Préparation de bicouches lipidiques soutenues par des perles pour étudier la production de particules des synapses immunitaires des lymphocytes T

Résumé

Nous présentons ici le protocole pour la reconstitution par étapes de cellules synthétiques présentatrices d’antigènes à l’aide de bicouches lipidiques soutenues par des billes et leur utilisation pour interroger la sortie synaptique des cellules T activées.

Résumé

Les cellules présentatrices d’antigènes (APC) présentent trois signaux d’activation aux lymphocytes T engagés dans un contact physique : 1) l’antigène, 2) la costimulation/corépression et 3) les cytokines solubles. Les lymphocytes T libèrent deux types de particules effectrices en réponse à l’activation : les vésicules transsysylétiques (vST) et les particules d’attaque supramoléculaires, qui transfèrent respectivement des messagers intercellulaires et médient la cytotoxicité. Ces entités sont rapidement internalisées par les APC engagés dans un contact physique avec les lymphocytes T, ce qui rend leur caractérisation décourageante. Cet article présente le protocole de fabrication et d’utilisation des bicouches lipidiques supportées par des billes (BSLB) en tant que mimétiques de cellules présentatrices d’antigènes (APC) pour capturer et analyser ces particules transsynaptiques. Sont également décrits les protocoles pour les mesures absolues des densités de protéines à la surface des cellules, la reconstitution des BSLB avec de tels niveaux physiologiques et la procédure de cytométrie en flux pour suivre la libération de particules synaptiques par les cellules T. Ce protocole peut être adapté pour étudier les effets de protéines individuelles, de mélanges de ligands complexes, de déterminants de virulence pathogène et de médicaments sur la sortie effectrice des cellules T, y compris les cellules T auxiliaires, les lymphocytes T cytotoxiques, les cellules T régulatrices et les cellules T exprimant les récepteurs de l’antigène chimérique (CART).

Introduction

La synapse immunologique (IS) est une structure moléculaire pivot formée à l’interface des cellules engagées dans un contact physique qui facilite l’échange régulé d’informations sur la juxtracrine. Différents SYSTÈMES ont été décrits dans la littérature, et un nombre croissant de preuves suggère que ces centres moléculaires sont une caractéristique conservée des réseaux cellulaires. Diverses cellules immunitaires, y compris les cellules B, les cellules tueuses naturelles, les cellules dendritiques, les macrophages et les cellules T, échangent des informations via l’assemblage de contacts de courte ^durée1. Les études multiomiques font progresser la compréhension de nouveaux sous-ensembles de leucocytes et de cellules stromales conduisant des réseaux cellulaires pathogènes et exprimant des protéines de surface aux fonctions inconnues. En tant qu’APC synthétiques, les BSLEB permettent l’étude directe du rôle fonctionnel des protéines individuelles dans l’intégration des signaux activateurs, à savoir les antigènes et la costimulation/corépression, par les lymphocytes T et la libération résultante de particules effectrices appelées signal quatre.

Cet article décrit les protocoles et les points techniques critiques à prendre en compte lors de l’utilisation de BSLB pour imiter la composition de surface des APC modèles. Les protocoles pour la mesure quantitative des récepteurs immunitaires et d’autres protéines de surface sur les APC sont présentés avec le protocole pour la reconstitution des APC synthétiques contenant ces quantités mesurées. Ensuite, les étapes nécessaires à la coculture des lymphocytes T et du BSLB sont présentées avec le protocole de mesure quantitative du transfert transsynaptique de particules à l’aide de la cytométrie en flux. Plus remarquable encore, les BSLB facilitent l’étude d’une population dérivée de la membrane plasmique de tSV appelées ectosomes synaptiques (SE). Les SE enrichis en récepteurs d’antigènes des lymphocytes T (TCR⁺) sont éliminés en réponse au déclenchement du ^TCR2 et capturés efficacement par les BSLB3, ce qui représente une excellente lecture pour évaluer les propriétés agonistes des antigènes et la composition membranaire modélisée. Les exosomes CD63⁺ et les particules d’attaque supramoléculaire (SAP) sont également libérés par les lymphocytes T stimulés et capturés par les BSLB. Ils peuvent être utilisés comme lectures supplémentaires de l’activation et de la sécrétion de granules exocytaires et lytiques qui en résultent par les lymphocytes T. La mobilisation des vésicules exocytaires vers le pôle en interaction de la cellule T facilite également la libération directionnelle de cytokines, telles que l’IL-2, l’IFN-γ et l’IL-10 en réponse à l’activation4,5,6,7,8. Bien que les cytokines libérées par les lymphocytes T puissent également être détectées sur les BSLEB, une étude plus dédiée est actuellement en cours de développement pour valider l’analyse quantitative de la libération de cytokines au niveau de la synapse immunologique.

Pour interroger comment des compositions membranaires spécifiques influencent le rendement synaptique des lymphocytes T, il faut définir la densité physiologique du composant membranaire cible. Les quantifications basées sur la cytométrie en flux des protéines de surface cellulaire sont une étape essentielle de ce protocole et nécessitent : 1) l’utilisation d’anticorps avec un nombre connu de fluorochromes par anticorps (F/P), et 2) des billes de référence fournissant une référence standard pour l’interpolation des molécules de fluorochrome à partir des intensités moyennes de fluorescence (IMF) mesurées.

Ces étalons de référence se composent de cinq populations de billes, chacune contenant un nombre croissant de fluorochromes solubles équivalents (MESF), qui couvrent la plage dynamique de la détection arbitraire par fluorescence. Ces populations standard produisent des pics de fluorescence discrets, facilitant la conversion d’unités de fluorescence arbitraires en MESF par simple régression linéaire. Les MESF résultants sont ensuite utilisés avec les valeurs f/P des anticorps pour calculer le nombre moyen de molécules liées par cellule (ou BSLB dans les étapes ultérieures). L’application de surfaces cellulaires estimées au nombre moyen de molécules détectées permet alors le calcul de densités physiologiques sous forme de molécules/^μm2. Ce protocole de quantification peut également être adapté à la mesure des densités protéiques sur les lymphocytes T et à la reconstitution biochimique des compositions membranaires médiant la formation de synapses homotypiques des lymphocytes T (c.-à-d. synapses T-T9). Si nécessaire, la valence de la liaison aux anticorps peut être davantage estimée en utilisant des cibles recombinantes marquées avec un nombre connu de fluorochromes par molécule. Ensuite, la valence de liaison aux anticorps peut être calculée pour la même population BSLB en comparant simultanément le nombre de protéines fluorescentes liées et d’anticorps de quantification (en utilisant deux fluorochromes de quantification différents et des normes MESF).

La reconstitution des membranes APC nécessite l’assemblage de bicouches lipidiques supportées (SLB) sur des billes de ^silice1. Les stocks de liposomes contenant différentes espèces de phospholipides peuvent être exploités pour former une matrice lipido-bicouche polyvalente, permettant l’ancrage de protéines recombinantes avec une chimie de liaison différente (la préparation des liposomes est détaillée en ¹⁰). Une fois que la densité physiologique (ou les densités) du ligand pertinent « sur les cellules » est définie, le même protocole de cytométrie en flux est adapté pour estimer la concentration de protéine recombinante nécessaire pour recouvrir les BSLB de la densité physiologique cible. Deux systèmes d’ancrage différents peuvent être utilisés en combinaison ou séparément.

Tout d’abord, le SLB contenant un dernier 12,5 mol% de phospholipides contenant du ^Ni2+ est suffisant pour fournir environ 10 000 sites de liaison His-tag par micron ^carré10 et fonctionne bien pour décorer les BSLB avec la plupart des protéines disponibles dans le commerce dont les densités physiologiques ne dépassent pas cette capacité de charge maximale. Le deuxième système de chargement exploite les phospholipides contenant de la biotine (en mol%) pour charger des anti-CD3e Fab biotinylés (ou monomères HLA/MHC) via des ponts streptavidines. La combinaison de ces deux méthodes de décoration BSLB permet ensuite la personnalisation flexible des BSLB en tant qu’APC synthétiques. Pour les compositions de surface APC très complexes, le mol% de phospholipides et de protéines peut être augmenté pour charger autant de protéines que la question en question l’exige. Une fois que les concentrations de travail des protéines et mol% des phospholipides biotinylés sont définies, les BSLB peuvent être assemblés pour interroger la sortie synaptique des lymphocytes T avec cytométrie en flux multiparamétrique.

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Protocole

1. Mesure des densités de protéines de surface cellulaire par cytométrie quantitative en flux

1. Préparer un tampon de cytométrie en flux humain (hFCB) filtré à 0,22 μm en ajoutant de l’EDTA (à une concentration finale de 2 mM) et du sérum AB humain (jusqu’à un final de 10 %) à une solution saline tamponnée stérile au phosphate (PBS), pH 7,4 (voir le tableau 1). Filtrer la solution à l’aide d’un filtre à pores de 0,22 μm pour éliminer les impuretés sériques et conserver à 4 °C.
2. Récupérer les cellules et les sédimenter par centrifugation à 300 × g pendant 5 min à température ambiante (RT).
3. Lavez les cellules deux fois avec PBS. À chaque étape de lavage, remettre en suspension les cellules dans PBS au volume d’origine (avant centrifugation) et tourner vers le bas à 300 × g pendant 5 min à TA.
4. Compter les suspensions de cellules colorées en bleu de trypan dans un ^{hémocytomètre11}. Vous pouvez également compter les cellules en utilisant l’exclusion du courant électrique. Pour ce dernier, suivez les instructions du fabricant CASY-TT (voir la Table des matériaux).
   REMARQUE: Le compteur de cellules CASY-TT permet de déterminer le pourcentage de cellules viables, la taille des cellules et le volume cellulaire.
5. Calculer le volume de PBS contenant une dilution de 1:1 000 du colorant de viabilité fixable eFluor 780 ou similaire (voir le tableau des matériaux) nécessaire pour remettre les cellules en suspension à une concentration de coloration de 107 cellules/mL.
6. Remettre en suspension les cellules à l’aide de la solution de colorant de viabilité-PBS et incuber sur de la glace pendant 30 min.
7. Retirez le colorant de viabilité en ajoutant un volume de hFCB glacé. Tourner vers le bas à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
   REMARQUE: À partir de maintenant, gardez la chaîne du froid ininterrompue.
8. Laver les cellules avec du hFCB contenant une dilution de 1:50 de la solution bloquante du récepteur Fc (voir le tableau des matériaux). Porter le volume à une concentration finale de ¹⁰⁷ cellules/mL et incuber pendant 15 minutes supplémentaires pour obtenir un blocage Efficace du FcgR.
9. Répartir 100 μL de la suspension cellulaire (c.-à-d. ¹⁰⁶ cellules) par puits d’une plaque de 96 puits à fond en U ou à fond en V. Gardez les cellules sur la glace et à l’abri de la lumière (recouvrir de papier d’aluminium).
10. Préparez un mélange maître d’anticorps dans le hFCB en définissant les concentrations optimales d’anticorps pour chaque anticorps conjugué au fluorochrome et, surtout, pour les anticorps utilisés pour déterminer les densités de protéines de surface. Par exemple, pour quantifier l’expression de l’ICAM-1 sur les populations de cellules amygdales, comme le montre la figure 1, préparer un mélange contenant 1:200 dilutions d’anti-CD4, d’anti-CD19 et d’anti-CXCR5 ainsi que des concentrations saturantes d’un anticorps anti-ICAM-1 avec des fluorochromes AF647 connus par anticorps (c.-à-d. 10 μg/mL, qui a été défini par des expériences indépendantes de titrage d’anticorps).
11. Comme témoins supplémentaires, préparer un mélange maître d’anticorps contenant les témoins d’isotype d’anticorps pertinents (aux mêmes concentrations efficaces que leurs homologues conjugués avec les mêmes fluorochromes pour la soustraction de fond), c’est-à-dire utiliser 10 μg/mL d’un témoin d’isotype AF647 pertinent.
    REMARQUE: Dans l’exemple ci-dessus, un tel contrôle d’isotype est utilisé pour soustraire la fluorescence de fond du véritable signal ICAM-1 sur les cellules.
12. Lors de la quantification des densités protéiques sur des sous-ensembles cellulaires présents à basse fréquence dans les tissus, préparer des témoins de fluorescence moins un (FMO) contenant tous les anticorps colorants à l’exception des marqueurs d’intérêt (voir plus de détails dans ¹²).
13. Faire tourner la plaque de 96 puits contenant les cellules à 300 × g pendant 5 min à 4 °C, jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 50 μL du mélange maître d’anticorps de quantification ou du mélange maître d’anticorps isotypes.
14. Incuber les cellules pendant au moins 30 min à 4 °C et 400 tr/min à l’aide d’un agitateur à plaques. Protégez les plaques de la lumière (couvercle avec du papier d’aluminium).
15. Lavez les cellules trois fois à l’aide de hFCB et centrifugez à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
16. Remettre en suspension la pastille cellulaire à l’aide de 200 μL de PBS (c.-à-d. jusqu’à une concentration finale de 5 × ¹⁰⁶ cellules/mL).
17. Pour l’acquisition :
    1. Si vous utilisez un chargeur BD FACS standard, transférez les échantillons dans des tubes à fond rond en polystyrène de 5 mL (voir la table des matériaux).
    2. Si vous utilisez des échantillonneurs à haut débit (HTS, également appelés lecteurs de plaques), passez immédiatement à l’étape 1.19.
18. Avant de procéder à l’acquisition de données pour les normes MESF, vérifiez les limites maximales et minimales de linéarité de l’intensité de fluorescence pour les canaux de quantification.
19. Avant la compensation, acquérez des données pour les normes MESF, en veillant à ce que les populations les plus faibles et les plus lumineuses se situent dans la plage linéaire de mesure.
20. Acquérir les échantillons de compensation. Conservez inchangées les valeurs de tension du tube photomultiplicateur (PMT) pour les canaux de quantification afin de préserver la plage dynamique de détection. Effectuez de légers ajustements de la tension PMT des autres canaux avant de calculer les matrices de compensation.
21. Calculer et appliquer la rémunération.
22. Acquérir et économiser un minimum de 2 × ¹⁰⁴ perles MESF au total pour chacun des canaux de quantification.
23. Sélectionner la population de cellules individuelles en fonction de leurs zones de diffusion de la lumière latérale et avant (SSC-A et FSC-A, respectivement, comme le montre la figure 1A (i)), suivie de la sélection des événements à l’intérieur du continuum temporel (figure 1A (ii)) et faible pour le temps de vol (W) dans FSC et SSC par rapport à leurs hauteurs (c.-à-d. FSC-W/FSC-H, suivi du contrôle SSC-W/SSC-H, comme le montrent respectivement les figures 1A iii) et iv). Définir une porte d’événement unique finale contenant des événements avec une distribution proportionnelle FSC-A par rapport à FSC-H (Figure 1A (v)).
24. Acquérir des échantillons de contrôle (contrôles étiquetés Isotype et FMO).
25. Acquérir des échantillons et enregistrer jusqu’à ce qu’un minimum de 10 000 cellules cibles aient été acquises.
    REMARQUE: la détermination robuste des densités moléculaires moyennes nécessite l’analyse de plusieurs donneurs à travers des expériences indépendantes. Ceci est crucial lors de l’analyse de sous-ensembles cellulaires trouvés dans des fréquences réduites ou dérivés de matériel biologique rare (par exemple, de biopsies de tissus humains).
26. Lavez le cytomètre pendant 5 min avec une solution de nettoyage FACS suivie de 5 min d’eau ultrapure avant d’éteindre l’instrument. Si vous utilisez le HTS, suivez les options sous l’onglet HTS et Clean Plate programme.
    REMARQUE: Pour réduire le transfert d’échantillon à échantillon, activez les options de rinçage assis (échantillonneur) ou de lavage d’échantillonneur à haut débit , qui lavent automatiquement le cytomètre entre les tubes ou les puits. Avant de commencer l’acquisition, faites couler de l’eau ultrapure pendant 10 minutes à un débit élevé pour éliminer tout contaminant biologique non lavé de la ligne d’échantillonnage du cytomètre.
27. Exportez les fichiers FCS (Flow Cytometry Standard).

2. MesF surcorrigé les analyses de régression de l’intensité de fluorescence moyenne (ou médiane)

1. Ouvrez le logiciel d’analyse de cytométrie en flux et chargez les fichiers FCS de l’expérience. Sélectionnez la population de perles en fonction de leurs zones de diffusion de la lumière latérales et avant (SSC-A par rapport à FSC-A), comme le montre la figure 1A (i).
2. Contrôler la qualité des données en vérifiant la distribution des événements individuels dans le temps, comme indiqué à l’étape 1.24.
   REMARQUE: Les bulles créent des lacunes dans la distribution des événements au fil du temps; cela apparaît généralement au début de l’acquisition à l’aide du HTS. Évitez de sélectionner des événements flanquant des intervalles dans le temps d’acquisition, car ils ajoutent des erreurs de mesure dues à des aberrations optiques.
3. Concentrez-vous sur les événements individuels.
   1. Cellules
      1. Identifier d’abord les cellules individuelles en fonction de leur distribution SSC-A et FSC-A (Figure 1A (i)), suivie des événements faibles pour W dans les portes séquentielles FSC-W/FSC-H (singlets-1, panneau Figure 1A (iii)) et SSC-W/SSC-H (singlets-2; Figure 1Un panneau (iv)). Définissez une porte singlets-3 supplémentaire en sélectionnant des événements avec FSC-A et FSC-H proportionnels (Figure 1A, panneau (v)). Enfin, identifiez les cellules vivantes comme étant négatives pour le colorant réparable de viabilité.
   2. Perles MESF
      1. Suivez la même discrimination singlets-1 à singlets-3 qu’à l’étape 2.3.1.1 (Figure 1B, panneaux (i) à (v)). Identifier chacune des populations MESF (vierge, 1, 2, 3 et 4) en fonction de leurs niveaux d’intensité de fluorescence (voir figure 1B, panneau (vi)).
4. Extraire l’IFM des fractions MESF vierges et 1 à 4.
5. Générez des valeurs MFI corrigées (cMFI) pour les fractions MESF 1 à 4 en soustrayant les IFM de la population de billes vierges de chaque fraction.
6. Calculez la ligne la mieux adaptée à la relation entre les cMFI et les valeurs MESF fournies par le fournisseur (variable indépendante, fraction vide égale à zéro).
7. Extraire la pente (b dans l’équation ci-dessous) de la régression linéaire de MESF sur cMFI (le panneau de la figure 1B (viii) montre une régression dans laquelle y = a + bx; avec a = 0).
8. Extraire les intensités de fluorescence médianes (pour les distributions de fluorescence bimodales) ou moyennes (pour les distributions de fluorescence normales ou log-normales) des populations d’intérêt (cellules TFH et B dans le panneau figure 1A (vii)).
9. Comme aux étapes 2.5 à 2.7, extraire les valeurs DMMI des cellules témoins marquées par isotype.
10. Si le F/P des contrôles d’isotype est le même que celui des anticorps de quantification, corrigez les IFM des cellules colorées en soustrayant les IFM des cellules marquées à l’isotype.
11. Si le F/P des isotypes diffère de ceux des anticorps de quantification, extraire le MESF des isotypes en divisant les IMF des cellules marquées par isotype avec la pente calculée à l’étape 2.7. Soustraire l’isotype MESF de la quantification MESF avant d’estimer les anticorps de quantification liés.
12. Diviser le MESF par le F/P des anticorps de quantification pour estimer le nombre de molécules liées par cellule (Molec. _comme le montre l’organigramme de la figure 1C).
13. Divisez le nombre de molécules liées avec la surface cellulaire estimée (CSA (^μm2)) pour extraire la densité des protéines sous forme de molec./^μm2 (Figure 1C). Reportez-vous à la section des résultats représentatifs pour plus de détails.

3. Espèces de phospholipides fonctionnels à utiliser dans l’étalonnage des protéines enrobant les BSLB

1. Utilisez 0,4 mM de DOPC (1,2-dioléoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) comme composant principal de la matrice lipidique formant la bicouche lipidique supportée. Diluer toutes les autres espèces de lipides dans cette solution de DOPC.
2. Utiliser entre 0,2 et 1 mol % de 0,4 mM de DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine) conjugué à des colorants, dont ATTO 390, 488 ou 565 (voir la Table des matériaux), pour générer des BSLB à fluorescence intrinsèque.
   REMARQUE: La fluorescence intrinsèque des BSLEB facilite l’identification des BSLEB uniques et des cellules uniques dans les expériences de transfert synaptique.
3. Utiliser 12,5 mol% de 0,4 mM DGS-NTA(Ni) (acide 1,2-dioléoyl-sn-glycero-3-[(acide iminodiacétique N-(5-amino-1-carboxypentyl)) pour ancrer les protéines marquées His. Gardez le mol% de DGS-NTA(Ni) constant et effectuez des titrages 2 fois plus élevés des protéines marquées His en commençant par 100 nM comme concentration la plus élevée. Laissez une condition sans protéine comme contrôle négatif pour les quantifications absolues.
   REMARQUE: Les signaux accessoires et les molécules d’adhésion, tels que ICAM-1, sont conçus avec une étiquette 12-His pour augmenter l’affinité de la protéine pour DGS-NTA(Ni).
4. Utilisez Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) pour ancrer les protéines biotinylées via les ponts biotine-streptavidine-biotine. Utilisez un titrage en série 5 fois de 0,4 mM biotinyl cap PE couvrant entre 10 mol% et 0 mol% (comme contrôle négatif). Maintenir la concentration de streptavidine et de protéines biotinylées constante (200 nM) dans les expériences d’étalonnage et la reconstitution d’APC synthétiques pour les expériences de transfert synaptique.
   NOTE: Les analyses de régression des densités empiriques de protéines biotinylées sur le mol% final de Biotinyl Cap PE dans la matrice lipidique (contenant également DGS-NTA(Ni) pour ancrer les protéines marquées His) définiront le mol% à utiliser pour reconstituer les densités cibles de l’antigène.

4. Préparation d’une solution saline tamponnée HEPES supplémentée contenant 1% d’albumine sérique

REMARQUE : Une solution saline tamponnée HEPES complétée contenant 1 % d’albumine sérique humaine (HBS/HSA) ou 1 % d’albumine sérique bovine (HBS/BSA) est nécessaire aux étapes de lavage et de chargement en protéines des BSLEB (tableau 1). Préparer une solution mère HBS 10x et le tampon de travail aussi frais que possible; conserver au réfrigérateur et utiliser dans un délai d’un mois. Bien que le BSA soit une alternative moins chère au HSA, il offre un blocage efficace des lipides ni-chélatants13 et est recommandé pour les expériences à haut débit.

1. Préparer une solution tampon mère 10x de HBS supplémenté contenant 200 mM HEPES, 7 mM _Na2HPO4, 1400 mM NaCl, 50 mM KCl, 60 mM de glucose, 10 mM _CaCl2 et 20 mM _MgCl2.
   REMARQUE: La dissolution de _MgCl2 est très exothermique et présente un risque de brûlure. Ajouter ce sel lentement et sur un grand volume de solvant. Évitez de préparer des solutions concentrées (c.-à-d. 1 M) de ces sels, car ils ont tendance à précipiter avec le temps, ce qui rend difficile leur ajout précis au tampon de travail.
2. Filtrer la solution 10x à l’aide d’une unité de filtration de 0,22 μm et la garder stérile à 4 °C.
3. Pour 500 mL de HBS/has, prendre 50 mL de la solution 10x HBS supplémentée, ajuster le pH à 7,4 si nécessaire et augmenter le volume à 483,4 mL avec de l’eau ultrapure.
4. Ajouter 16,6 mL de solution de HSA à 30 % aux 483,4 mL de HBS, pH 7,4.
5. Pour 500 mL de HBS/BSA, dissoudre 5 g de BSA dans HBS et incuber à 37 °C pendant 30 min. Ensuite, mélangez doucement à RT en inversant périodiquement le flacon jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de cristaux de protéines ou d’amas visibles.
6. Filtrer la solution résultante de l’étape 4.5 à l’aide d’une unité de filtration de 0,22 μm (voir le tableau des matériaux) et la stocker à 4 °C.

5. Étalonnages de la densité protéique sur les BSLB

1. Avant de prendre les billes de silice non fonctionnalisées de 5,00 ±0,05 μm de diamètre, mélangez bien la solution mère et remettez en suspension les gros amas de perles sédimentés au fond des flacons.
   REMARQUE: Les billes de silice ont tendance à sédimenter rapidement, ce qui peut entraîner des erreurs de comptage. Mélanger vigoureusement en pipetant de haut en bas la moitié du volume maximal d’une micropipette P1000.
2. Diluer 1 μL de solution de billes dans 1 000 μL de PBS, compter les billes à l’aide d’une chambre hémocytométrique et calculer leur concentration par mL.
   REMARQUE: La coloration bleu trypan n’est pas nécessaire pour visualiser les billes de silice.
3. Calculer le volume de billes de silice nécessaire pour 5 × ¹⁰⁵ BSLB finaux par point de titrage.
4. Transférer le volume requis de billes de silice dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL.
5. Lavez les billes de silice trois fois avec 1 mL de PBS stérile, centrifugez les billes pendant 15 s sur une microcentrifugeuse de paillasse à RT (à régime fixe).
   REMARQUE: Lorsque vous retirez la solution de lavage, évitez de déranger la pastille de perle. Une petite colonne tampon n’affectera pas la propagation des liposomes composant le mélange maître de liposomes car ceux-ci sont également dans PBS.
6. Préparer trois volumes du mélange maître de liposomes pour assembler le BSLB sur les billes de silice lavées (par exemple, si le volume total initial des billes de silice est de 20 μL, préparer un minimum de 60 μL du mélange maître de liposomes).
7. Pour les titrages Biotinyl Cap PE mol%
   1. Préparez les mélanges maîtres lipidiques contenant 5 fois les dilutions de Biotinyl Cap PE.
      1. Diluer le Biotinyl Cap PE mol% de 0,4 mM dans une matrice DOPC à 100 %.
      2. Mélanger chaque point de titrage Biotinyl Cap PE mol% à un rapport 1:1 (vol:vol) avec une solution de 0,4 mM 25% DGS-NTA(Ni) de sorte qu’un dernier 12,5 mol% de lipides contenant du Ni est présent dans tous les titrages.
         REMARQUE: Les 12,5 mol% (vol: vol%) de lipides contenant du Ni représentent la composition lipidique mixte des BSLB sur laquelle les protéines marquées His peuvent également être testées dans des étalonnages parallèles. Par exemple, puisque tous les stocks de liposomes sont préparés à la même concentration molaire, pour atteindre le mélange cible en mol% dans 200 μL de mélange final de liposomes, il suffit de mélanger 100 μL de 25 mol% de DGS-NTA contenant du Ni avec 100 μL de 100 mol% de DOPC.
   2. Transférer 5 × ¹⁰⁵ billes de silice lavées dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL, de sorte qu’un point de titrage Biotinyl Cap PE mol% soit assemblé par tube.
   3. Ajouter les mélanges maîtres de titrage Biotinyl Cap PE mol% aux billes de silice lavées et mélanger doucement en pipetant de haut en bas la moitié du volume total. Évitez de former des bulles qui, en excès, détruisent la bicouche lipidique.
   4. Ajouter de l’argon (ou de l’azote) gazeux sur le tube contenant les BSLB en formation actuelle pour déplacer l’air et protéger les lipides de l’oxydation pendant le mélange.
   5. Ajouter de l’argon aux stocks lipidiques de 0,4 mM avant le stockage et manipuler à l’aide d’une technique stérile.
      REMARQUE: Connectez un petit tuyau à la bouteille de gaz argon / azote. Avant d’ajouter du gaz aux tubes, ajustez le régulateur de la bouteille de gaz de sorte que la pression ne dépasse pas 2 psi. Connectez une pointe de pipette stérile au tuyau de sortie pour diriger le flux de gaz à l’intérieur du stock de liposomes pendant 5 s et fermez rapidement le couvercle. Dans le cas des stocks lipidiques, sceller le couvercle du tube avec un film de paraffine avant de le stocker à 4 °C.
   6. Déplacez les BSLB vers un mélangeur de laboratoire vertical à angle variable (voir le tableau des matériaux) et mélangez pendant 30 minutes à RT en utilisant un mélange orbital de 10 tr / min.
      REMARQUE: Cette étape empêchera la sédimentation des perles lors de la formation de la bicouche lipidique supportée.
   7. Faites tourner les billes en centrifugant pendant 15 s à RT sur une minicentrifugeuse de paillasse, puis lavez trois fois avec 1 mL de HBS/HSA (BSA) pour éliminer l’excès de liposomes.
   8. Bloquer les BSLEB formés en ajoutant 1 mL de caséine à 5 % ou 5 % de BSA contenant 100 μM de NiSO4 pour saturer les sites de NTA et 200 nM de streptavidine pour recouvrir uniformément tous les sites d’ancrage de la biotine sur les BSLB. Mélanger doucement en pipetant vers le haut et vers le bas la moitié du volume total et incuber dans le mélangeur vertical pendant 20 minutes au maximum à RT et 10 tr/min.
   9. Faites tourner les BSLB en centrifugant pendant 15 s à RT sur une minicentrifugeuse de paillasse, puis lavez trois fois avec 1 mL de tampon HBS/HSA (BSA).
      REMARQUE: Gardez les perles lavées verticalement avec un petit volume de tampon de lavage recouvrant les BSLEB. Évitez la déshydratation des BSLEB car l’air détruira la bicouche lipidique.
8. Pour le titrage des protéines marquées His sur 12,5 mol% de BSLB contenant du DGS-(Ni) NTA
   1. Préparer trois volumes de mélange maître de liposomes contenant un dernier 12,5 mol% de DGS-NTA(Ni).
   2. Utilisez le mélange maître de liposomes pour remettre en suspension les billes de silice lavées et mélangez doucement en pipetant la moitié du volume total. Évitez de former des bulles qui endommagent excessivement la bicouche lipidique.
   3. Ajouter de l’argon (ou de l’azote) gazeux sur le tube contenant les BSLB en formation actuelle pour déplacer l’air et protéger les lipides de l’oxydation pendant le mélange.
   4. Ajouter de l’argon aux stocks lipidiques de 0,4 mM avant le stockage et manipuler à l’aide d’une technique stérile.
   5. Déplacez les BSLB vers le mélangeur vertical et mélangez pendant 30 min à RT en utilisant le mélange orbital à 10 tr/min.
   6. Faites tourner les billes en centrifugant pendant 15 s à RT sur une minicentrifugeuse de paillasse, puis lavez trois fois avec 1 mL de HBS/HSA (BSA) pour éliminer l’excès de liposomes.
   7. Bloquer les BSLEB formés en ajoutant 1 mL de caséine à 5 % (ou 5 % de BSA) contenant 100 μM de NiSO4 pour saturer les sites de NTA sur les BSLB. Mélanger doucement et incuber dans le mélangeur vertical pendant 20 min au maximum à RT et 10 tr/min.
   8. Laver trois fois à l’aide de HBS/HSA (BSA) pour éliminer l’excès de solution bloquante.
   9. Dans une nouvelle plaque de 96 puits à fond en U, préparez 2 fois les dilutions en série des protéines.
      1. Préparer une concentration initiale de 100 nM pour la protéine d’intérêt dans un volume total de 200 μL de tampon HBS/HSA (BSA), distribuer 100 μL de cette solution dans la première colonne et les 100 μL restants sur le dessus de la colonne #2 contenant 100 μL de tampon HBS/HSA (BSA).
      2. Continuez en transférant en série 100 μL de la colonne #2 à la colonne #3 et répétez si nécessaire pour couvrir tous les points de titrage. Laissez la dernière colonne de la série sans protéine, car elle sera utilisée comme référence vide pour la quantification.
   10. Remettre en suspension les BSLEB préparés dans un volume tel que 5 × ¹⁰⁵ BSLB soient contenus dans 100 μL de tampon HBS/HSA (BSA).
   11. Transférer 100 μL de la suspension BSLB vers les puits d’une deuxième plaque de 96 puits à fond U, de sorte que chaque puits reçoive 5 × ¹⁰⁵ BSLB.
   12. Faites tourner la deuxième plaque contenant des BSLB pendant 2 min à 300 × g et RT et jetez le surnageant.
   13. Transférer les volumes de 100 μL de la plaque de titrage des protéines vers la plaque contenant les BSLB sédimentés. Mélanger doucement, éviter la génération excessive de bulles lors du pipetage et incuber pendant 30 min à RT et 1 000 tr/min à l’aide d’un agitateur à plaques. Protéger de la lumière avec du papier d’aluminium.
   14. Lavez la plaque trois fois avec un tampon HBS/HSA (BSA) en utilisant des étapes de sédimentation de 300 × g pendant 2 min à TA.
   15. Si la protéine recombinante utilisée dans l’étalonnage est directement conjuguée aux fluorochromes et a des valeurs F/P connues, passez à l’étape 5.8.20.
   16. Si la protéine recombinante utilisée dans l’étalonnage n’est pas marquée ou conjuguée à des fluorochromes ou si aucun étalon de billes MESF n’est disponible, utilisez des anticorps conjugués Alexa Fluor 488 ou 647 avec des valeurs F / P connues pour colorer le BSLB enrobé de protéines.
   17. Coloration avec des concentrations saturantes d’anticorps de quantification.
       REMARQUE: Selon le niveau d’expression cible, ceux-ci varient entre 5 et 10 μg / mL.
   18. Tache pendant 30 min à RT et 1 000 tr/min à l’aide d’un agitateur à plaques. Protéger de la lumière à l’aide d’une feuille d’aluminium.
   19. Laver deux fois avec un tampon HBS/HSA (BSA) et une fois avec du PBS en utilisant des étapes de sédimentation de 300 × g pendant 2 min à TA.
       REMARQUE: Utilisez PBS, pH 7,4 pour remettre en suspension les BSLB lavés avant l’acquisition. N’utilisez pas de tampons contenant des protéines, car cela conduit à la formation de bulles lors du mélange automatique d’échantillons avec des échantillonneurs à haut débit.
   20. Acquérir les normes MESF, en s’assurant que les pics les plus brillants restent dans la plage de détection linéaire du détecteur de quantification (canal), comme le montre la figure 1B (vii).
   21. Acquérir les échantillons manuellement ou à l’aide de HTS. Si vous utilisez ces derniers, remettez en suspension les BSLEB dans 100 μL de PBS et acquérez 80 μL en utilisant un débit compris entre 2,5 et 3,0 μL/s, un volume de mélange de 100 μL (ou 50 % du volume total si le volume de remise en suspension est inférieur), une vitesse de mélange de 150 μL/s et cinq mélanges pour s’assurer que les BSLE sont monodispersés.
   22. Exportez les fichiers FCS.
   23. Concentrez-vous sur des événements uniques pour les analyses (Figure 2A), car les doublets ou les triplets introduiront une erreur dans la détermination. Utilisez l’identification imbriquée d’événements uniques comme indiqué à l’étape 1.2.3 du protocole.
   24. Mesurer l’IFM de chaque fraction MESF (1-4) et soustraire l’IFM des billes vierges pour en extraire les IFM corrigées (IFM).
   25. Effectuer une analyse de régression linéaire pour extraire la pente (b) du MESF sur l’IFM cM calculée pour les normes MESF, qui sera utilisée à l’étape 5.33.
   26. Extraire l’IFM de chaque point de titrage et soustraire l’IFM des billes sans protéine pour obtenir des CFI.
   27. Divisez les cFIM avec la pente calculée à l’étape 5.31 pour extraire le MESF lié aux BSLEB pour chaque point de titrage.
   28. Diviser mesF lié aux BSLB par la valeur F/P de l’anticorps de quantification pour extraire le nombre moyen de molécules liées par BSLB.
   29. En utilisant le diamètre des BSLB (5,00 ± 0,05 μm), extraire la surface de la bille (SA = ^4pr2) pour calculer les densités finales de protéines (molec./^μm2) par point de titrage (concentration en protéines).
   30. Effectuer une nouvelle analyse de régression de la concentration en protéines par rapport à la densité protéique pour calculer la pente (b) de la ligne la mieux ajustée.
       NOTE: La concentration de 12,5 mol% de DGS-NTA(Ni) confère une capacité d’ancrage maximale d’environ 10 000 molec./^μm210 sans induire l’activation non spécifique des lymphocytes T ni affecter la mobilité latérale des SLB.

6. Réalisation d’expériences de transfert synaptique entre les lymphocytes T et les BSLB

1. Avant d’exécuter l’expérience de transfert synaptique
   1. Acquérir des BSLB non fluorescents, des BSLEB avec des lipides fluorescents, des cellules non colorées (ou des perles de compensation; voir la table des matériaux) et des cellules colorées d’une seule couleur (ou des perles de compensation) pour identifier les interactions du spectre de fluorescence de l’instrument. Concentrez-vous sur les détecteurs à fort débordement pour redessiner le panneau polychromatique, augmenter la sensibilité et réduire l’erreur de mesure sur les détecteurs critiques (voir ¹⁴).
   2. Titrer les anticorps de détection pour trouver la concentration optimale, permettant la détection des événements positifs sans compromettre la détection des négatifs.
      REMARQUE: Répétez cette étape chaque fois qu’il y a un changement de lot d’anticorps car les valeurs F / P et la luminosité varient d’un lot à l’autre.
   3. Facultatif : Optimisez les tensions PMT en acquérant l’échantillon à différentes plages de tension (c.-à-d. une tension marche) pour trouver les PMT conduisant à un signal optimal sur le bruit (c.-à-d. séparation des négatifs et des positifs tout en s’assurant que le signal de la population la plus brillante reste dans la plage linéaire).
2. Mesure du transfert de sortie des lymphocytes T vers les BSLB
   1. Préparer le RPMI 1640 supplémenté (ici milieu R10) contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur, 100 μM d’acides aminés non essentiels, 10 mM d’HEPES, 2 mM de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Utilisez le milieu R10 pour cultiver et développer les lymphocytes T.
   2. Le jour 1, isolez les lymphocytes T des chambres du sang périphérique ou du système de leucoréduction (LRS). Utilisez des trousses d’isolement et de séparation des cellules d’immunodensité (voir la Table des matériaux) pour l’enrichissement des lymphocytes T CD4⁺ et CD8⁺ humains.
   3. Ensemencer les cellules à une concentration finale comprise entre 1,5 et 2,0 × ¹⁰⁶ cellules/mL, à l’aide de plaques à 6 puits ne dépassant pas 5 mL au total par puits.
   4. Activer les lymphocytes T à l’aide d’un rapport de 1:1 de billes magnétiques d’activation des lymphocytes T humains (anti-CD3/anti-CD28) (voir la Table des matériaux) et ajouter 100 UI d’IL-2 humaine recombinante pour soutenir la prolifération et la survie des cellules.
   5. Le jour 3, retirez les billes magnétiques actives à l’aide de colonnes magnétiques (voir le Tableau des matériaux). Assurez-vous que les billes magnétiques restent attachées sur les côtés du tube avant de récupérer les cellules pour des étapes de lavage supplémentaires.
   6. Lavez à nouveau les billes magnétiques avec 5 mL de milieu R10 frais, mélangez bien et remettez-les dans l’aimant. Récupérez ce volume et mélangez-le avec les cellules récupérées à l’étape 6.2.5.
   7. Remettre les cellules à 1,5-2 × ¹⁰⁶ cellules/mL dans du R10 frais contenant 100 U/mL d’IL-2. Reconstituer le milieu après 48 h, en s’assurant que le dernier ajout d’IL-2 est de 48 h avant le jour de l’expérimentation (jours 7 à 14 de culture).
   8. Le jour de l’expérience de transfert synaptique, préparer le milieu du test de transfert synaptique (voir tableau 1) en complétant le milieu RPMI 1640 sans phénol rouge avec 10 % de FBS, 100 μM d’acides aminés non essentiels, 2 mM de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Ne pas inclure l’IL-2 humaine recombinante.
   9. Compter les cellules en utilisant soit la coloration bleu trypan ou l’exclusion du courant électrique et les remettre en suspension à une concentration finale de 2,5 × ¹⁰⁶ cellules/mL dans le milieu. Si une mort cellulaire excessive est observée (>10 %), éliminer les cellules mortes/mourantes à l’aide d’un mélange de polysaccharide et de diatrizoate de sodium (voir la Table des matériaux) comme suit :
      1. Couche de 15 mL de culture cellulaire sur 13 mL de la solution de diatrizoate de polysaccharide-sodium.
      2. Centrifugeuse de 1 250 × g pendant 20 min à RT avec un minimum d’accélération et de désaccélération. Recueillir la couche cellulaire (nuage) dans l’interface entre le milieu et la solution de diatrizoate de polysaccharide-sodium.
      3. Lavez les cellules au moins deux fois avec un milieu de test de transfert synaptique préavertissé (préparé à l’étape 6.2.7).
      4. Compter et remettre en suspension les cellules à une concentration finale de 2,5 × ¹⁰⁶/mL à l’aide d’un milieu de dosage synaptique. Coculture 100 μL de cette suspension cellulaire avec des BSLEB (voir étape 6.2.15).
   10. Calculer le nombre de BSLB nécessaires à l’expérience; considérez tous les différents mélanges maîtres de protéines et titrages d’antigènes à tester (soit des monomères de peptides HLA/MHC biotinylés, soit des monomères monobiotinylés anti-CD3ε Fab).
   11. Assemblez les BSLEB en suivant les mêmes étapes de la section 5 du protocole, mais cette fois, combinez tous les titrages de protéines et de lipides nécessaires à la reconstitution d’une membrane APC complexe (Figure 3A). Gardez les mêmes relations vol: vol entre le volume initial des billes de silice et le volume de mélange de protéines utilisé lors des étalonnages, ainsi que les temps et les températures utilisés dans le chargement des BSLB. Par exemple, si 0,5 μL de billes de silice/puits et 100 μL/puits de mélange de protéines ont été utilisés pour l’étalonnage initial, maintenir des rapports vol:000 vol:vol pour préparer les BSLEB à coculturer avec des lymphocytes T.
   12. Une fois que les BSLEB ont été chargés avec le mélange de protéines d’intérêt, lavez les BSLB deux fois avec HBS/HSA (BSA) pour éliminer l’excès de protéines non liées. Utilisez des vitesses de sédimentation de 300 × g pendant 2 min à TA à chaque étape de lavage et jetez les surnageants.
   13. Remettre en suspension les 5 × ¹⁰⁵ BSLB par puits dans 200 μL.
   14. Transférer 100 μL par puits vers une nouvelle plaque de 96 puits à fond en U pour en faire un double, de sorte que la quantité finale de BSLB par puits soit de 2,5 × ¹⁰⁵.
   15. Faites tourner les BSLB à 300 × g pendant 2 min et RT et jetez le surnageant.
   16. Remettre en suspension les BSLB en utilisant 100 μL de suspension de lymphocytes T; mélanger doucement pour éviter la formation de bulles.
   17. Incuber les cocultures pendant 90 min à 37 °C.
       REMARQUE: Alternativement, les cellules et les billes peuvent être remises en suspension dans un tampon HBS / HSA (BSA) au lieu de RPMI sans phénol-rouge pour la coculture. Dans ce cas, l’incubation doit être effectuée dans un incubateur sans _CO2 car ce gaz va rapidement acidifier le tampon en l’absence de bicarbonate.
   18. Refroidir les cocultures de cellules BSLB-T en incubant d’abord les cellules à RT pendant au moins 15 min. Protégez-les de la lumière.
   19. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 × g et RT; jeter le surnageant.
   20. Remettre les cellules en RT 2% BSA-PBS (sans ^Ca2+ et ^Mg2+) pour les bloquer. Placez les cellules sur de la glace pendant 45 min. Protéger de la lumière.
   21. Pendant l’incubation des cellules, préparez le mélange maître d’anticorps en utilisant du BSA glacé filtré à 0,22 μm et filtré à 2% dans le PBS comme tampon de coloration, ce qui fournira un blocage supplémentaire.
       REMARQUE: Certains lots d’anticorps conjugués à des colorants Brilliant Violet ont tendance à se lier aux BSLB de manière non spécifique. Le blocage avec 5% de BSA-PBS aide à réduire ce bruit. À partir de maintenant, assurez-vous de garder la chaîne du froid ininterrompue.
   22. Faire tourner les cocultures à 500 × g pendant 5 min et 4 °C. Avant de jeter les surnageants, assurez-vous brièvement que la pastille est présente en inspectant le fond de la plaque de 96 puits à l’aide d’un rétroéclairage.
   23. À l’aide d’une pipette multicanal, remettez en suspension les cellules du mélange maître de coloration contenant des concentrations d’anticorps optimisées.
       REMARQUE: Utilisez des embouts de pipette sans filtre pour éviter la génération de bulles et d’erreurs dans la distribution des volumes de coloration.
   24. Inclure les cellules marquées par isotype et les BSLECB, les BSLB fluorescents et non fluorescents, ainsi que les cellules et les BSLB colorés seuls. Respecter le nombre total d’événements par puits pour tous les témoins (c.-à-d. seulement les BSLB contenant 5 × ¹⁰⁵ BSLB/puits, et seulement les témoins cellulaires contenant 5 × ¹⁰⁵ cellules/puits pour éviter une augmentation relative des anticorps par événement coloré).
   25. Mélanger doucement en pipetant de haut en bas la moitié du volume et incuber pendant 30 min sur de la glace. Protéger de la lumière.
   26. Lavez les cellules et les BSLB deux fois à l’aide de BSA-PBS glacés à 2 %, pH 7,4 et d’étapes de sédimentation de 500 × g pendant 5 min à 4 °C. Resuspendez les cocultures lavées dans 100 μL de PBS et acquérez-les immédiatement.
   27. Si une fixation est nécessaire, fixez à l’aide de 0,5 % p/v de PFA dans le PBS pendant 10 min, lavez une fois et conservez-le dans le PBS jusqu’à l’acquisition. Protéger de la lumière.
   28. Avant la compensation, acquérez des normes MESF, en veillant à ce que les populations les plus sombres et les plus brillantes se situent dans la plage linéaire de mesure.
   29. Acquérir des échantillons de compensation, calculer la compensation et appliquer la matrice de compensation (lien) à l’expérience.
   30. Acquérir et enregistrer un minimum de 2 × ¹⁰⁴ normes MESF au total pour chacun des canaux de quantification.
   31. Pour l’acquisition à l’aide d’échantillonneurs à haut débit, réglez l’acquisition d’instruments sur la norme, réglez l’acquisition d’échantillons à 80 μL (ou 80 % du volume total), le débit d’échantillonnage entre 2,0 et 3,0 μL/s, le volume de mélange d’échantillons de 50 μL (ou 50 % du volume total pour éviter la formation de bulles pendant le mélange), le mélange d’échantillons de 150 μL/s et le mélange par puits entre 3 et 5.
   32. Acquérir un minimum de 1 × ¹⁰⁴ BSLB uniques par échantillon (voir les panneaux (i) à (vi) de la figure 3B pour la stratégie de contrôle de référence).
   33. Lavez le cytomètre en cours d’exécution pendant 5 min une solution de nettoyage suivie de 5 min d’eau ultrapure avant d’éteindre l’instrument. Si vous utilisez le HTS, suivez les options sous l’onglet HTS et l’option Nettoyer .
   34. Exportez les fichiers FCS.

7. Mesure du transfert synaptique des particules vers BSLB

1. Ouvrez les fichiers FCS d’expérience. Sélectionnez la population de cellules et de BSLB en fonction de leurs zones de diffusion de la lumière latérales et avant (SSC-A par rapport à FSC-A), comme le montre la figure 3B (i).
2. Sélectionnez les événements dans la fenêtre d’acquisition continue (Figure 3B (ii)).
3. Concentrez-vous sur les événements uniques des cellules et du BSLB; identifier d’abord les cellules individuelles en fonction du faible W dans les portes séquentielles FSC-W/FSC-H (singlets-1, panneau figure 3B (iii)) et SSC-W/SSC-H (singlets-2; Figure 3B panneau (iv)). Définissez une porte singlets-3 supplémentaire en sélectionnant des événements avec FSC-A et FSC-H proportionnels (Figure 3B, panneau (v)).
4. Extraire l’IMF des fractions MESF vierges et 1 à 4 et des cellules individuelles et MESF pour chaque échantillon d’expérience.
5. Générez des valeurs MFI corrigées (cMFI) pour les fractions MESF 1 à 4 en soustrayant l’IFM de la population de billes vierges de chaque fraction.
6. Générer des cMFI pour des BSLB et des cellules uniques (reportez-vous au panneau Figure 3C (i)).
7. Utilisez le signal de BSLB coloré avec des anticorps de contrôle d’isotype pour corriger l’IMF de BSLB coloré avec des anticorps contre les marqueurs de lymphocytes T pertinents. Utilisez cMFI pour calculer le pourcentage de transfert synaptique normalisé (NST%) à l’aide de l’équation illustrée dans le panneau de la figure 3C (ii).
8. Si vous vous intéressez plutôt aux particules spécifiquement transférées en réponse au déclenchement du TCR, soustrayez le signal des BSLB nuls de l’IFM des BSLB agonistes. Utilisez ce cMFI pour calculer le % NST induit par le TCR en utilisant l’équation illustrée dans le panneau de la figure 3C (ii).
9. Si vous souhaitez déterminer le nombre total de molécules transférées en tant que cargaison de particules à travers l’interface cellule T-BSLB, acquérez des billes de référence MESF en utilisant les mêmes réglages d’instrument et la même session d’acquisition pour les cocultures T cell-BSLB.
10. Analyser les populations de billes MESF et extraire leurs cMI comme indiqué dans les étapes de protocole 5.8.15 à 5.8.17. Calculer la pente de la ligne la mieux ajustée pour l’analyse de régression de MESF sur cMFI.
11. Utilisez la pente calculée pour extraire le nombre de MESF déposés sur les BBSL. Utilisez des cMF calculées à l’aide de contrôles d’isotype ou de BSLB nuls comme blancs pour extraire le nombre de MESF transférés spécifiquement aux BSLE stimulants.
12. Calculer le nombre de molécules de marqueurs transférés aux BSLEB en divisant les MESF calculés (moyens) par BSLB par la valeur F/P de l’anticorps de quantification.

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Résultats

FCM pour la quantification absolue des protéines à la surface de la cellule
La reconstitution des BSLB présentant des densités physiologiques de ligands nécessite l’estimation des densités protéiques totales sur le sous-ensemble cellulaire modélisé. Pour reconstituer les BSLB, inclure tout ligand pertinent censé jouer un rôle dans l’axe de signalisation d’intérêt aux côtés des protéines soutenant l’adhésion et l’interaction fonctionnelle entre BSLB et les cellules, telles qu...

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Discussion

Les BSLB sont des outils polyvalents pour étudier la production de particules des lymphocytes T stimulés par des membranes APC modèles. La flexibilité de la méthode permet la reconstitution de compositions membranaires complexes et réductionnistes pour étudier les effets des ligands et de leurs signaux sur la sécrétion de tSV et de particules d’attaque supramoléculaire et leurs composants. Nous avons testé cette technologie sur diverses cellules T, y compris les cellules TH, CTL, Tregs et ^C...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)	Avanti Polar Lipids	790404C-25mg	18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform
PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL	Gilson	FA10011
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850375C-25mg	18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390	ATTO-TEC	AD 390-165	DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488	ATTO-TEC	AD 488-165	DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565	ATTO-TEC	AD 565-165	DOPE ATTO 565
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids	870273C-25mg	18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform
200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack	Starlab	S1111-0206
5 mL polystyrene round-bottom tubes	Falcon®	352052
5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads	Bangs Laboratories Inc.	SS05003
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic.	Costar®	3799	For FCM staining and co-culture of BSLB and cells.
96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic.	Costar®	3894	For FCM staining of cells or beads in suspension.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A37573 and A20006
Allegra X-12R Centrifuge	Beckman Coulter		For normal in tube staining of biological samples for FCM
Aluminum Foil	Any brand		For protecting cells and BSLBs from light
anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31	BioLegend	310815 and 310818	Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4	BioLegend	356934	For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19	BioLegend	302234	For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD2, clone RPA-2.10	BioLegend	300202	Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD2, clone TS1/8	BioLegend	309218	Brilliant Violet 421 conjugate.
anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1	BioLegend		Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD28, clone CD28.2	eBioscience	16-0289-85	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8	ThermoFisher Scientific, invitrogen	53-3179-42	Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E.
anti-human CD38, clone HB-7	BioLegend	356624	Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD38, clone HIT2	BioLegend	303514	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD39, clone A1	BioLegend		Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4	BioLegend	317436	For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD4, clone A161A1	BioLegend	357414 and 357421	PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD4, clone OKT4	BioLegend	317414 and 317422	PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD40, clone 5C3	BioLegend	334304	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD40, clone G28.5	BioLegend		Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD45, clone HI30	BioLegend	304056 and 368516	Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates
anti-human CD47, clone CC2C6	BioLegend	323118	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54	BioLegend	322702	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6	BioLegend	353020 and 353015	PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD73, clone AD2	BioLegend	344002	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD80, clone 2D10	BioLegend	305216	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD81, clone 5A6	BioLegend	349512 and 349502	PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively.
anti-human CD82, clone ASL-24	BioLegend	342108	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD86, clone IT2.2	BioLegend	305416	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD8a, clone HIT8a	BioLegend	300920	Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD8a, clone SK1	BioLegend	344724	Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32	BioLegend	311414 and 311402	Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human HLA-DR, clone L243	BioLegend	307656 and 307622	Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human ICAM-1, clone HCD54	BioLegend	322702	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human ICOS, clone C398.4A	BioLegend	313516	Armenian Hamster IgG
anti-human ICOSL, clone MIH12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human ICOSL, clone MIH12	eBioscience	16-5889-82	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human LFA-1, clone TS1/22	BioLegend	Produced in house	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35)	BioLegend	350018	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-1 , clone EH12.2H7	BioLegend	135230 and 329902	Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L1, clone 29E.2A3	BioLegend	329702	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L2, clone 24F.10C12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-L2, clone MIH18	BioLegend	345502	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human TCRab, clone IP26	BioLegend	306712 and 306714	Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14	BioLegend	352702
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E	BioLegend	348404	Alexa Fluor 647 conjugate
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888	BioLegend	400902	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer Setup and Tracking beads	Becton Dickinson & Company (BD)	641319	Performance track of instruments before quantitative FCM
BD FACSDiva	Becton Dickinson & Company (BD)	23-14523-00	Acquisition software
Bovine Seum Albumin	Merck, Sigma-Aldrich	A3294
CaCl2, Calcium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	C5670	anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0%
Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder	Merck, Sigma-Aldrich	C5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	ThermoFisher Scientific, Gibco	11132D
DynaMag-2	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12321D	For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL
DynaMag™-15	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12301D	For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL
Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot	ThermoFisher Scientific, Gibco	A3160801	Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC
Ficoll-Paque PLUS	Cytiva, GE Healthcare	GE17-1440-02	Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation
Fixable Viability Dye eFluor 780	eBiosciences	65-0865-14	For the exclusion of dead cells during analyses
FlowJo	Becton Dickinson & Company (BD)	Version 10.7.1	Analysis software
Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker	Keison Products	MPS-1	For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation)
HEPES Buffer Solution (1 M)	ThermoFisher Scientific, Gibco	15630-056
HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid.	Merck, Sigma-Aldrich	H4034	For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture
HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel	ThermoFisher Scientific	51026282	For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Hula Mixer® Sample Mixer	ThermoFisher Scientific, Life Technologies	15920D	Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings.
Human Serum Albumin, 30% aqueous solution	Merck, Sigma-Aldrich	12667-M
Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution	BioLegend	422302	Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples
Innovatis CASY cell counter and analyzer TT	Biovendis Products GmbH		For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current.
KCl, Potassium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	P5405	Powder, BioReagent, suitable for cell culture
L-Glutamine 200 mM (100x)	ThermoFisher Scientific, Gibco	25030-024
MgCl2, Magessium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	M2393	BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes	Keison Products	P-2-24	Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini Incubator	Labnet International	I5110A-230V	For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids	ThermoFisher Scientific, Gibco	11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody control	Merck, Sigma-Aldrich	PP54	Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards
Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170	Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785  conjugates, respectively.
Mouse IgG1, k Isotype, clone X40	Becton Dickinson & Company (BD), Horizon	562438	Brilliant Violet 421 conjugate.
Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1	eBioscience	14-4714-82	Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173	BioLegend	400240	Alexa Fluor 647 conjugate
Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11	BioLegend	400330 and 400355	Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively
Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma	Falcon	353046	For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Na2HPO4, Disodium Phosphate	Merck, Sigma-Aldrich	S7907
NaCl, Sodium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	S5886	BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99%
NiSO4, Nickel(II) sulfate	Merck, Sigma-Aldrich	656895	For saturating NTA sites; added during the blocking process
Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin	ThermoFisher Scientific, Gibco	15140-122
Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile	ThermoFisher Scientific, Gibco	10010	No Ca2+ or Mg2+ added
Polyethersulfone (PES) Filter unit	Thermo Scientific Nalgene	UY-06730-43	Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar	BOC Ltd.	11-Y	For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC.
Purified Streptavidin	BioLegend	280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads	Bangs Laboratories Inc.	488	Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads	Bangs Laboratories Inc.	647	Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20	ThermoFisher Scientific, invitrogen	SA1-25258	Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Recombinant human IL-2	Peprotech	200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine	ThermoFisher Scientific, Gibco	31870-025
Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15064	Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15022C.1
Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15361	Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS.
Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red	ThermoFisher Scientific, Gibco	11835-063	For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements.
Sodium Pyruvate (100 mM)	ThermoFisher Scientific, Gibco	11360-070
Sprout mini centrifuge	FisherScientific, Heathrow Scientific LLC	120301	Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes.
Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes	Falcon	352058
UltraComp eBeads Compensation Beads	ThermoFisher Scientific, invitrogen	01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	89882