  8. Guo, L., et al. Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer. Vaccines. 9 (7), 786(2021).
  9. Olweus, J., et al. Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).
  10. Martin, P., et al. Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).
  11. Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
  12. Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions. Frontiers in Immunology. 6, 260(2015).
  13. Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).
  14. Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
  15. Mayordomo, J. I., et al. marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).
  16. Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).
  17. Brunner, G. A., et al. Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).
  18. Koido, S., et al. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).
  19. Jonasson, P. S., et al. Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4(2014).
  20. Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).
  21. Hinkel, A., et al. Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma. Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

185 DC BMDC 4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved