Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos

Resumo

Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Resumo

A demanda por células dendríticas (DCs) está aumentando gradualmente à medida que a pesquisa em imunologia avança. No entanto, os DCs são raros em todos os tecidos. O método tradicional de isolação de DCs envolve principalmente induzir a diferenciação de medula óssea (MT) em DCs, injetando grandes doses (>10 ng/mL) de fator estimulante da colônia granulocito-macrófago/interleucina-4 (GM-CSF/IL-4), tornando o procedimento complexo e caro. Neste protocolo, utilizando todas as células BM cultivadas em 10 ng/mL GM-CSF/IL-4, após 3-4 trocas de meia cultura, até 2,7 x 10⁷ células CD11c⁺ (DCs) por rato (dois fêmures) foram colhidas com uma pureza de 80%-95%. Após 10 dias na cultura, a expressão de CD11c, CD80 e MHC II aumentou, enquanto o número de células diminuiu. O número de células atingiu o pico após 7 dias de cultura. Além disso, este método levou apenas 10 minutos para colher todas as células de medula óssea, e um alto número de DCs foram obtidos após 1 semana de cultura.

Introdução

As células dendríticas (DCs) são as células mais poderosas que apresentam antígeno (APCs) para ativar células T ingênuas e induzir respostas específicas de linfócitos T citotóxicos específicos (CTL) contra doenças infecciosas, doenças alérgicas e células tumorais ^1,2,3. Os DCs são o principal elo entre imunidade inata e imunidade adaptativa e desempenham um papel essencial na defesa imunológica e na manutenção da tolerância imunológica. Nos últimos 40 anos, muitos pesquisadores têm procurado definir os subconjuntos dos DCs e suas funções em inflamação e imunidade. De acordo com esses estudos, os DCs desenvolvem-se ao longo das linhagens mieloide e linfoides a partir de células de medula óssea. As vacinas tumorais ganharam marcos significativos nos últimos anos e têm um futuro promissor. Mecanicamente, as vacinas tumorais modulam a resposta imune e previnem o crescimento do tumor ativando linfócitos T citotóxicos usando antígenos tumorais. A vacina baseada em DCs desempenha um papel importante na imunoterapia tumoral e foi identificada como uma das terapias anti-tumores mais promissoras ^1,4. Além disso, os DCs têm sido amplamente utilizados nos testes de novas drogas de alvo molecular e inibidores de ponto de verificação imunológico⁵.

Os pesquisadores precisam urgentemente de um alto número de DCs de alta pureza para estudar melhor o papel dos DCs. No entanto, os DCs são raros em vários tecidos e sangue, representando apenas 1% das células sanguíneas em humanos e animais. A cultura in vitro de células dendríticas de medula óssea (BMDC) é um método importante para a obtenção de grandes quantidades de células DC. Enquanto isso, o protocolo Lutz para geração de DCs a partir da medula óssea tem sido amplamente utilizado pelos pesquisadores⁶. Embora o protocolo seja eficaz na obtenção de células DC, é complexo e caro, envolvendo a adição de altas concentrações de citocinas e a lise dos glóbulos vermelhos.

Neste estudo, relatamos um método para isolar quase todas as células de medula óssea da medula óssea do camundongo (MMO) e induzir a diferenciação em BMDC após 7-9 dias de incubação in vitro, com menor concentração de GM-CSF e IL-4. Este procedimento leva apenas 10 minutos para colher quase todas as células de medula óssea e suspendê-las em um meio completo. Em suma, fornecemos um método de cultivo eficiente e econômico para o BMDC nesta pesquisa.

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Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Nanjing.

1. Isolamento da medula óssea e preparação de células BM

1. Sacrifício C57BL/6 camundongos (18-22 g, 6-8 semanas de idade) via asfixia de CO₂ . Conserte o mouse na mesa de operação do mouse. Desinfete as superfícies com 70% de etanol.
2. Corte a pele da perna para expor os músculos e a artéria femoral. Grampo e rasgue a artéria femoral usando dois fórceps, em seguida, puxe a extremidade proximal em direção ao abdômen.
   NOTA: Não corte diretamente a artéria femoral. Caso contrário, causará sangramento excessivo e contaminará o campo de visão.
3. Corte todos os músculos ao redor do fêmur.
4. Estique lentamente os membros inferiores do rato para fora até que o som da luxação da articulação do quadril seja ouvido e o prolapso da cabeça femoral seja visível.
5. Separe os membros inferiores do corpo usando uma tesoura ao longo do interior da cabeça femoral.
6. Corte as pernas traseiras da extremidade da articulação do joelho para obter um fêmur livre e completo.
7. Remova os músculos ligados ao fêmur usando gaze.
   NOTA: Não rasgue os músculos diretamente. O fêmur de camundongos é delicado, sua integridade deve ser mantida.
8. Mergulhe o fêmur em 75% de álcool por 2-5 min.

2. Cultura de indução do BMDC

1. Enxágüe o álcool residual com PBS. Use fórceps hemostáticos para fixar a parte média e inferior do fêmur e outro conjunto para fixar a extremidade inferior do fêmur. As fórceps hemostáticas são aplicadas lateralmente ao fêmur, e o fêmur é separado da linha epífise.
   NOTA: A linha epífise não é facilmente visível até que o fêmur se escaia. Este e os próximos passos são todos realizados em um ambiente estéril.
2. Use uma seringa de 1 mL (agulha: 0,6 mm x 25 mm) para penetrar a cavidade da medula óssea a partir da quebra da linha epífise e gire a agulha para penetrar na cabeça femoral e através da cavidade da medula óssea. Pulso e lave a cavidade da medula óssea usando 1 mL do meio completo contendo GM-CSF/IL-4 até que o osso fique branco.
   NOTA: Ensino médio completo: 10% FBS, 1% penicilina-estreptomicina, 55 μM β-Mercaptoethanol, 10 ng/mL GM-CSF e 10 ng/mL IL-4.
3. Resuspenda todas as células em 24 mL de meio de cultura completa (~5 x 10⁵ células/mL). Após a mistura, todo o meio foi semeado em uma placa de 6 poços com 4 mL/bem, depois incubado a 37 °C com 5% de CO₂ por 2 dias.
   NOTA: Não é necessário lise eritrócitos.
4. Substitua todo o meio após 2 dias por médio contendo GM-CSF/IL-4⁷. No quarto, sexto e oitavo dias, substitua metade do meio pelo meio completo contendo 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.
   NOTA: Nesta etapa, são removidas células suspensas, como eritrócitos e linfócitos.
5. Tire fotos todos os dias para registrar o crescimento celular. A partir do sexto dia, colher um poço de células por dia para contar o número do celular e detectar a expressão CD11c, CD80 e MHC II ^6,7.

3. Detecção citométrica de fluxo da expressão de CD11c, CD80 e MHC II

1. Depois de lavar os DCs com PBS, resuspenque 1 x 10⁶ células em 100 μL de tampão FACS, adicione 0,5 μg de anticorpo cd16/32 anti-rato e incubar por 10 minutos no gelo para bloquear locais de antígeno não específicos.
2. Adicione 1 μg de Percp/cy5.5-CD11c, 0,5 μg de PE-CD80 e 0,04 μg de anticorpos APC-MHC II, e incubar no gelo por 30 min.
3. Centrifugar a 1.000 x g por 3 min a 4 °C, remover o supernascedor, adicionar 1 mL de paraformaldeído de 4%, fixar por 30 min a 4 °C e suspender em 300 μL de tampão FACS.
4. Realize a citometria de fluxo.

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Resultados

As células 1 x 10 7-1,7 x 10⁷ foram extraídas de dois fêmures e foram restequecidas em 24 mL de médio antes de serem plantadas em uma placa de 6 poços (Figura 1A). Após 2 dias, as células não aderentes foram removidas mudando completamente o meio cultural. Antes de mudar o meio, observou-se um número significativo de células suspensas (Figura 1B). Após 3 dias de cultura, pequenas colônias de células começaram a se formar. No s...

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Discussão

Humanos e camundongos têm diferentes subconjuntos dc, incluindo DCs clássicos (cDCs, incluindo cDC1s e cDC2s) DCs plasmacitóides (pDCs) e DCs derivados de monócitos (MoDCs)^9,10,11. É geralmente aceito que os cDC1s regulam as respostas citotóxicas de Linfocito T (CTL) a patógenos intracelulares e câncer, e os cDC2s regulam respostas imunes a patógenos extracelulares, parasitas e alérgenos¹². Um n...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-Mercaptoethanol	Solarbio	M8211
6-well plate	Corning	3516
APC-MHC II	Biolegend	116417
FBS	Gibco	10100
PE-CD80	Biolegend	104707
Penicillin-Streptomycin	Solarbio	P1400
Percp/cy5.5-CD11c	Biolegend	117327
PRMI-1640	Thermo	11875093
Recombinant Mouse GM-CSF	Solarbio	P00184
Recombinant Mouse IL-4	Solarbio	P00196
TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody	Biolegend	156603