Protocole économique et efficace pour isoler et cultiver des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse à partir de souris

Résumé

Nous présentons ici une méthode économique et efficace pour isoler et générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse de haute pureté à partir de souris après 7 jours de culture avec 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.

Résumé

La demande de cellules dendritiques (DC) augmente progressivement à mesure que la recherche en immunologie progresse. Cependant, les DC sont rares dans tous les tissus. La méthode traditionnelle d’isolement des DC consiste principalement à induire la différenciation de la moelle osseuse (BM) dans les DC en injectant de fortes doses (>10 ng / mL) de facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages / interleukine-4 (GM-CSF / IL-4), ce qui rend la procédure complexe et coûteuse. Dans ce protocole, en utilisant toutes les cellules BM cultivées dans un milieu GM-CSF/IL-4 de 10 ng/mL, après 3-4 échanges de demi-culture, jusqu’à 2,7 x 10⁷ cellules CD11c⁺ (DC) par souris (deux fémurs) ont été récoltées avec une pureté de 80% à 95%. Après 10 jours en culture, l’expression de CD11c, CD80 et MHC II a augmenté, tandis que le nombre de cellules a diminué. Le nombre de cellules a culminé après 7 jours de culture. De plus, cette méthode n’a pris que 10 minutes pour prélever toutes les cellules de la moelle osseuse, et un nombre élevé de DC ont été obtenus après 1 semaine de culture.

Introduction

Les cellules dendritiques (DC) sont les cellules présentatrices d’antigènes (APC) les plus puissantes pour activer les lymphocytes T naïfs et induire des réponses spécifiques aux lymphocytes T cytotoxiques (CTL) contre les maladies infectieuses, les maladies allergiques et les cellules tumorales ^1,2,3. Les DC sont le principal lien entre l’immunité innée et l’immunité adaptative et jouent un rôle essentiel dans la défense immunologique et le maintien de la tolérance immunitaire. Au cours des 40 dernières années, de nombreux chercheurs ont cherché à définir les sous-ensembles de DC et leurs fonctions dans l’inflammation et l’immunité. Selon ces études, les DC se développent le long des lignées myéloïdes et lymphoïdes des cellules de la moelle osseuse. Les vaccins tumoraux ont franchi des étapes importantes ces dernières années et ont un avenir prometteur. Mécaniquement, les vaccins tumoraux modulent la réponse immunitaire et empêchent la croissance tumorale en activant les lymphocytes T cytotoxiques à l’aide d’antigènes tumoraux. Le vaccin à base de DC joue un rôle important dans l’immunothérapie tumorale et a été identifié comme l’une des thérapies antitumorales les plus prometteuses ^1,4. En outre, les DC ont été largement utilisés dans le test de nouveaux médicaments moléculaires ciblés et d’inhibiteurs du point de contrôle immunitaire⁵.

Les chercheurs ont un besoin urgent d’un grand nombre de DC de haute pureté pour étudier plus avant le rôle des DC. Cependant, les DC sont rares dans divers tissus et sang, ne représentant que 1% des cellules sanguines chez les humains et les animaux. La culture in vitro de cellules dendritiques de la moelle osseuse (BMDC) est une méthode importante pour obtenir de grandes quantités de cellules DC. Pendant ce temps, le protocole Lutz pour générer des DC à partir de la moelle osseuse a été largement utilisé par les chercheurs⁶. Bien que le protocole soit efficace pour obtenir des cellules DC, il est complexe et coûteux, impliquant l’ajout de fortes concentrations de cytokines et la lyse des globules rouges.

Dans cette étude, nous rapportons une méthode pour isoler presque toutes les cellules de la moelle osseuse de la moelle osseuse (BM) de souris et induire une différenciation en BMDC après 7-9 jours d’incubation in vitro, avec une concentration plus faible de GM-CSF et d’IL-4. Cette procédure ne prend que 10 minutes pour prélever presque toutes les cellules de la moelle osseuse et les suspendre dans un milieu complet. En bref, nous fournissons une méthode de culture efficace et rentable pour BMDC dans cette recherche.

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Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine de Nanjing.

1. Isolement de la moelle osseuse et préparation des cellules BM

1. Sacrifier des souris C57BL/6 (18-22 g, âgées de 6-8 semaines) par asphyxie au CO₂ . Réparez la souris sur la table d’opération de la souris. Désinfectez les surfaces avec de l’éthanol à 70%.
2. Coupez la peau de la jambe pour exposer les muscles et l’artère fémorale. Serrez et arrachez l’artère fémorale à l’aide de deux pinces, puis tirez l’extrémité proximale vers l’abdomen.
   REMARQUE: Ne coupez pas directement l’artère fémorale. Sinon, il provoquera des saignements excessifs et contaminera le champ de vision.
3. Coupez tous les muscles autour du fémur.
4. Étirez lentement les membres inférieurs de la souris vers l’extérieur jusqu’à ce que le bruit de luxation de l’articulation de la hanche se fasse entendre et que le prolapsus de la tête fémorale soit visible.
5. Séparez les membres inférieurs du corps à l’aide de ciseaux le long de l’intérieur de la tête fémorale.
6. Coupez les pattes postérieures de l’extrémité de l’articulation du genou pour obtenir un fémur libre et complet.
7. Retirez les muscles attachés au fémur à l’aide de gaze.
   REMARQUE: Ne déchirez pas directement les muscles. Le fémur des souris est délicat, son intégrité doit être maintenue.
8. Immerger le fémur dans de l’alcool à 75% pendant 2-5 min.

2. Culture d’induction du BMDC

1. Rincer l’alcool résiduel avec du PBS. Utilisez une pince hémostatique pour serrer la partie centrale et inférieure du fémur et un autre ensemble pour serrer l’extrémité inférieure du fémur. Les pinces hémostatiques sont appliquées latéralement sur le fémur et le fémur est séparé de la ligne épiphysaire.
   REMARQUE: La ligne épiphysaire n’est pas facilement visible jusqu’à ce que le fémur se fracture. Cette étape et les suivantes sont toutes effectuées dans un environnement stérile.
2. Utilisez une seringue de 1 mL (aiguille : 0,6 mm x 25 mm) pour pénétrer dans la cavité de la moelle osseuse à partir de la rupture épiphysaire de la ligne et faites pivoter l’aiguille pour pénétrer dans la tête fémorale et à travers la cavité de la moelle osseuse. Pulser et rincer la cavité de la moelle osseuse en utilisant 1 mL du milieu complet contenant GM-CSF/IL-4 jusqu’à ce que l’os devienne blanc.
   REMARQUE : Milieu de culture complet : 10 % FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine, 55 μM β-mercaptoéthanol, 10 ng/mL GM-CSF et 10 ng/mL IL-4.
3. Remettre en suspension toutes les cellules dans 24 mL de milieu de culture complet (~5 x 10⁵ cellules/mL). Après mélange, tout le milieu a été ensemencé sur une plaque de 6 puits avec 4 mL/puits, puis incubé à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 2 jours.
   REMARQUE: Il n’est pas nécessaire de lyser les érythrocytes.
4. Remplacer tout le milieu après 2 jours par un milieu contenant du GM-CSF/IL-4⁷. Les quatrième, sixième et huitième jours, remplacer la moitié du milieu par le milieu complet contenant 10 ng/mL gm-CSF/IL-4.
   REMARQUE: Dans cette étape, les cellules en suspension telles que les érythrocytes et les lymphocytes sont enlevées.
5. Prenez des photos tous les jours pour enregistrer la croissance cellulaire. À partir du sixième jour, récoltez un puits de cellules par jour pour compter le nombre de cellules et détecter l’expression de CD11c, CD80 et MHC II ^6,7.

3. Détection cytométrique en flux de l’expression de CD11c, CD80 et MHC II

1. Après avoir lavé les DC avec du PBS, remettre en suspension 1 x 10⁶ cellules dans 100 μL de tampon FACS, ajouter 0,5 μg d’anticorps anti-souris CD16/32 et incuber pendant 10 min sur de la glace pour bloquer les sites d’antigènes non spécifiques.
2. Ajouter 1 μg de Percp/cy5.5-CD11c, 0,5 μg de PE-CD80 et 0,04 μg d’anticorps APC-CMHC II, et incuber sur de la glace pendant 30 min.
3. Centrifuger à 1 000 x g pendant 3 min à 4 °C, retirer le surnageant, ajouter 1 mL de paraformaldéhyde à 4 %, fixer pendant 30 min à 4 °C et remettre en suspension dans 300 μL de tampon FACS.
4. Effectuer une cytométrie en flux.

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Résultats

Les cellules 1 x 10 7-1,7 x 10⁷ ont été extraites de deux fémurs et ont été remises en suspension dans 24 mL de milieu avant d’être plantées dans une plaque de 6 puits (Figure 1A). Après 2 jours, les cellules non adhérentes ont été éliminées en changeant complètement le milieu de culture. Avant de changer de milieu, un nombre important de cellules en suspension ont été observées (figure 1B). Après 3 jours de culture, de ...

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Discussion

Les humains et les souris ont des sous-ensembles de DC différents, y compris les DC classiques (cDC, y compris les cDC1 et cDC2), les DC plasmocytoïdes (pDC) et les DC dérivés de monocytes (MoDC)^9,10,11. Il est généralement admis que les cDC1 régulent les réponses des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) aux agents pathogènes intracellulaires et au cancer, et les cDC2 régulent les réponses immunitaires aux agents pathogè...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-Mercaptoethanol	Solarbio	M8211
6-well plate	Corning	3516
APC-MHC II	Biolegend	116417
FBS	Gibco	10100
PE-CD80	Biolegend	104707
Penicillin-Streptomycin	Solarbio	P1400
Percp/cy5.5-CD11c	Biolegend	117327
PRMI-1640	Thermo	11875093
Recombinant Mouse GM-CSF	Solarbio	P00184
Recombinant Mouse IL-4	Solarbio	P00196
TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody	Biolegend	156603