JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا بروتوكول إعادة التشكيل التدريجي للخلايا الاصطناعية التي تقدم المستضدات باستخدام الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة بالخرز واستخدامها لاستجواب الإخراج المشبكي من الخلايا التائية المنشطة.

Abstract

تقدم الخلايا التي تقدم المستضدات (APCs) ثلاث إشارات تنشيط للخلايا التائية المشاركة في الاتصال الجسدي: 1) المستضد ، 2) التحفيز / التكبت المشترك ، و 3) السيتوكينات القابلة للذوبان. تطلق الخلايا التائية نوعين من الجسيمات المستجيبة استجابة للتنشيط: الحويصلات عبر المشبكية (tSVs) وجزيئات الهجوم فوق الجزيئي ، التي تنقل الرسل بين الخلايا والسمية الخلوية الوسيطة ، على التوالي. يتم استيعاب هذه الكيانات بسرعة من قبل APCs المشاركة في اتصال جسدي مع الخلايا التائية ، مما يجعل توصيفها شاقا. تقدم هذه الورقة بروتوكول تصنيع واستخدام الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة بالخرز (BSLBs) كمحاكاة للخلايا التي تقدم المستضدات (APC) لالتقاط وتحليل هذه الجسيمات عبر المشبكي. كما تم وصف بروتوكولات القياسات المطلقة لكثافات البروتين على أسطح الخلايا ، وإعادة تكوين BSLBs بهذه المستويات الفسيولوجية ، وإجراء قياس التدفق الخلوي لتتبع إطلاق الجسيمات المشبكية بواسطة الخلايا التائية. يمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة آثار البروتينات الفردية ، ومخاليط الليغاند المعقدة ، ومحددات الضراوة المسببة للأمراض ، والأدوية على مخرجات المستجيب للخلايا التائية ، بما في ذلك الخلايا التائية المساعدة ، والخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا ، والخلايا التائية التنظيمية ، والخلايا التائية المعبرة عن مستقبلات المستضدات الخيمرية (CART).

Introduction

المشبك المناعي (IS) هو بنية جزيئية محورية تشكلت في واجهة الخلايا المشاركة في الاتصال المادي الذي يسهل التبادل المنظم للمعلومات juxtracrine. تم وصف ISs مختلفة في الأدبيات ، وتشير مجموعة متزايدة من الأدلة إلى أن هذه المحاور الجزيئية هي سمة محفوظة للشبكات الخلوية. تتبادل الخلايا المناعية المختلفة، بما في ذلك الخلايا البائية والخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا المتغصنة والبلاعم والخلايا التائية، المعلومات عبر تجميع جهات الاتصال قصيرة العمر1. تعمل الدراسات متعددة الأطوار على تطوير فهم مجموعات فرعية جديدة من الكريات البيض والخلايا اللحمية التي تقود الشبكات الخلوية المسببة للأمراض وتعبر عن البروتينات السطحية ذات الوظائف غير المعروفة. كمدادات APC اصطناعية ، تسمح BSLBs بالتحقيق المباشر في الدور الوظيفي للبروتينات الفردية في دمج إشارات التنشيط ، أي المستضدات والتحفيز / التكبت المشترك ، بواسطة الخلايا التائية والإطلاق الناتج عن جزيئات المستجيب المشار إليها باسم الإشارة الرابعة.

تصف هذه الورقة البروتوكولات والنقاط التقنية الحرجة التي يجب مراعاتها أثناء استخدام BSLBs لمحاكاة التركيب السطحي ل APCs النموذجية. يتم تقديم بروتوكولات القياس الكمي للمستقبلات المناعية والبروتينات السطحية الأخرى على APCs جنبا إلى جنب مع بروتوكول إعادة تشكيل APCs الاصطناعية التي تحتوي على هذه الكميات المقاسة. بعد ذلك ، يتم تقديم الخطوات المطلوبة لزراعة الخلايا التائية و BSLB جنبا إلى جنب مع بروتوكول القياس الكمي لنقل الجسيمات عبر المشبكية باستخدام قياس التدفق الخلوي. والأكثر لفتا للنظر هو أن BSLBs تسهل دراسة مجموعة مشتقة من غشاء البلازما من tSVs تسمى الإكستومات المشبكية (SEs). يتم التخلص من SEs المخصب بمستقبلات مستضدات الخلايا التائية (TCR+) استجابة لمحفزات TCR2 ويتم التقاطها بكفاءة بواسطة BSLBs3 ، مما يمثل قراءة ممتازة لتقييم الخصائص الناهضة للمستضدات وتكوين الغشاء النموذجي. يتم إطلاق الإكسوسومات CD63+ وجزيئات الهجوم فوق الجزيئي (SMAPs) أيضا بواسطة الخلايا التائية المحفزة والتقاطها بواسطة BSLBs. يمكن استخدامها كقراءات إضافية للتنشيط وإفراز الحبيبات الخارجية والليزتيكية الناتجة بواسطة الخلايا التائية. كما أن تعبئة الحويصلات الخارجية إلى القطب المتفاعل للخلية التائية تسهل أيضا الإطلاق الاتجاهي للسيتوكينات ، مثل IL-2 و IFN-γ و IL-10 استجابة للتنشيط 4،5،6،7،8. على الرغم من أنه يمكن أيضا اكتشاف السيتوكينات التي تطلق الخلايا التائية على BSLBs ، إلا أنه يجري حاليا تطوير دراسة أكثر تكريسا للتحقق من صحة التحليل الكمي لإطلاق السيتوكين في المشبك المناعي.

لاستجواب كيفية تأثير تركيبات غشائية محددة على الناتج المشبكي للخلايا التائية يتطلب تحديد الكثافة الفسيولوجية لمكون الغشاء المستهدف. تعد القياسات الكمية القائمة على قياس التدفق الخلوي لبروتينات سطح الخلية خطوة أساسية في هذا البروتوكول وتتطلب: 1) استخدام الأجسام المضادة ذات الأعداد المعروفة من الفلوروكرومات لكل جسم مضاد (F / P) ، و 2) الخرز القياسي الذي يوفر مرجعا قياسيا لاستيفاء جزيئات الفلوروكروم من متوسط كثافة التألق المقاسة (MFIs).

تتكون هذه المعايير المرجعية من خمس مجموعات من الخرز ، يحتوي كل منها على عدد متزايد من الفلوروكرومات القابلة للذوبان المكافئة (MESFs) ، والتي تمتد عبر النطاق الديناميكي للكشف الاعتباطي التعسفي. تنتج هذه المجموعات السكانية القياسية قمم فلورية منفصلة ، مما يسهل تحويل وحدات التألق التعسفية إلى MESFs عن طريق الانحدار الخطي البسيط. ثم يتم استخدام MESFs الناتجة جنبا إلى جنب مع قيم الأجسام المضادة F / P لحساب متوسط عدد الجزيئات المرتبطة لكل خلية (أو BSLB في خطوات لاحقة). ثم يتيح تطبيق مساحات سطح الخلية المقدرة على متوسط عدد الجزيئات المكتشفة حساب الكثافات الفسيولوجية كجزيئات/ميكرومتر2. يمكن أيضا تكييف بروتوكول القياس الكمي هذا لقياس كثافات البروتين على الخلايا التائية وإعادة التركيب الكيميائي الحيوي لتركيبات الغشاء التي تتوسط في تكوين نقاط الاشتباك العصبي للخلايا التائية المتجانسة (أي نقاط الاشتباك العصبي T-T9). إذا لزم الأمر ، يمكن زيادة تقدير تكافؤ ارتباط الأجسام المضادة باستخدام أهداف مؤتلفة تحمل أعدادا معروفة من الفلوروكروم لكل جزيء. بعد ذلك ، يمكن حساب التكافؤ المرتبط بالأجسام المضادة لنفس مجموعة BSLB عن طريق مقارنة عدد البروتينات الفلورية المرتبطة والأجسام المضادة الكمي في وقت واحد (باستخدام اثنين مختلفين من الفلوروكرومات الكمية ومعايير MESF).

تتطلب إعادة تكوين أغشية APC تجميع الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة (SLBs) على حبات السيليكا 1. يمكن تسخير مخزونات الجسيمات الشحمية التي تحتوي على أنواع مختلفة من الدهون الفوسفاتية لتشكيل مصفوفة متعددة الاستخدامات ثنائية الطبقة من الدهون ، مما يتيح تثبيت البروتينات المؤتلفة مع كيمياء ربط مختلفة (يتم تفصيل إعداد الجسيمات الشحمية في 10). بمجرد تحديد الكثافة الفسيولوجية (أو الكثافات) للرباط ذي الصلة "على الخلايا" ، يتم تكييف نفس بروتوكول قياس التدفق الخلوي لتقدير تركيز البروتين المؤتلف اللازم لطلاء BSLBs بالكثافة الفسيولوجية المستهدفة. يمكن استخدام نظامي تثبيت مختلفين إما مجتمعين أو بشكل منفصل.

أولا ، SLB الذي يحتوي على 12.5 مول ٪ من الدهون الفوسفاتية المحتوية على Ni2 + يكفي لتوفير ما يقرب من 10000 موقع ربط علامته لكل ميكرون مربع 10 ويعمل بشكل جيد لتزيين BSLBs بمعظم البروتينات المتاحة تجاريا والتي لا تتجاوز كثافاتها الفسيولوجية قدرة التحميل القصوى هذه. يسخر نظام التحميل الثاني الدهون الفوسفاتية المحتوية على البيوتين (مثل مول٪) لتحميل البيوتينيل المضاد ل CD3e Fab (أو مونومرات HLA / MHC) عبر جسور الستربتافيدين. ثم يتيح الجمع بين هاتين الطريقتين للزينة BSLB الخياطة المرنة ل BSLBs كمدادات APCs اصطناعية. بالنسبة للتركيبات السطحية APC المعقدة للغاية ، يمكن زيادة نسبة المول٪ من الدهون الفوسفاتية والبروتينات لتحميل أكبر عدد ممكن من البروتينات التي يتطلبها السؤال المطروح. بمجرد تحديد تركيزات العمل من البروتينات و mol٪ من الدهون الفوسفاتية البيوتينيل ، يمكن تجميع BSLBs لاستجواب الإخراج المشبكي للخلايا التائية باستخدام قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. قياس كثافة البروتين على سطح الخلية مع قياس التدفق الخلوي الكمي

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي البشري المصفى بسعة 0.22 ميكرومتر (hFCB) عن طريق إضافة EDTA (إلى تركيز نهائي 2 ملليمتر) ومصل AB البشري (إلى 10٪ نهائي) إلى محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) ، الرقم الهيدروجيني 7.4 (انظر الجدول 1). قم بتصفية المحلول باستخدام وحدة تصفية مسام 0.22 ميكرومتر لإزالة شوائب المصل وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
  2. استعادة الخلايا وترسبتها عن طريق الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. في كل خطوة غسيل ، أعد تعليق الخلايا الموجودة في PBS إلى الحجم الأصلي (قبل الطرد المركزي) وقم بالدوران لأسفل عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
  4. عد معلقات الخلايا الملطخة باللون الأزرق في مقياس الدم11. بدلا من ذلك ، عد الخلايا باستخدام استبعاد التيار الكهربائي. بالنسبة لهذا الأخير ، اتبع تعليمات الشركة المصنعة CASY-TT (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يسمح عداد الخلايا CASY-TT بتحديد النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة وحجم الخلية وحجمها.
  5. احسب حجم PBS الذي يحتوي على 1:1000 تخفيف صبغة قابلة للإصلاح eFluor 780 أو ما شابه ذلك (انظر جدول المواد) المطلوبة لإعادة تعليق الخلايا إلى تركيز تلطيخ يبلغ 107 خلية / مل.
  6. أعد تعليق الخلايا باستخدام محلول صبغة PBS القابلة للحياة واحتضنها على الثلج لمدة 30 دقيقة.
  7. قم بإزالة صبغة الجدوى عن طريق إضافة حجم واحد من hFCB المثلج البارد. تدور على ارتفاع 300 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: من الآن فصاعدا، حافظ على سلسلة التبريد دون انقطاع.
  8. اغسل الخلايا باستخدام hFCB يحتوي على تخفيف 1:50 من محلول حجب مستقبلات Fc (انظر جدول المواد). اجلب الحجم إلى تركيز نهائي يبلغ 107 خلية / مل واحتضنه لمدة 15 دقيقة إضافية لتحقيق حجب FcgR فعال.
  9. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (أي 106 خلايا) لكل بئر من لوحة U-bottom أو V-bottom 96-well . حافظ على الخلايا على الجليد وحمايتها من الضوء (قم بتغطيتها بورق الألومنيوم).
  10. قم بإعداد مزيج رئيسي من الأجسام المضادة في hFCB من خلال تحديد تركيزات الأجسام المضادة المثلى لكل جسم مضاد مقترن بالفلوروكروم ، والأهم من ذلك ، لتلك الأجسام المضادة المستخدمة لتحديد كثافة البروتين السطحي. على سبيل المثال، من أجل القياس الكمي لتعبير ICAM-1 على مجموعات خلايا اللوزتين، كما هو موضح في الشكل 1، قم بإعداد مزيج يحتوي على 1:200 تخفيفات من مضادات CD4 و anti-CD19 و anti-CXCR5 جنبا إلى جنب مع تركيزات مشبعة من جسم مضاد مضاد ICAM-1 مع فلوروكرومات AF647 المعروفة لكل جسم مضاد (أي 10 ميكروغرام / مل ، والتي تم تعريفها من خلال تجارب معايرة الأجسام المضادة المستقلة).
  11. كضوابط إضافية ، قم بإعداد مزيج رئيسي للأجسام المضادة يحتوي على عناصر التحكم ذات الصلة بالنمط المتماثل للأجسام المضادة (بنفس التركيزات الفعالة مثل نظيراتها المترافقة مع نفس الفلوروكرومات لطرح الخلفية) ، أي استخدام 10 ميكروغرام / مل من عنصر تحكم النمط المتماثل AF647 ذي الصلة.
    ملاحظة: في المثال أعلاه ، يتم استخدام عنصر تحكم متساوي النمط هذا لطرح تألق الخلفية من إشارة ICAM-1 الحقيقية على الخلايا.
  12. عند تحديد كثافات البروتين على مجموعات فرعية من الخلايا الموجودة بترددات منخفضة داخل الأنسجة ، قم بإعداد التألق ناقص واحد (FMO) يحتوي على جميع الأجسام المضادة الملطخة باستثناء علامات الاهتمام (انظر مزيد من التفاصيل في 12).
  13. قم بتدوير الصفيحة المكونة من 96 بئرا تحتوي على الخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من السوبرناتانت ، وأعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر إما من المزيج الرئيسي للأجسام المضادة الكمي أو المزيج الرئيسي للأجسام المضادة متساوي النوع.
  14. احتضن الخلايا لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 4 درجات مئوية و 400 دورة في الدقيقة باستخدام شاكر اللوحة. حماية الألواح من الضوء (غطاء مع رقائق الألومنيوم).
  15. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام hFCB وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  16. أعد تعليق بيليه الخلية باستخدام 200 ميكرولتر من PBS (أي إلى تركيز نهائي من 5 × 106 خلية / مل).
  17. للاستحواذ:
    1. في حالة استخدام محمل BD FACS قياسي ، انقل العينات إلى أنابيب مستديرة القاع من البوليسترين سعة 5 مل (انظر جدول المواد).
    2. في حالة استخدام أجهزة أخذ العينات عالية الإنتاجية (HTS، ويشار إليها أيضا باسم قارئات اللوحات)، فانتقل على الفور إلى الخطوة 1.19.
  18. قبل الشروع في الحصول على البيانات لمعايير MESF ، تحقق من الحدود القصوى والدنيا لخطوط كثافة التألق لقنوات القياس الكمي.
  19. قبل التعويض ، احصل على بيانات لمعايير MESF ، مما يضمن سقوط كل من السكان الأكثر قتامة وألمع في النطاق الخطي للقياس.
  20. الحصول على عينات التعويض. حافظ على قيم جهد أنبوب المضاعف الضوئي (PMT) لقنوات القياس الكمي دون تغيير للحفاظ على النطاق الديناميكي للكشف. قم بإجراء تعديلات طفيفة في جهد PMT للقنوات الأخرى قبل حساب مصفوفات التعويض.
  21. حساب وتطبيق التعويض.
  22. احصل على ما لا يقل عن 2 × 104 حبة MESF إجمالية لكل قناة من قنوات القياس الكمي.
  23. حدد مجموعة الخلايا المفردة استنادا إلى مناطق تشتت الضوء الجانبية والأمامية (SSC-A و FSC-A ، على التوالي ، كما هو موضح في الشكل 1A (i)) ، متبوعا باختيار الأحداث داخل الاستمرارية الزمنية (الشكل 1A (ii)) ومنخفضة لوقت الطيران (W) في كل من FSC و SSC مقارنة بارتفاعاتها (أي ، FSC-W/FSC-H، تليها بوابة SSC-W/SSC-H كما هو موضح في الشكل 1A (III) و (IV)، على التوالي). حدد بوابة نهائية أحادية الحدث تحتوي على أحداث ذات توزيع FSC-A متناسب مقابل FSC-H (الشكل 1A (v)).
  24. الحصول على عينات التحكم (عناصر التحكم التي تحمل علامة isotype و FMO).
  25. الحصول على عينات وتسجيلها حتى يتم الحصول على ما لا يقل عن 10000 خلية مستهدفة.
    ملاحظة: يتطلب التحديد القوي لمتوسط الكثافات الجزيئية تحليل العديد من الجهات المانحة عبر تجارب مستقلة. هذا أمر بالغ الأهمية عند تحليل أي من المجموعات الفرعية للخلايا الموجودة في ترددات منخفضة أو مشتقة من مواد بيولوجية نادرة (على سبيل المثال ، من خزعات الأنسجة البشرية).
  26. اغسل مقياس الخلايا الذي يعمل لمدة 5 دقائق باستخدام محلول تنظيف FACS متبوعا ب 5 دقائق من الماء فائق النقاء قبل إيقاف تشغيل الجهاز. إذا كنت تستخدم HTS ، فاتبع الخيارات الموجودة أسفل علامة التبويب HTS وبرنامج Clean Plate.
    ملاحظة: لتقليل ترحيل العينة إلى العينة، قم بتنشيط خيارات غسل العينات أو خيارات غسل العينات عالية الإنتاجية أو العينة عالية الإنتاجية ، والتي ستقوم تلقائيا بغسل مقياس الخلايا بين الأنابيب أو الآبار. قبل البدء في عملية الاستحواذ ، قم بتشغيل مياه فائقة النقاء لمدة 10 دقائق بمعدل تدفق مرتفع لإزالة أي ملوثات بيولوجية غير مغسولة من خط عينة مقياس الخلايا.
  27. تصدير ملفات معيار قياس التدفق الخلوي (FCS).

2. تحليل الانحدار المتوسط (أو المتوسط) لشدة التألق (MFI) المبالغة في تصحيح MESF

  1. افتح برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي وقم بتحميل ملفات التجربة FCS. حدد مجموعة الخرز استنادا إلى مناطق تشتت الضوء الجانبية والأمامية (SSC-A مقابل FSC-A) ، كما هو موضح في الشكل 1A (i).
  2. التحكم في جودة البيانات عن طريق التحقق من توزيع الأحداث الفردية بمرور الوقت، كما هو موضح في الخطوة 1.24.
    ملاحظة: تخلق الفقاعات فجوات في توزيع الأحداث بمرور الوقت؛ يظهر هذا عادة في بداية الاستحواذ باستخدام هيئة تحرير الشام. تجنب اختيار الأحداث المحيطة بالفجوات في وقت الاكتساب لأنها تضيف أخطاء في القياس بسبب الانحرافات البصرية.
  3. ركز على الأحداث الفردية.
    1. خلايا
      1. تحديد الخلايا المفردة أولا استنادا إلى توزيعها فيما بين بلدان الجنوب (SSC-A) وFSC-A (الشكل 1A (I))، تليها الأحداث المنخفضة بالنسبة للحرف W في البوابتين المتتابعتين FSC-W/FSC-H (المفردات-1، الشكل 1A اللوحة (III)) وSSC-W/SSC-H (المفردات-2؛ الشكل 1 ألف اللوحة (رابعا)). حدد بوابة مفردة إضافية 3 عن طريق تحديد الأحداث ذات FSC-A و FSC-H المتناسبة (الشكل 1A ، اللوحة (v)). أخيرا ، حدد الخلايا الحية على أنها تلك السلبية لصبغة الجدوى القابلة للإصلاح.
    2. حبات MESF
      1. اتبع نفس التمييز بين المفردات -1 والمفردات -3 كما في الخطوة 2-3-1-1 (الشكل 1 باء، اللوحات من (ط) إلى (ت)). تحديد كل مجموعة من مجموعات MESF (فارغة و 1 و 2 و 3 و 4) بناء على مستويات كثافة التألق الخاصة بها (انظر الشكل 1B ، اللوحة (vi)).
  4. استخراج MFI من كسور MESF فارغة و 1 إلى 4.
  5. قم بإنشاء قيم MFI (cMFI) مصححة لكسور MESF من 1 إلى 4 عن طريق طرح مؤسسات التمويل الأصغر لمجموعات الخرز الفارغة من كل كسر.
  6. احسب الخط الأنسب للعلاقة بين cMFIs وقيم MESF التي يقدمها المورد (متغير مستقل ، كونه كسرا فارغا يساوي صفرا).
  7. استخراج الميل (b في المعادلة أدناه) للانحدار الخطي ل MESF على cMFI (توضح لوحة الشكل 1B (الثامن) انحدارا يكون فيه y = a + bx ؛ مع a = 0).
  8. استخراج الوسيط (لتوزيعات التألق ثنائي النمط) أو متوسط كثافة التألق (لتوزيعات التألق الطبيعية أو الطبيعية السجلية) من المجموعات السكانية ذات الأهمية (TFH والخلايا البائية في لوحة الشكل 1A (السابع)).
  9. كما هو الحال في الخطوات 2.5-2.7 ، قم باستخراج قيم MFI من خلايا التحكم ذات العلامات المتساوية.
  10. إذا كان F/P لعناصر التحكم في النمط المتماثل هو نفسه الأجسام المضادة الكمية، فقم بتصحيح مؤسسات التمويل الأصغر للخلايا الملطخة عن طريق طرح مؤسسات التمويل الأصغر من الخلايا المصنفة بالنمط المتساوي.
  11. إذا اختلف F/P للأنماط المتماثلة عن تلك الخاصة بالأجسام المضادة الكمية، فاستخرج MESF من الأنماط المتماثلة عن طريق قسمة مؤشرات الضعف الأصغر للخلايا الموسومة بالنمط المتماثل مع حساب المنحدر في الخطوة 2.7. اطرح Isotype MESF من القياس الكمي MESF قبل تقدير الأجسام المضادة الكمي المقيدة.
  12. قسم MESF على F/P للأجسام المضادة الكمي لتقدير عدد الجزيئات المرتبطة لكل خلية (Molec. الخلية كما هو موضح في مخطط التدفق في الشكل 1C).
  13. قسم عدد الجزيئات المرتبطة مع مساحة سطح الخلية المقدرة (CSA (μm2)) لاستخراج كثافة البروتينات على شكل موليك./μm2 (الشكل 1C). ارجع إلى قسم النتائج التمثيلية لمزيد من التفاصيل.

3. أنواع الدهون الفوسفاتية الوظيفية لاستخدامها في معايرة البروتينات التي تغطي BSLBs

  1. استخدم 0.4 mM DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) كمكون رئيسي لمصفوفة الدهون التي تشكل الطبقة الثنائية للدهون المدعومة. تمييع جميع أنواع الدهون الأخرى في محلول DOPC هذا.
  2. استخدم ما بين 0.2 و 1 مول ٪ من 0.4 mM DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) مقترنة بالأصباغ ، بما في ذلك ATTO 390 أو 488 أو 565 (انظر جدول المواد) ، لتوليد BSLBs مع التألق الداخلي.
    ملاحظة: يسهل التألق الجوهري ل BSLBs تحديد BSLBs المفردة والخلايا المفردة في تجارب النقل المتشابك.
  3. استخدم 12.5٪ مول٪ من 0.4 mM DGS-NTA (NI) ( 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl]) لتثبيت البروتينات الموسومة به. حافظ على ثبات نسبة المولي من DGS-NTA(Ni) وقم بإجراء معايرة 2 أضعاف للبروتينات الموسومة بعلامة His-التي تبدأ ب 100 نانومتر كأعلى تركيز. اترك حالة واحدة بدون بروتين كعنصر تحكم سلبي للكميات المطلقة.
    ملاحظة: تم تصميم الإشارات الملحقة وجزيئات الالتصاق ، مثل ICAM-1 ، بعلامة 12-His لزيادة تقارب البروتين ل DGS-NTA (Ni).
  4. استخدم Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) لتثبيت البروتينات البيوتينيل عبر جسور البيوتين-ستربتافيدين-البيوتين. استخدم معايرة بالتحليل الحجمي التسلسلي 5 أضعاف من 0.4 mM Biotinyl Cap PE يغطي ما بين 10 مول٪ و 0 مول٪ (كعنصر تحكم سلبي). حافظ على تركيز الستربتافيدين والبروتينات البيوتينيل ثابتة (200 نانومتر) في كل من تجارب المعايرة وإعادة تكوين APCs الاصطناعية لتجارب النقل المتشابك.
    ملاحظة: ستحدد تحليلات الانحدار للكثافات التجريبية للبروتينات البيوتينيل على نسبة المولي النهائية من Biotinyl Cap PE في مصفوفة الدهون (التي تحتوي أيضا على DGS-NTA (Ni) لتثبيت البروتينات الموسومة به) نسبة المول التي سيتم استخدامها لإعادة تشكيل الكثافات المستهدفة للمستضد.

4. تحضير محلول ملحي مخزن مؤقتا HEPES يحتوي على 1٪ من ألبومين المصل

ملاحظة: مطلوب ملحي مكمل مخزن مؤقتا ب HEPES يحتوي على 1٪ من ألبومين المصل البشري (HBS / HSA) أو 1٪ من ألبومين مصل البقر (HBS / BSA) في خطوات الغسيل وتحميل البروتين من BSLBs (الجدول 1). قم بإعداد حل مخزون HBS 10x والمخزن المؤقت العامل طازجا قدر الإمكان ؛ يحفظ في الثلاجة ويستخدم في غضون شهر واحد. في حين أن BSA هو بديل أرخص ل HSA ، إلا أنه يوفر انسدادا فعالا للدهون المخلبة Ni-chelating 13 ويوصى به للتجارب عالية الإنتاجية.

  1. قم بإعداد محلول مخزن مؤقت للمخزون 10x من HBS المكمل الذي يحتوي على 200 mM HEPES و 7 mM Na2HPO4 و 1400 mM NaCl و 50 mM KCl و 60 mM glucose و 10 mM CaCl2 و 20 mM MgCl2.
    ملاحظة: إذابة MgCl2 طاردة للحرارة للغاية وخطر الحرق. أضف هذا الملح ببطء وعلى كمية كبيرة من المذيبات. تجنب تحضير المحاليل المركزة (أي 1 متر) من هذه الأملاح لأنها تميل إلى الترسب بمرور الوقت ، مما يجعل إضافتها الدقيقة إلى المخزن المؤقت العامل صعبة.
  2. قم بتصفية محلول 10x باستخدام وحدة مرشح 0.22 ميكرومتر وابقيه معقما عند 4 درجات مئوية.
  3. بالنسبة إلى 500 مل من HBS / has ، خذ 50 مل من محلول HBS المكمل 10x ، واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 إذا لزم الأمر ، واجعل الحجم يصل إلى 483.4 مل بماء فائق النقاء.
  4. أضف 16.6 مل من محلول HSA بنسبة 30٪ إلى 483.4 مل من HBS ، الرقم الهيدروجيني 7.4.
  5. بالنسبة ل 500 مل من HBS / BSA ، قم بإذابة 5 جم من BSA في HBS واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم اخلطي بلطف في RT عن طريق قلب الزجاجة بشكل دوري حتى لا تكون هناك بلورات أو كتل بروتين مرئية.
  6. قم بتصفية المحلول الناتج من الخطوة 4.5 باستخدام وحدة مرشح 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد) وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية.

5. معايرة كثافة البروتين على BSLBs

  1. قبل أخذ حبات السيليكا غير الوظيفية التي يبلغ قطرها 5.00 ±0.05 ميكرومتر ، امزج محلول المخزون جيدا وأعد تعليق أي كتل كبيرة من الخرز المترسب في قاع القوارير.
    ملاحظة: تميل حبات السيليكا إلى الرواسب بسرعة ، مما قد يؤدي إلى أخطاء العد. امزج بقوة عن طريق سحب نصف الحد الأقصى لحجم الماصة الدقيقة P1000 لأعلى ولأسفل.
  2. قم بتخفيف 1 ميكرولتر من محلول الخرز في 1000 ميكرولتر من PBS ، وقم بحساب الخرز باستخدام غرفة قياس الدم ، واحسب تركيزها لكل مل.
    ملاحظة: ليست هناك حاجة إلى تلطيخ التربان الأزرق لتصور حبات السيليكا.
  3. احسب حجم حبات السيليكا اللازمة ل 5 × 105 BSLBs نهائية لكل نقطة من المعايرة.
  4. انقل الحجم المطلوب من حبات السيليكا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل.
  5. اغسل حبات السيليكا ثلاث مرات ب 1 مل من PBS المعقمة ، وقم بالطرد المركزي للخرز لمدة 15 ثانية على جهاز طرد مركزي دقيق على الطاولة في RT (عند دورة ثابتة في الدقيقة).
    ملاحظة: عند إزالة محلول الغسيل، تجنب إزعاج حبيبات الخرز. لن يؤثر عمود المخزن المؤقت الصغير على انتشار الجسيمات الشحمية التي تشكل المزيج الرئيسي للجسمات الشحمية لأنها موجودة أيضا في PBS.
  6. قم بإعداد ثلاثة مجلدات من المزيج الرئيسي للجسم الشحمي لتجميع BSLB على حبات السيليكا المغسولة (على سبيل المثال ، إذا كان الحجم الإجمالي الأولي لخرز السيليكا هو 20 ميكرولتر ، فقم بإعداد ما لا يقل عن 60 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للليبوسوم).
  7. لمعايرة البيوتينيل كاب بي إي مول٪
    1. تحضير الخلطات الرئيسية للدهون التي تحتوي على 5 أضعاف التخفيفات من بيوتينيل كاب PE.
      1. قم بتخفيف 0.4 mM Biotinyl Cap PE mol٪ في مصفوفة DOPC 100٪.
      2. امزج كل نقطة معايرة Biotinyl Cap PE mol٪ عند نسبة 1: 1 (vol: vol) بمحلول 0.4 mM 25٪ DGS-NTA (Ni) بحيث يوجد 12.5٪ مول نهائي من الدهون المحتوية على Ni في جميع المعايرة بالمعايرة.
        ملاحظة: تمثل نسبة 12.5٪ مول (vol:vol٪) من الدهون المحتوية على Ni تركيبة الدهون المختلطة من BSLBs التي يمكن أيضا اختبار البروتينات الموسومة عليها في معايرات متوازية. على سبيل المثال ، نظرا لأن جميع مخزونات الجسيمات الشحمية يتم تحضيرها بنفس التركيز المولي ، للوصول إلى خليط mol٪ المستهدف في 200 ميكرولتر من مزيج الجسيمات الشحمية النهائي ، ما عليك سوى خلط 100 ميكرولتر من 25 mol ٪ من DGS-NTA المحتوي على Ni مع 100 ميكرولتر من 100 mol ٪ DOPC.
    2. نقل 5 × 105 حبات سيليكا مغسولة إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل ، بحيث يتم تجميع نقطة معايرة واحدة من Biotinyl Cap PE mol٪ لكل أنبوب.
    3. أضف خلطات البيوتينيل كاب بي إي مول٪ الرئيسية للمعايرة إلى حبات السيليكا المغسولة واخلطها بلطف عن طريق سحب نصف الحجم الإجمالي لأعلى ولأسفل. تجنب تشكيل فقاعات ، والتي تدمر بشكل زائد الطبقة الثنائية للدهون.
    4. أضف غاز الأرجون (أو النيتروجين) على الأنبوب الذي يحتوي على BSLBs التي تتشكل الآن لإزاحة الهواء وحماية الدهون من الأكسدة أثناء الخلط.
    5. أضف الأرجون إلى مخزون الدهون 0.4 مللي متر قبل التخزين وتعامل معه باستخدام تقنية معقمة.
      ملاحظة: قم بتوصيل أنبوب صغير بأسطوانة غاز الأرجون/النيتروجين. قبل إضافة الغاز إلى الأنابيب ، اضبط منظم أسطوانة الغاز بحيث لا يزيد الضغط عن 2 رطل لكل بوصة مربعة. قم بتوصيل طرف ماصة معقم بأنبوب المخرج لتوجيه تيار الغاز داخل مخزون الجسيمات الشحمية لمدة 5 ثوان وأغلق الغطاء بسرعة. في حالة مخزون الدهون ، أغلق غطاء الأنبوب بفيلم البارافين قبل تخزينه عند 4 درجات مئوية.
    6. انقل BSLBs إلى خلاط مختبري عمودي متغير الزاوية (انظر جدول المواد) واخلطه لمدة 30 دقيقة في RT باستخدام خلط مداري يبلغ 10 دورات في الدقيقة.
      ملاحظة: هذه الخطوة سوف تمنع ترسيب الخرز أثناء تشكيل الطبقة الثنائية الدهون المدعومة.
    7. قم بتدوير الخرز عن طريق الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في RT على جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة ، ثم اغسله ثلاث مرات باستخدام 1 مل من HBS / HSA (BSA) لإزالة الجسيمات الشحمية الزائدة.
    8. قم بحظر BSLBs المشكلة عن طريق إضافة 1 مل من الكازين بنسبة 5٪ أو 5٪ BSA التي تحتوي على 100 ميكرومتر من NiSO4 لتشبع مواقع NTA و 200 نانومتر من الستربتافيدين لتغطية جميع مواقع تثبيت البيوتين على BSLBs بشكل موحد. اخلطي بلطف عن طريق سحب نصف الحجم الإجمالي لأعلى ولأسفل واحتضنيه في الخلاط الرأسي لمدة لا تزيد عن 20 دقيقة عند RT و 10 دورات في الدقيقة.
    9. قم بتدوير BSLBs عن طريق الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في RT على جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة ، ثم اغسله ثلاث مرات باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت HBS / HSA (BSA).
      ملاحظة: حافظ على الخرز المغسول عموديا مع حجم صغير من المخزن المؤقت للغسيل الذي يغطي BSLBs. تجنب جفاف BSLBs لأن الهواء سيدمر الطبقة الثنائية للدهون.
  8. لمعايرة البروتينات الموسومة على 12.5٪ مول٪ من BSLBs المحتوية على DGS-(Ni) NTA
    1. تحضير ثلاثة مجلدات من المزيج الرئيسي للشحم يحتوي على 12.5 مول النهائي من DGS-NTA (Ni).
    2. استخدم المزيج الرئيسي للجسمات الشحمية لإعادة تعليق حبات السيليكا المغسولة واخلطها بلطف عن طريق سحب نصف الحجم الإجمالي لأعلى ولأسفل. تجنب تشكيل الفقاعات ، والتي تلحق الضرر الزائد بالطبقة الثنائية للدهون.
    3. أضف غاز الأرجون (أو النيتروجين) على الأنبوب الذي يحتوي على BSLBs التي تتشكل الآن لإزاحة الهواء وحماية الدهون من الأكسدة أثناء الخلط.
    4. أضف الأرجون إلى مخزون الدهون 0.4 مللي متر قبل التخزين وتعامل معه باستخدام تقنية معقمة.
    5. انقل BSLBs إلى الخلاط الرأسي واخلطها لمدة 30 دقيقة في RT باستخدام الخلط المداري عند 10 دورات في الدقيقة.
    6. قم بتدوير الخرز عن طريق الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في RT على جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة ، ثم اغسله ثلاث مرات باستخدام 1 مل من HBS / HSA (BSA) لإزالة الجسيمات الشحمية الزائدة.
    7. قم بحظر BSLBs المشكلة عن طريق إضافة 1 مل من الكازين بنسبة 5٪ (أو 5٪ BSA) التي تحتوي على 100 ميكرومتر من NiSO4 لتشبع مواقع NTA على BSLBs. امزج بلطف واحتضن في الخلاط الرأسي لمدة لا تزيد عن 20 دقيقة عند RT و 10 دورة في الدقيقة.
    8. يغسل ثلاث مرات باستخدام HBS / HSA (BSA) لإزالة محلول الحجب الزائد.
    9. في لوحة U-bottom 96-well الجديدة ، قم بإعداد تخفيفات تسلسلية 2 أضعاف للبروتينات.
      1. قم بإعداد تركيز بدء قدره 100 نانومتر للبروتين ذي الأهمية في حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت HBS / HSA (BSA) ، وقم بتوزيع 100 ميكرولتر من هذا المحلول في العمود الأول ، و 100 ميكرولتر المتبقية أعلى العمود رقم 2 الذي يحتوي على 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت HBS / HSA (BSA).
      2. استمر في نقل 100 ميكرولتر بشكل متسلسل من العمود #2 إلى العمود #3 وكرر ذلك حسب الضرورة لتغطية جميع نقاط المعايرة. اترك العمود الأخير من السلسلة بدون بروتين ، حيث سيتم استخدامه كمرجع فارغ للقياس الكمي.
    10. أعد تعليق BSLBs المعدة في وحدة تخزين بحيث يتم احتواء 5 × 105 BSLB في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت HBS/HSA (BSA).
    11. انقل 100 ميكرولتر من نظام تعليق BSLB إلى آبار صفيحة ثانية ذات 96 بئرا ذات قاع U ، بحيث يتلقى كل بئر 5 × 105 BSLBs.
    12. قم بتدوير اللوحة الثانية التي تحتوي على BSLBs لمدة 2 دقيقة عند 300 × جم و RT وتخلص من supernatant.
    13. انقل أحجام 100 ميكرولتر من لوحة معايرة البروتين إلى اللوحة التي تحتوي على BSLBs الرسوبية. اخلطي بلطف ، وتجنب توليد الفقاعات الزائد أثناء السحب ، واحتضنيها لمدة 30 دقيقة عند RT و 1000 دورة في الدقيقة باستخدام شاكر اللوحة. حماية من الضوء مع رقائق الألومنيوم.
    14. اغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت HBS/HSA (BSA) باستخدام خطوات ترسيب تبلغ 300 × جم لمدة 2 دقيقة في RT.
    15. إذا كان البروتين المؤتلف المستخدم في المعايرة مقترنا مباشرة بالفلوروكرومات وله قيم F/P معروفة، فانتقل إلى الخطوة 5.8.20.
    16. إذا كان البروتين المؤتلف المستخدم في المعايرة غير مصنف أو مقترنا بالفلوروكروم أو لم يكن هناك معيار خرزة MESF متاح ، فاستخدم الأجسام المضادة المقترنة Alexa Fluor 488 أو 647 مع قيم F / P المعروفة لتلطيخ BSLB المغلف بالبروتين.
    17. وصمة عار مع تركيزات مشبعة من الأجسام المضادة الكمية.
      ملاحظة: اعتمادا على مستوى التعبير المستهدف ، تتراوح هذه بين 5 و 10 ميكروغرام / مل.
    18. قم باللصق لمدة 30 دقيقة عند RT و 1000 دورة في الدقيقة باستخدام شاكر اللوحة. حماية من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.
    19. يغسل مرتين باستخدام المخزن المؤقت HBS/HSA (BSA) ومرة واحدة باستخدام PBS باستخدام خطوات ترسيب تبلغ 300 × جم لمدة 2 دقيقة في RT.
      ملاحظة: استخدم PBS، الرقم الهيدروجيني 7.4 لإعادة تعليق BSLBs المغسولة قبل الاستحواذ. لا تستخدم المخازن المؤقتة التي تحتوي على البروتين ، لأن هذا يؤدي إلى تكوين فقاعات أثناء الخلط التلقائي للعينات مع أجهزة أخذ العينات عالية الإنتاجية.
    20. الحصول على معايير MESF ، والتأكد من بقاء ألمع القمم في نطاق الكشف الخطي لكاشف القياس الكمي (القناة) ، كما هو موضح في الشكل 1B (السابع ).
    21. الحصول على العينات يدويا أو باستخدام هيئة تحرير الشام. في حالة استخدام هذا الأخير ، أعد تعليق BSLBs في 100 ميكرولتر من PBS واحصل على 80 ميكرولتر باستخدام معدل تدفق يتراوح بين 2.5 و 3.0 ميكرولتر / ثانية ، وحجم خلط يبلغ 100 ميكرولتر (أو 50٪ من الحجم الإجمالي إذا كان حجم إعادة التعليق أقل) ، وسرعة خلط 150 ميكرولتر / ثانية ، وخمسة خلطات لضمان تشتت BSLBs أحاديا.
    22. تصدير ملفات FCS.
    23. ركز على الأحداث الفردية للتحليلات (الشكل 2 أ) ، حيث أن الثنائيات أو التوائم الثلاثة ستؤدي إلى خطأ في التحديد. استخدم التعريف المتداخل للأحداث الفردية كما هو موضح في خطوة البروتوكول 1.2.3.
    24. قم بقياس مؤشر MFI لكل كسر MESF (1-4) واطرح MFI من الخرز الفارغ لاستخراج مؤسسات التمويل الأصغر المصححة (cMFI).
    25. قم بإجراء تحليل الانحدار الخطي لاستخراج الميل (ب) من MESF فوق cMFI المحسوب لمعايير MESF ، والتي سيتم استخدامها في الخطوة 5.33.
    26. استخراج MFI لكل نقطة معايرة وطرح MFI من الخرز بدون بروتين للحصول على cMFIs.
    27. قسم cMFIs مع الميل المحسوب في الخطوة 5.31 لاستخراج MESF المرتبط ب BSLBs لكل نقطة معايرة.
    28. قسم MESF المرتبط ب BSLBs على قيمة F / P للجسم المضاد الكمي لاستخراج متوسط عدد الجزيئات المرتبطة لكل BSLB.
    29. باستخدام قطر BSLBs (5.00 ± 0.05 ميكرومتر) ، قم باستخراج مساحة سطح الخرز (SA = 4pr2) لحساب الكثافات النهائية للبروتين (molec./μm2) لكل نقطة معايرة (تركيز البروتين).
    30. قم بإجراء تحليل انحدار جديد لتركيز البروتين على كثافة البروتين لحساب الميل (ب) للخط الأكثر ملاءمة.
      ملاحظة: يمنح تركيز 12.5 مول٪ من DGS-NTA (Ni) قدرة تثبيت قصوى تبلغ حوالي 10000 موليك./μm210 دون الحث على التنشيط غير المحدد للخلايا التائية أو التأثير على الحركة الجانبية ل SLBs.

6. إجراء تجارب نقل متشابك بين الخلايا التائية و BSLBs

  1. قبل تشغيل تجربة النقل المتشابك
    1. احصل على BSLBs غير الفلورية ، BSLBs مع الدهون الفلورية ، الخلايا غير الملطخة (أو حبات التعويض ؛ انظر جدول المواد) ، والخلايا الملونة أحادية اللون (أو حبات التعويض) لتحديد تفاعلات طيف التألق للأداة. ركز على أجهزة الكشف ذات الانتشار غير المباشر المرتفع لإعادة تصميم اللوحة متعددة الألوان ، وزيادة الحساسية ، وتقليل خطأ القياس على أجهزة الكشف الحرجة (انظر 14).
    2. معايرة الأجسام المضادة للكشف للعثور على التركيز الأمثل ، مما يتيح الكشف عن الأحداث الإيجابية دون المساس بالكشف عن السلبيات.
      ملاحظة: كرر هذه الخطوة كلما كان هناك تغيير في كمية الأجسام المضادة حيث تختلف قيم F/P والسطوع من دفعة إلى أخرى.
    3. اختياري: قم بتحسين جهد PMT عن طريق الحصول على العينة في نطاقات جهد مختلفة (أي أن الجهد يمشي) للعثور على PMTs مما يؤدي إلى الإشارة المثلى على الضوضاء (أي فصل السلبيات والإيجابيات مع ضمان بقاء إشارة ألمع السكان في النطاق الخطي).
  2. قياس نقل إخراج الخلايا التائية إلى BSLBs
    1. تحضير RPMI 1640 المكمل (هنا R10 المتوسطة) التي تحتوي على 10 ٪ من مصل البقر الجنيني المعطل حراريا (FBS) ، 100 ميكرومتر من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، 10 mM HEPES ، 2 mM L-glutamine ، 1 mM بيروفات الصوديوم ، 100 U / ml من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. استخدم وسيط R10 لزراعة الخلايا التائية وتوسيعها.
    2. في اليوم 1 ، اعزل الخلايا التائية عن غرف الدم المحيطي أو نظام تقليل الكريات البيض (LRS). استخدم مجموعات عزل الخلايا المناعية وفصلها (انظر جدول المواد) لإثراء الخلايا التائية CD4+ و CD8+ البشرية.
    3. زرع الخلايا بتركيز نهائي يتراوح بين 1.5 و 2.0 × 106 خلية / مل ، باستخدام ألواح 6 آبار لا تزيد عن 5 مل في المجموع لكل بئر.
    4. قم بتنشيط الخلايا التائية باستخدام نسبة 1: 1 من تنشيط الخلايا التائية البشرية (anti-CD3 / anti-CD28) الخرز المغناطيسي (انظر جدول المواد) وإضافة 100 وحدة دولية من IL-2 البشري المؤتلف لدعم تكاثر الخلايا والبقاء على قيد الحياة.
    5. في اليوم 3 ، قم بإزالة الخرز المغناطيسي المنشط باستخدام أعمدة مغناطيسية (انظر جدول المواد). تأكد من بقاء الخرز المغناطيسي متصلا بجانبي الأنبوب قبل استعادة الخلايا للحصول على خطوات غسيل إضافية.
    6. اغسل الخرز المغناطيسي مرة أخرى ب 5 مل من وسط R10 الطازج ، واخلطه جيدا ، وضعه مرة أخرى في المغناطيس . استعادة هذا الحجم وخلط مع الخلايا المستردة في الخطوة 6.2.5.
    7. أعد تعليق الخلايا إلى 1.5-2 × 106 خلية/مل في R10 طازج يحتوي على 100 يو/مل من IL-2. قم بتجديد الوسط بعد 48 ساعة ، مع التأكد من أن آخر إضافة ل IL-2 هي 48 ساعة قبل يوم التجريب (الأيام 7 إلى 14 من الثقافة).
    8. في يوم تجربة النقل المتشابك ، قم بإعداد وسيط فحص النقل المشبكي (انظر الجدول 1) عن طريق استكمال وسط RPMI 1640 الخالي من الفينول الأحمر مع 10٪ FBS ، و 100 ميكرومتر من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 2 mM L-glutamine ، و 1 mM من بيروفات الصوديوم ، و 100 U / ml من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. لا تقم بتضمين IL-2 البشري المؤتلف.
    9. عد الخلايا باستخدام إما تلطيخ التربان الأزرق أو استبعاد التيار الكهربائي وإعادة تعليقها إلى تركيز نهائي من 2.5 × 106 خلية / مل في الوسط. إذا لوحظ موت الخلايا المفرط (>10٪) ، فقم بإزالة الخلايا الميتة / الميتة باستخدام مزيج من السكريات ودياتريزوات الصوديوم (انظر جدول المواد) على النحو التالي:
      1. طبقة 15 مل من زراعة الخلايا فوق 13 مل من محلول دياتريزوات الصوديوم متعدد السكاريد.
      2. جهاز طرد مركزي لمسافة 1,250 × جم لمدة 20 دقيقة في RT مع الحد الأدنى من التسارع وخفض التسارع. اجمع طبقة الخلية (السحابة) في الواجهة بين الوسط ومحلول دياتريزوات السكريات والصوديوم.
      3. اغسل الخلايا مرتين على الأقل باستخدام وسيط فحص نقل Synaptic قبل التسخين (تم إعداده في الخطوة 6.2.7).
      4. عد الخلايا وأعد تعليقها إلى تركيز نهائي يبلغ 2.5 × 106 / مل باستخدام وسيط فحص النقل المتشابك. الزراعة المشتركة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية هذا مع BSLBs (انظر الخطوة 6.2.15).
    10. حساب عدد BSLBs اللازمة للتجربة ؛ النظر في جميع الخلطات الرئيسية المختلفة للبروتين ومعايرة المستضدات التي سيتم اختبارها (إما مونومرات HLA / MHC-peptide البيوتينيل الأحادي أو أحادي البيوتينيل المضاد ل CD3ε Fab).
    11. قم بتجميع BSLBs باتباع نفس الخطوات من قسم البروتوكول 5 ولكن هذه المرة ، قم بدمج جميع معايرة البروتينات والدهون المطلوبة لإعادة تكوين غشاء APC معقد (الشكل 3A). حافظ على نفس المجلد: علاقات المجلد بين حجم حبات السيليكا الأولي وحجم مزيج البروتين المستخدم أثناء المعايرة ، وكذلك الأوقات ودرجات الحرارة المستخدمة في تحميل BSLBs. على سبيل المثال ، إذا تم استخدام 0.5 ميكرولتر من حبات / بئر السيليكا و 100 ميكرولتر / بئر من مزيج البروتين للمعايرة الأولية ، فحافظ على نسب 5: 1000 vol: vol لإعداد BSLBs ليتم زراعتها مع الخلايا التائية.
    12. بمجرد تحميل BSLBs بمزيج البروتين المثير للاهتمام ، اغسل BSLBs مرتين باستخدام HBS / HSA (BSA) لإزالة البروتينات الزائدة غير المقيدة. استخدم سرعات ترسيب تبلغ 300 × جم لمدة 2 دقيقة في RT في كل خطوة غسيل وتخلص من المواد الفائقة.
    13. إعادة تعليق 5 × 105 BSLBs لكل بئر في 200 ميكرولتر.
    14. انقل 100 ميكرولتر لكل بئر إلى لوحة جديدة من 96 بئرا ذات قاع U لعمل نسخة مكررة ، بحيث تكون الكمية النهائية من BSLB لكل بئر 2.5 × 105.
    15. قم بتدوير BSLBs عند 300 × جم لمدة 2 دقيقة و RT وتخلص من supernatant.
    16. إعادة تعليق BSLBs باستخدام 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا التائية ؛ تخلط بلطف لمنع تشكيل فقاعات.
    17. احتضان الثقافات المشتركة لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن إعادة تعليق الخلايا والخرز في المخزن المؤقت HBS/HSA (BSA) بدلا من RPMI الخالي من الفينول الأحمر للزراعة المشتركة. في هذه الحالة ، يجب إجراء الحضانة في حاضنة غير CO2 لأن هذا الغاز سوف يحمض المخزن المؤقت بسرعة في حالة عدم وجود بيكربونات.
    18. قم بتبريد مزارع الخلايا BSLB-T عن طريق احتضان الخلايا أولا في RT لمدة لا تقل عن 15 دقيقة. حمايتهم من الضوء.
    19. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق في 500 × g و RT ؛ تخلص من السوبرناتانت.
    20. أعد تعليق الخلايا في RT 2٪ BSA-PBS (Ca2+ و Mg2+-free) للحظر. ضع الخلايا على الجليد لمدة 45 دقيقة. حماية من الضوء.
    21. أثناء احتضان الخلايا ، قم بإعداد المزيج الرئيسي للأجسام المضادة باستخدام BSA 2٪ المصفى بنسبة 2٪ من الثلج البارد 0.22 ميكرومتر في PBS كمخزن مؤقت للتلطيخ ، مما سيوفر حظرا إضافيا.
      ملاحظة: تميل بعض دفعات الأجسام المضادة المقترنة بأصباغ البنفسج اللامع إلى الارتباط ب BSLBs بشكل غير محدد. يساعد الحظر باستخدام 5٪ BSA-PBS على تقليل هذه الضوضاء. من الآن فصاعدا ، تأكد من الحفاظ على سلسلة التبريد دون انكسار.
    22. قم بتدوير الثقافات المشتركة عند 500 × جم لمدة 5 دقائق و 4 درجات مئوية. قبل التخلص من السوبرناتونات، تأكد لفترة وجيزة من وجود الكريات عن طريق فحص الجزء السفلي من اللوحة المكونة من 96 بئرا باستخدام إضاءة خلفية.
    23. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أعد تعليق الخلايا في المزيج الرئيسي الملون الذي يحتوي على تركيزات الأجسام المضادة المحسنة.
      ملاحظة: استخدم أطراف الماصة بدون مرشح لمنع توليد الفقاعات والأخطاء في توزيع أحجام التلطيخ.
    24. قم بتضمين الخلايا ذات العلامات المتساوية و BSLBs ، و BSLBs الفلورية وغير الفلورية ، والخلايا و BSLBs الملطخة وحدها. احترم العدد الإجمالي للأحداث لكل بئر لجميع عناصر التحكم (أي BSLBs فقط التي تحتوي على 5 × 105 BSLB / well ، وعناصر التحكم الخلوية فقط التي تحتوي على 5 × 105 خلية / بئر لتجنب الزيادة النسبية للأجسام المضادة لكل حدث ملطخ).
    25. اخلطي بلطف عن طريق سحب نصف الحجم لأعلى ولأسفل واحتضنيه لمدة 30 دقيقة على الثلج. حماية من الضوء.
    26. اغسل الخلايا و BSLBs مرتين باستخدام 2٪ من BSA-PBS ، ودرجة الحموضة 7.4 ، وخطوات الترسيب من 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الزراعات المشتركة المغسولة في 100 ميكرولتر من PBS واحصل عليها على الفور.
    27. إذا كانت هناك حاجة إلى التثبيت ، فقم بالإصلاح باستخدام 0.5٪ w / v من PFA في PBS لمدة 10 دقائق ، واغسله مرة واحدة ، واحتفظ به في PBS حتى الاستحواذ. حماية من الضوء.
    28. قبل التعويض ، احصل على معايير MESF ، مما يضمن سقوط كل من السكان الأكثر قتامة وألمع في النطاق الخطي للقياس.
    29. الحصول على عينات التعويض وحساب التعويض وتطبيق مصفوفة التعويض (الرابط) على التجربة.
    30. الحصول على ما لا يقل عن 2 × 104 إجمالي معايير MESF لكل قناة من قنوات القياس الكمي.
    31. للاقتناء باستخدام أجهزة أخذ العينات عالية الإنتاجية ، قم بتعيين اكتساب الأدوات إلى المعيار ، واضبط اكتساب العينة على 80 ميكرولتر (أو 80٪ من الحجم الكلي) ، ومعدل تدفق العينة بين 2.0 و 3.0 ميكرولتر / ثانية ، وحجم خلط العينة من 50 ميكرولتر (أو 50٪ من الحجم الإجمالي لتجنب تكوين الفقاعة أثناء الخلط) ، وخلط العينات من 150 ميكرولتر / ثانية ، والخلط لكل بئر بين 3 و 5.
    32. الحصول على ما لا يقل عن 1 × 104 BSLBs مفردة لكل عينة (راجع لوحات الشكل 3B (i) - (vi) للحصول على استراتيجية البوابة المرجعية).
    33. اغسل مقياس الخلايا لمدة 5 دقائق بمحلول تنظيف متبوعا ب 5 دقائق من الماء فائق النقاء قبل إيقاف تشغيل الجهاز. إذا كنت تستخدم هيئة تحرير الشام، فاتبع الخيارات الموجودة ضمن علامة التبويب HTS والخيار تنظيف .
    34. تصدير ملفات FCS.

7. قياس النقل المتشابك للجسيمات إلى BSLB

  1. افتح التجربة FCS من الملفات. حدد مجموعة الخلايا و BSLBs بناء على مناطق تشتت الضوء الجانبية والأمامية (SSC-A مقابل FSC-A) ، كما هو موضح في الشكل 3B (i).
  2. حدد الأحداث داخل نافذة الاكتساب المستمر (الشكل 3B (ii)).
  3. التركيز على الأحداث الفردية لكل من الخلايا و BSLB ؛ تحديد الخلايا المفردة أولا استنادا إلى انخفاض W في البوابات المتسلسلة FSC-W/FSC-H (مفردة-1، الشكل 3B اللوحة (III)) و SSC-W/SSC-H (مفردات-2; الشكل 3 باء اللوحة (رابعا)). حدد بوابة مفردة إضافية 3 عن طريق تحديد الأحداث ذات FSC-A وFSC-H المتناسبة (الشكل 3B ، اللوحة (v)).
  4. استخراج MFI من كسور MESF فارغة و 1 إلى 4 ومن خلايا مفردة و MESF لكل عينة تجربة.
  5. قم بإنشاء قيم MFI (cMFI) مصححة لكسور MESF من 1 إلى 4 عن طريق طرح MFI لمجتمع الخرز الفارغ من كل كسر.
  6. إنشاء cMFIs ل BSLBs والخلايا الفردية (راجع لوحة الشكل 3C (i)).
  7. استخدم الإشارة من BSLB الملطخة بالأجسام المضادة للتحكم في النمط المتماثل لتصحيح MFI من BSLB الملطخة بالأجسام المضادة ضد علامات الخلايا التائية ذات الصلة. استخدم cMFI لحساب النسبة المئوية للنقل المتشابك المعياري (NST٪) باستخدام المعادلة الموضحة في لوحة الشكل 3C (ii).
  8. إذا كنت مهتما بدلا من ذلك بالجسيمات المنقولة على وجه التحديد استجابة لمشغل TCR ، فاطرح الإشارة من BSLBs الخالية من MFI ل BSLBs الناهضة. استخدم cMFI هذا لحساب NST٪ المدفوع ب TCR باستخدام المعادلة الموضحة في لوحة الشكل 3C (ii).
  9. إذا كنت مهتما بتحديد العدد الإجمالي للجزيئات المنقولة كشحنة جسيمات عبر واجهة T cell-BSLB ، فاحصل على حبات MESF القياسية باستخدام نفس إعدادات الأداة وجلسة اقتناء للمزارع المشتركة بين الخلايا التائية و BSLB.
  10. تحليل مجموعات حبات MESF واستخراج cMFIs الخاصة بهم كما هو موضح في خطوات البروتوكول 5.8.15 إلى 5.8.17. احسب ميل الخط الأنسب لتحليل انحدار MESF على cMFI.
  11. استخدم الميل المحسوب لاستخراج عدد MESF المودع على BSLBs. استخدم cMFIs المحسوبة إما باستخدام عناصر تحكم isotype أو BSLB فارغة كفراغات لاستخراج عدد MESF المنقول خصيصا إلى BSLBs المحفزة.
  12. احسب عدد جزيئات العلامات المنقولة إلى BSLBs بقسمة MESFs المحسوبة (المتوسطة) لكل BSLB على قيمة F/P للجسم المضاد الكمي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

FCM لتحديد كمية البروتين المطلق على سطح الخلية
تتطلب إعادة تكوين BSLBs التي تقدم كثافات فسيولوجية للروابط تقدير كثافة البروتين الكلية على المجموعة الفرعية للخلايا النموذجية. لإعادة تشكيل BSLBs ، قم بتضمين أي روابط ذات صلة من المتوقع أن تلعب دورا في محور الإشارة ذي الأهمية إلى جانب ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

BSLBs هي أدوات متعددة الاستخدامات لدراسة إخراج الجسيمات من الخلايا التائية التي يتم تحفيزها باستخدام أغشية APC النموذجية. تسمح مرونة الطريقة بإعادة تكوين تركيبات الأغشية المعقدة والاختزالية لدراسة آثار الأربطة وإشاراتها على إفراز tSVs وجزيئات الهجوم فوق الجزيئي ومكوناتها. لقد اختبرنا هذه ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.

Acknowledgements

نحن ممتنون لأعضاء مختبرنا ومجتمع معهد كينيدي لأمراض الروماتيزم على المناقشات العلمية البناءة ، وخاصة مدير مرفق قياس التدفق الخلوي جوناثان ويبر. تم تمويل هذا العمل من قبل زمالة Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z ، ومنحة ERC المتقدمة (SYNECT AdG 670930) ، وصندوق كينيدي لأبحاث الروماتيزم (KTRR) (الثلاثة إلى MLD). تم دعم PFCD من قبل زمالة EMBO طويلة الأجل (ALTF 1420-2015 ، بالتعاون مع المفوضية الأوروبية (LTFCOFUND2013 ، GA-2013-609409) وماري Sklodowska-Curie Actions) وزمالة أكسفورد-بريستول مايرز سكويب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)Avanti Polar Lipids790404C-25mg18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform

PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL		GilsonFA10011
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholineAvanti Polar Lipids850375C-25mg 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390ATTO-TECAD 390-165DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488ATTO-TECAD 488-165DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565ATTO-TECAD 565-165DOPE ATTO 565
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt)Avanti Polar Lipids870273C-25mg18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform
200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, StackStarlabS1111-0206
5 mL polystyrene round-bottom tubesFalcon®352052
5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beadsBangs Laboratories Inc.SS05003
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic.Costar®3799For FCM staining and co-culture of BSLB and cells.
96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic.Costar®3894For FCM staining of cells or beads in suspension.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester)Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™A37573 and A20006
Allegra X-12R CentrifugeBeckman CoulterFor normal in tube staining of biological samples for FCM
Aluminum FoilAny brandFor protecting cells and BSLBs from light
anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31BioLegend310815 and 310818Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4BioLegend356934For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19BioLegend302234For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD2, clone RPA-2.10BioLegend300202Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD2, clone TS1/8BioLegend309218Brilliant Violet 421 conjugate.
anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1BioLegendAlexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD28, clone CD28.2eBioscience16-0289-85Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8ThermoFisher Scientific, invitrogen53-3179-42Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E.
anti-human CD38, clone HB-7BioLegend356624Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD38, clone HIT2BioLegend303514Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD39, clone A1BioLegendLabeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4BioLegend317436For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD4, clone A161A1BioLegend357414 and 357421PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD4, clone OKT4BioLegend317414 and 317422PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD40, clone 5C3BioLegend334304Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD40, clone G28.5BioLegendLabelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD45, clone HI30BioLegend304056 and 368516Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates
anti-human CD47, clone CC2C6BioLegend323118Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54BioLegend322702Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6BioLegend353020 and 353015PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD73, clone AD2BioLegend344002Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD80, clone 2D10BioLegend305216Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD81, clone 5A6BioLegend349512 and 349502PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively.
anti-human CD82, clone ASL-24BioLegend342108Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD86, clone IT2.2BioLegend305416Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD8a, clone HIT8aBioLegend300920Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD8a, clone SK1BioLegend344724Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32BioLegend311414 and 311402Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human HLA-DR, clone L243BioLegend307656 and 307622Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human ICAM-1, clone HCD54BioLegend322702Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human ICOS, clone C398.4ABioLegend313516Armenian Hamster IgG
anti-human ICOSL, clone MIH12BioLegend329611Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human ICOSL, clone MIH12eBioscience16-5889-82Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human LFA-1, clone TS1/22BioLegendProduced in houseLabelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35)BioLegend350018Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-1 , clone EH12.2H7BioLegend135230 and 329902Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L1, clone 29E.2A3BioLegend329702Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L2, clone 24F.10C12BioLegend329611Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-L2, clone MIH18BioLegend345502Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human TCRab, clone IP26BioLegend306712 and 306714Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14BioLegend352702
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38EBioLegend348404Alexa Fluor 647 conjugate
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888BioLegend400902Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer Setup and Tracking beadsBecton Dickinson & Company (BD)641319Performance track of instruments before quantitative FCM
BD FACSDivaBecton Dickinson & Company (BD)23-14523-00Acquisition software
Bovine Seum AlbuminMerck, Sigma-AldrichA3294
CaCl2, Calcium chlorideMerck, Sigma-AldrichC5670anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0%
Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powderMerck, Sigma-AldrichC5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28ThermoFisher Scientific, Gibco11132D
DynaMag-2ThermoFisher Scientific, Invitrogen™12321DFor the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL
DynaMag™-15ThermoFisher Scientific, Invitrogen™12301DFor the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL
Fetal Bovine Serum Qualified, One ShotThermoFisher Scientific, GibcoA3160801Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC
Ficoll-Paque PLUSCytiva, GE HealthcareGE17-1440-02Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation
Fixable Viability Dye eFluor 780eBiosciences65-0865-14For the exclusion of dead cells during analyses
FlowJoBecton Dickinson & Company (BD)Version 10.7.1Analysis software
Grant Bio MPS-1 Multi Plate ShakerKeison ProductsMPS-1For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation)
HEPES Buffer Solution (1 M)ThermoFisher Scientific, Gibco15630-056
HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid.Merck, Sigma-AldrichH4034For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture
HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless SteelThermoFisher Scientific51026282For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Hula Mixer® Sample MixerThermoFisher Scientific, Life Technologies15920DVertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings.
Human Serum Albumin, 30% aqueous solutionMerck, Sigma-Aldrich12667-M
Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking SolutionBioLegend422302Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples
Innovatis CASY cell counter and analyzer TTBiovendis Products GmbHFor the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current.
KCl, Potassium chlorideMerck, Sigma-AldrichP5405Powder, BioReagent, suitable for cell culture
L-Glutamine 200 mM (100x)ThermoFisher Scientific, Gibco25030-024
MgCl2, Magessium chlorideMerck, Sigma-AldrichM2393BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubesKeison ProductsP-2-24Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini IncubatorLabnet International I5110A-230VFor the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino AcidsThermoFisher Scientific, Gibco11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody controlMerck, Sigma-AldrichPP54Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards
Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21BioLegend400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785  conjugates, respectively.
Mouse IgG1, k Isotype, clone X40Becton Dickinson & Company (BD), Horizon562438Brilliant Violet 421 conjugate.
Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1eBioscience14-4714-82Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173BioLegend400240Alexa Fluor 647 conjugate
Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11BioLegend400330 and 400355Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively
Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasmaFalcon353046For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Na2HPO4, Disodium PhosphateMerck, Sigma-AldrichS7907
NaCl, Sodium chlorideMerck, Sigma-AldrichS5886BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99%
NiSO4, Nickel(II) sulfateMerck, Sigma-Aldrich656895For saturating NTA sites; added during the blocking process
Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL StreptomycinThermoFisher Scientific, Gibco15140-122
Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterileThermoFisher Scientific, Gibco10010No Ca2+ or Mg2+ added
Polyethersulfone (PES) Filter unitThermo Scientific Nalgene UY-06730-43Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-ArBOC Ltd.11-YFor the protection of lipid stocks stored at +4 ºC.
Purified StreptavidinBioLegend280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF beadsBangs Laboratories Inc.488Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF beadsBangs Laboratories Inc.647Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20ThermoFisher Scientific, invitrogenSA1-25258Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Recombinant human IL-2Peprotech200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-GlutamineThermoFisher Scientific, Gibco31870-025
Rosette Human B Cell Enrichment CocktailSTEMCELL Technologies15064Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment CocktailSTEMCELL Technologies15022C.1
Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment CocktailSTEMCELL Technologies15361Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS.
Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment CocktailSTEMCELL Technologies15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol RedThermoFisher Scientific, Gibco11835-063For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements.
Sodium Pyruvate (100 mM)ThermoFisher Scientific, Gibco11360-070
Sprout mini centrifugeFisherScientific, Heathrow Scientific LLC120301Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes.
Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubesFalcon352058
UltraComp eBeads Compensation BeadsThermoFisher Scientific, invitrogen01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCOThermo Fisher Scientific, Invitrogen™89882

References

  1. Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling. FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).
  2. Choudhuri, K., et al. Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse. Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).
  3. Saliba, D. G., et al. Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells. elife. 8, 47528(2019).
  4. Barcia, C., et al. In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells. Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).
  5. Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).
  6. Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).
  7. Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions. Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).
  8. Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells. Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).
  9. Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
  10. Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 18 Unit 18.13 (2007).
  11. Abcam. Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2021).
  12. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  13. Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers. Frontiers in Physiology. 11, 613367(2020).
  14. Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).
  15. Céspedes, P. F., et al. Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses. bioRxiv. , (2021).
  16. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654(2017).
  17. Roederer, M. Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not. Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).
  18. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  19. Balint, S., et al. Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells. Science. 368 (6493), 897-901 (2020).
  20. Cespedes, P. F., et al. Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved