JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол поэтапного восстановления синтетических антигенпрезентирующих клеток с использованием липидных бислоев, поддерживаемых бисером, и их использование для опроса синаптического выхода из активированных Т-клеток.

Аннотация

Антигенпрезентирующие клетки (АПК) представляют три активирующих сигнала для Т-клеток, участвующих в физическом контакте: 1) антиген, 2) костимуляция / корепрессия и 3) растворимые цитокины. Т-клетки высвобождают два вида эффекторных частиц в ответ на активацию: транссинаптические везикулы (tSV) и частицы супрамолекулярной атаки, которые переносят межклеточные мессенджеры и опосредуют цитотоксичность соответственно. Эти сущности быстро усваиваются БТП, участвующими в физическом контакте с Т-клетками, что делает их характеристику сложной. В этой статье представлен протокол для изготовления и использования липидных бислоев с поддержкой бисера (BSLB) в качестве антигенпрезентирующих клеточных (APC) миметиков для захвата и анализа этих транссинаптических частиц. Также описаны протоколы абсолютных измерений плотности белка на клеточных поверхностях, восстановления BSLB с такими физиологическими уровнями и процедуры проточной цитометрии для отслеживания высвобождения синаптических частиц Т-клетками. Этот протокол может быть адаптирован для изучения влияния отдельных белков, сложных смесей лигандов, детерминант вирулентности патогенов и лекарств на эффекторный выход Т-клеток, включая хелперные Т-клетки, цитотоксические Т-лимфоциты, регуляторные Т-клетки и химерные антиген-рецептор-экспрессирующие Т-клетки (CART).

Введение

Иммунологический синапс (ИС) представляет собой ключевую молекулярную структуру, образованную на границе раздела клеток, участвующих в физическом контакте, которая облегчает регулируемый обмен юкстракриновой информацией. Различные ИС были описаны в литературе, и растущее количество доказательств предполагает, что эти молекулярные центры являются сохраненной особенностью клеточных сетей. Различные иммунные клетки, включая В-клетки, естественные клетки-киллеры, дендритные клетки, макрофаги и Т-клетки, обмениваются информацией посредством сборки короткоживущих контактов1. Мультиомные исследования продвигают понимание новых подмножеств лейкоцитов и стромальных клеток, управляющих патогенными клеточными сетями и экспрессирующих поверхностные белки с неизвестными функциями. Как синтетические ПТР, BSLB позволяют непосредственно исследовать функциональную роль отдельных белков в интеграции активирующих сигналов, а именно антигенов и костимуляции/корепрессии, Т-клетками и результирующего высвобождения эффекторных частиц, называемых сигнальной четверкой.

В этом документе описываются протоколы и критические технические моменты, которые следует учитывать при использовании BSLB для имитации состава поверхности модельных БТР. Протоколы количественного измерения иммунных рецепторов и других поверхностных белков на АПК представлены вместе с протоколом восстановления синтетических АТР, содержащих эти измеренные количества. Затем этапы, необходимые для кокультурирования Т-клеток и BSLB, представлены вместе с протоколом количественного измерения транссинаптического переноса частиц с помощью проточной цитометрии. Наиболее примечательно, что BSLB облегчают изучение популяции tSV, полученных из плазматической мембраны, называемых синаптическими эктосомами (SE). Т-клеточные антигенные рецепторы (TCR+) SE выделяются в ответ на триггер TCR2 и эффективно захватываются BSLBs3, представляя собой отличное считывание для оценки агонистических свойств антигенов и смоделированного состава мембраны. CD63+ экзосомы и частицы супрамолекулярной атаки (SMAP) также высвобождаются стимулированными Т-клетками и захватываются BSLB. Они могут быть использованы в качестве дополнительных показаний активации и результирующей экзоцитарной и литической секреции гранул Т-клетками. Мобилизация экзоцитарных везикул к взаимодействующему полюсу Т-клетки также облегчает направленное высвобождение цитокинов, таких как IL-2, IFN-γ и IL-10 в ответ на активацию4,5,6,7,8. Хотя Т-клеточные высвобождаемые цитокины также могут быть обнаружены на BSLB, в настоящее время разрабатывается более специализированное исследование для подтверждения количественного анализа высвобождения цитокинов в иммунологическом синапсе.

Чтобы выяснить, как специфические мембранные композиции влияют на синаптический выход Т-клеток, необходимо определить физиологическую плотность компонента мембраны-мишени. Количественные оценки белков клеточной поверхности на основе проточной цитометрии являются важным шагом в этом протоколе и требуют: 1) использования антител с известным количеством фторхромов на антитело (F / P) и 2) эталонных шариков, обеспечивающих стандартную ссылку для интерполяции молекул фторхрома из измеренных средних интенсивностей флуоресценции (MFI).

Эти эталонные стандарты состоят из пяти популяций шариков, каждая из которых содержит все большее число эквивалентных растворимых флуорохромов (MESF), которые охватывают динамический диапазон произвольного обнаружения флуоресценции. Эти стандартные популяции дают дискретные пики флуоресценции, облегчая преобразование произвольных флуоресцентных единиц в MESF путем простой линейной регрессии. Полученные MESF затем используются вместе со значениями F/P антител для расчета среднего числа связанных молекул на клетку (или BSLB на более поздних этапах). Применение оценочных площадей поверхности клеток к среднему числу обнаруженных молекул позволяет рассчитать физиологические плотности в виде молекул/мкм2. Этот протокол количественной оценки также может быть адаптирован для измерения плотности белка на Т-клетках и биохимического восстановления мембранных композиций, опосредующих образование гомотипических синапсов Т-клеток (т.е. Т-Т-синапсов9). При необходимости валентность связывания антител может быть дополнительно оценена с помощью рекомбинантных мишеней, меченных известным количеством фторхромов на молекулу. Затем валентность, связывающая антитела, может быть рассчитана для одной и той же популяции BSLB путем одновременного сравнения количества связанных флуоресцентных белков и количественных антител (с использованием двух различных стандартов количественной оценки фторхромов и MESF).

Восстановление мембран APC требует сборки поддерживаемых липидных бислоев (SLB) на бисерах кремнезема1. Запасы липосом, содержащие различные виды фосфолипидов, могут быть использованы для формирования универсальной липидно-двухслойной матрицы, позволяющей закреплять рекомбинантные белки с различной химией связывания (получение липосом подробно описано в 10). Как только физиологическая плотность (или плотности) соответствующего лиганда «на клетках» определена, тот же протокол проточной цитометрии адаптируется для оценки концентрации рекомбинантного белка, необходимой для покрытия BSLB целевой физиологической плотностью. Две различные анкерные системы могут использоваться как в комбинации, так и по отдельности.

Во-первых, SLB, содержащий конечные 12,5 моль% Ni2+-содержащих фосфолипидов, достаточен для обеспечения примерно 10 000 сайтов связывания His-tag на квадратный микрон10 и хорошо работает для украшения BSLB большинством коммерчески доступных белков, физиологическая плотность которых не превышает эту максимальную нагрузочную способность. Вторая система загрузки использует биотинсодержащие фосфолипиды (в виде моля%) для загрузки биотинилированных анти-CD3e Fab (или мономеров HLA / MHC) через мосты стрептавидина. Комбинация этих двух методов декорирования BSLB позволяет гибко адаптировать BSLB как синтетические БТР. Для очень сложных поверхностных композиций APC моль% фосфолипидов и белков может быть увеличен для загрузки столько белков, сколько требуется для рассматриваемого вопроса. После определения рабочих концентраций белков и моль% биотинилированных фосфолипидов BSLB могут быть собраны для опроса синаптического выхода Т-клеток с помощью многопараметрической проточной цитометрии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Измерение плотности белков поверхности клеток с помощью количественной проточной цитометрии

  1. Получают 0,22 мкм-фильтрованный буфер проточной цитометрии человека (hFCB), добавляя ЭДТА (к конечной концентрации 2 мМ) и сыворотку AB человека (до последних 10%) к стерильному фосфат-буферному физиологическому раствору (PBS), pH 7,4 (см. Таблицу 1). Отфильтруйте раствор с помощью порового фильтра 0,22 мкм для удаления сывороточных примесей и храните при температуре 4 °C.
  2. Восстанавливают клетки и откладывают их центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
  3. Дважды промыть ячейки PBS. На каждой стадии промывки повторно суспендируйте ячейки в PBS до исходного объема (до центрифугирования) и открутите вниз при 300 × g в течение 5 мин при RT.
  4. Подсчитайте суспензии клеток трипана, окрашенных синим цветом, в гемоцитометре11. В качестве альтернативы можно подсчитывать ячейки, используя исключение электрического тока. Для последнего следуйте инструкциям производителя CASY-TT (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Счетчик клеток CASY-TT позволяет определить процент жизнеспособных клеток, размер клеток и объем клеток.
  5. Рассчитайте объем PBS, содержащий разбавление 1:1000 красителя для фиксации жизнеспособности eFluor 780 или аналогичного (см. Таблицу материалов), необходимого для повторного суспендирования клеток до концентрации окрашивания 107 клеток/мл.
  6. Повторно суспендируют клетки с помощью раствора жизнеспособности красителя PBS и инкубируют на льду в течение 30 мин.
  7. Удалите краситель жизнеспособности, добавив один объем ледяного hFCB. Открутите при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отныне держите холодовую цепь непрерывной.
  8. Промыть клетки hFCB, содержащим 1:50 разбавлением раствора для блокировки fc-рецепторов (см. Таблицу материалов). Доведите объем до конечной концентрации 107 клеток/мл и инкубируйте в течение дополнительных 15 минут для достижения эффективной блокировки FcgR.
  9. Распределите 100 мкл клеточной суспензии (т.е. 106 ячеек) на лунку U-нижней или V-нижней 96-луночной пластины. Держите ячейки на льду и защищенными от света (накройте алюминиевой фольгой).
  10. Приготовьте смесь антител в hFCB, определив оптимальные концентрации антител для каждого фторхром-конъюгированного антитела и, самое главное, для тех антител, которые используются для определения плотности поверхностного белка. Например, для количественной оценки экспрессии ICAM-1 на популяциях тонзиллярных клеток, как показано на фиг.1, готовят смесь, содержащую 1:200 разведений анти-CD4, анти-CD19 и анти-CXCR5 вместе с насыщенными концентрациями анти-ICAM-1 известными фторхромами AF647 на антитело (т.е. 10 мкг/мл, что было определено независимыми экспериментами по титрованию антител).
  11. В качестве дополнительного контроля готовят мастер-смесь антител, содержащую соответствующие контрольные изотипы антител (в тех же эффективных концентрациях, что и их аналоги, конъюгированные с теми же фторхромами для фонового вычитания), т.е. используют 10 мкг/мл соответствующего контроля изотипа AF647.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенном выше примере такой элемент управления изотипом используется для вычитания фоновой флуоресценции из истинного сигнала ICAM-1 на ячейках.
  12. При количественной оценке плотности белка на подмножествах клеток, присутствующих на низких частотах в тканях, подготовьте флуоресцентные минус один (FMO) контрольные элементы, содержащие все окрашивающие антитела, за исключением маркеров, представляющих интерес (см. дополнительные сведения в 12).
  13. Раскрутите 96-луночную пластину, содержащую клетки, при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C, отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в 50 мкл либо мастер-смеси антител количественной оценки, либо смеси мастер-смеси антител изотипа.
  14. Инкубируйте клетки в течение не менее 30 мин при 4 °C и 400 об/мин с помощью пластинчатого шейкера. Защитите пластины от света (накройте алюминиевой фольгой).
  15. Промыть ячейки три раза с помощью hFCB и центрифуги при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C.
  16. Повторно суспендировать клеточную гранулу с использованием 200 мкл PBS (т.е. до конечной концентрации 5 × 106 клеток/мл).
  17. Для приобретения:
    1. При использовании стандартного погрузчика BD FACS перенесите образцы на полистирольные трубки круглого дна объемом 5 мл (см. Таблицу материалов).
    2. При использовании высокопроизводительных пробоотборников (HTS, также называемых считывателями пластин), немедленно перейдите к шагу 1.19.
  18. Прежде чем приступить к сбору данных для стандартов MESF, проверьте максимальную линейность интенсивности флуоресценции и минимальные пределы для каналов количественной оценки.
  19. Перед компенсацией получите данные для стандартов MESF, гарантируя, что как самые тусклые, так и самые яркие популяции попадают в линейный диапазон измерений.
  20. Приобретите компенсационные образцы. Сохраняйте значения напряжения фотоумножителя (PMT) для каналов количественной оценки неизменными, чтобы сохранить динамический диапазон обнаружения. Выполните небольшие корректировки напряжения PMT других каналов перед расчетом компенсационных матриц.
  21. Рассчитайте и примените компенсацию.
  22. Приобретите и сохраните не менее 2 × 104 бусин MESF для каждого из каналов количественной оценки.
  23. Выберите популяцию одиночных ячеек на основе их боковых и передних областей рассеяния света (SSC-A и FSC-A, соответственно, как показано на рисунке 1A (i)), с последующим выбором событий внутри временного континуума (рисунок 1A (ii)) и низких для времени полета (W) как в FSC, так и в SSC по сравнению с их высотой (т.е. FSC-W/FSC-H, за которым следует SSC-W/SSC-H, как показано на рисунке 1A (iii) и (iv), соответственно). Определите конечный шлюз с одним событием, содержащий события с пропорциональным распределением FSC-A и FSC-H (рисунок 1A (v)).
  24. Получение контрольных образцов (isotype-labeled и FMO controls).
  25. Извлекайте образцы и записывайте до тех пор, пока не будет получено не менее 10 000 клеток-мишеней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: надежное определение средней молекулярной плотности требует анализа нескольких доноров в независимых экспериментах. Это имеет решающее значение при анализе подмножеств клеток, обнаруженных на пониженных частотах или полученных из дефицитного биологического материала (например, из биопсии тканей человека).
  26. Промыть работающий цитометр в течение 5 минут чистящим раствором FACS, а затем 5 минут сверхчистой водой перед выключением прибора. Если вы используете HTS, следуйте параметрам на вкладке HTS и программа Clean Plate.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить перенос пробы в образец, активируйте опции промывки сидячего (пробоотборника) или высокопроизводительного пробоотборника , которые будут автоматически промывать цитометр между трубками или скважинами. Перед началом сбора пропустите сверхчистую воду в течение 10 минут с высокой скоростью потока, чтобы удалить любые немытые биологические загрязнения из линии отбора проб цитометра.
  27. Экспортируйте файлы стандарта проточной цитометрии (FCS).

2. Регрессионный анализ средней (или медианной) интенсивности флуоресценции (MFI) MESF

  1. Откройте программное обеспечение для анализа проточной цитометрии и загрузите файлы FCS эксперимента. Выберите популяцию бусин на основе их боковых и передних областей рассеяния света (SSC-A против FSC-A), как показано на рисунке 1A (i).
  2. Контролируйте качество данных путем проверки распределения единичных событий по времени, как указано в шаге 1.24.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки создают пробелы в распределении событий по времени; обычно это проявляется в начале приобретения с использованием HTS. Избегайте выбора событий, обрамляющих пробелы во времени сбора, поскольку они добавляют погрешности измерения из-за оптических аберраций.
  3. Сосредоточьтесь на отдельных событиях.
    1. Клетки
      1. сначала определите одиночные ячейки на основе их распределения SSC-A и FSC-A (рисунок 1A (i)), а затем события низкого уровня для W в последовательных затворах FSC-W/FSC-H (синглеты-1, рисунок 1A панель (iii)) и SSC-W/SSC-H (синглеты-2; Рисунок 1А панель (iv)). Определите дополнительный затвор singlets-3, выбрав события с пропорциональными FSC-A и FSC-H (рисунок 1A, панель (v)). Наконец, идентифицируйте живые клетки как отрицательные для поправимого красителя жизнеспособности.
    2. Бусины MESF
      1. Следуйте той же дискриминации синглетов-1 к синглетам-3, что и на этапе 2.3.1.1 (рисунок 1В, панели i)-v)). Определите каждую из популяций MESF (пустые, 1, 2, 3 и 4) на основе их уровней интенсивности флуоресценции (см. Рисунок 1B, панель (vi)).
  4. Извлеките из МФО фракции MESF заготовки и от 1 до 4.
  5. Генерация скорректированных значений MFI (cMFI) для фракций MESF от 1 до 4 путем вычитания MFI пустой популяции бусин из каждой дроби.
  6. Рассчитайте строку, наиболее подходящую для связи между cMFI и значениями MESF, предоставленными поставщиком (независимая переменная, пустая дробь равна нулю).
  7. Извлеките наклон (b в уравнении ниже) линейной регрессии MESF над cMFI (на панели (viii) на рисунке 1B показана регрессия, в которой y = a + bx; с a = 0).
  8. Извлеките среднюю (для бимодальных флуоресцентных распределений) или среднюю (для нормальных или логарифмических флуоресцентных распределений) интенсивность флуоресценции из интересующих популяций (TFH и B-элементы на рисунке 1A панели (vii)).
  9. Как и на этапах 2.5-2.7, извлеките значения MFI из контрольных ячеек, меченных изотипом.
  10. Если F/P контроля изотипа совпадает с антителами количественной оценки, исправьте МФО окрашенных клеток, вычитая МФО из клеток, меченных изотипом.
  11. Если F/P изотипов отличается от F/P антител количественной оценки, извлеките MESF из изотипов путем деления МФУ меченых изотипами клеток с наклоном, рассчитанным на этапе 2.7. Вычтите изотип MESF из количественной оценки MESF перед оценкой связанных количественных антител.
  12. Разделите MESF на F/P антител количественной оценки, чтобы оценить количество связанных молекул на клетку (Molec. ячейки , как показано на блок-схеме рисунка 1С).
  13. Разделите число связанных молекул с расчетной площадью поверхности клетки (CSA (мкм2)), чтобы извлечь плотность белков в виде молекулы/мкм2 (рисунок 1C). Для получения более подробной информации обратитесь к разделу репрезентативных результатов.

3. Функциональные виды фосфолипидов для использования при калибровке белкового покрытия BSLBs

  1. Используйте 0,4 мМ DOPC (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин) в качестве основного компонента липидного матрикса, образующего поддерживаемый липидный бислой. Разбавьте все другие виды липидов в этом растворе DOPC.
  2. Используйте от 0,2 до 1 моль% 0,4 мМ DOPE (1,2-диолеоил-sn-glycero-3-фосфоэтаноламина), конъюгированного с красителями, включая ATTO 390, 488 или 565 (см. Таблицу материалов), для получения BSLB с внутренней флуоресценцией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренняя флуоресценция BSLB облегчает идентификацию отдельных BSLB и отдельных клеток в экспериментах по синаптикальному переносу.
  3. Используйте 12,5 моль% от 0,4 мМ DGS-NTA(Ni) (1,2-диолеоил-sn-glycero-3-[(N-(5-амино-1-карбоксипентил) иминодиуксусная кислота) сукцинил]) для закрепления помеченных His белков. Держите моль% DGS-NTA(Ni) постоянным и выполняйте 2-кратное титрование помеченных His белков, начиная со 100 нМ в качестве самой высокой концентрации. Оставьте одно состояние без белка в качестве отрицательного контроля для абсолютных количественных показателей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вспомогательные сигналы и молекулы адгезии, такие как ICAM-1, разработаны с меткой 12-His для увеличения сродства белка к DGS-NTA(Ni).
  4. Используйте Biotinyl Cap PE (1,2-диолеоил-sn-glycero-3-фосфоэтаноламин-N-(cap biotinyl)) для закрепления биотинилированных белков через мосты биотин-стрептавидин-биотин. Используйте 5-кратное последовательное титрование 0,4 мМ Biotinyl Cap PE, покрывающее от 10 моль% до 0 моль% (в качестве отрицательного контроля). Поддерживайте концентрацию стрептавидина и биотинилированных белков постоянной (200 нМ) как в калибровочных экспериментах, так и при восстановлении синтетических АТР для экспериментов по синаптикальному переносу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Регрессионный анализ эмпирических плотностей биотинилированных белков над конечным моль% биотинилового полиэтилена в липидной матрице (также содержащей DGS-NTA(Ni) для закрепления помеченных His белков) определит моль%, который будет использоваться для восстановления целевой плотности антигена.

4. Получение дополнительного буферного физиологического раствора HEPES, содержащего 1% сывороточного альбумина

ПРИМЕЧАНИЕ: Добавленный HEPES-буферный физиологический раствор, содержащий 1% сывороточного альбумина человека (HBS/HSA) или 1% бычьего сывороточного альбумина (HBS/BSA), необходим на этапах промывки и загрузки белка BSLB (таблица 1). Подготовьте 10-кратный раствор HBS и рабочий буфер как можно более свежими; хранить в холодильнике и использовать в течение одного месяца. Хотя BSA является более дешевой альтернативой HSA, он обеспечивает эффективную блокировку ni-хелатирующих липидов13 и рекомендуется для экспериментов с высокой пропускной способностью.

  1. Приготовьте 10-кратный запасной буферный раствор дополненного HBS, содержащий 200 мМ HEPES, 7 мМ Na2HPO4, 1400 мМ NaCl, 50 мМ KCl, 60 мМ глюкозы, 10 мМ CaCl2 и 20 мМ MgCl2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Растворение MgCl2 является высокоэкзотермическим и опасным для ожога. Добавляйте эту соль медленно и на большой объем растворителя. Избегайте приготовления концентрированных растворов (т.е. 1 М) этих солей, поскольку они имеют тенденцию выпадать в осадок с течением времени, что затрудняет их точное добавление к рабочему буферу.
  2. Отфильтруйте 10-кратный раствор с помощью фильтрующего блока 0,22 мкм и держите его стерильным при 4 °C.
  3. Для 500 мл HBS /has, возьмите 50 мл дополненного 10x раствора HBS, отрегулируйте рН до 7,4, если это необходимо, и увеличьте объем до 483,4 мл сверхчистой водой.
  4. Добавьте 16,6 мл 30% раствора HSA к 483,4 мл HBS, рН 7,4.
  5. Для 500 мл HBS/BSA растворить 5 г BSA в HBS и инкубировать при 37 °C в течение 30 мин. Затем осторожно перемешайте при RT, периодически переворачивая бутылку, пока не появятся видимые кристаллы белка или сгустки.
  6. Фильтруйте полученный раствор с этапа 4,5 с помощью фильтрующего блока 0,22 мкм (см. Таблицу материалов) и храните его при 4 °C.

5. Калибровка плотности белка на BSLB

  1. Перед тем, как взять нефункционализированные кварцевые шарики диаметром 5,00 ±0,05 мкм, хорошо перемешайте запасной раствор и повторно суспендируйте любые большие скопления бусин, осажденных на дне колб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кварцевые шарики имеют тенденцию быстро оседать, что может привести к ошибкам подсчета. Энергично перемешивайте, пипетируя вверх и вниз половину максимального объема микропипетки P1000.
  2. Разбавьте 1 мкл бисерного раствора в 1000 мкл PBS, подсчитайте шарики с помощью камеры гемоцитометра и рассчитайте их концентрацию на мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание трипанов в синий цвет не требуется для визуализации бисер кремнезема.
  3. Рассчитайте объем кварцевых шариков, необходимых для 5 × 105 конечных BSLB на точку титрования.
  4. Перенесите необходимый объем шариков кремнезема в стерильную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
  5. Трижды вымойте шарики кремнезема 1 мл стерильного PBS, центрифугируйте шарики в течение 15 с на настольной микроцентрифуге на RT (при фиксированных оборотах).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При удалении моющего раствора не нарушайте гранулу бусины. Небольшой буферный столбец не повлияет на распространение липосом, составляющих мастер-микс липосом, поскольку они также находятся в PBS.
  6. Подготовьте три тома липосомной смеси для сборки BSLB на промытых кварцевых шариках (например, если начальный общий объем бисер кремнезема составляет 20 мкл, приготовьте минимум 60 мкл мастер-смеси липосом).
  7. Для титрования биотиниловых колпачков PE моль%
    1. Приготовьте липидные мастер-смеси, содержащие 5-кратные разведения Биотинилкап ПЭ.
      1. Разбавляют 0,4 мМ биотиниловый колпачок ПЭ моль% в 100% DOPC матрице.
      2. Смешайте каждую точку титрования Biotinyl Cap PE mol% в соотношении 1:1 (об/об)с раствором 0,4 мМ 25% DGS-NTA(Ni) таким образом, чтобы во всех титровании присутствовали конечные 12,5 моль% Ni-содержащих липидов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 12,5 моль% (об.:об.%) Ni-содержащих липидов представляют собой смешанный липидный состав BSLB, на котором his-меченые белки также могут быть протестированы в параллельных калибровках. Например, поскольку все запасы липосом получают в одной и той же молярной концентрации, чтобы достичь целевой моль% смеси в 200 мкл окончательной смеси липосом, просто смешайте 100 мкл 25 моль% Ni-содержащего DGS-NTA со 100 мкл 100 моль% DOPC.
    2. Переложите 5 × 105 промытых шариков кремнезема в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл таким образом, чтобы на каждую трубку собиралась одна точка титрования Биотинильного колпачка ПЭ моль%.
    3. Добавьте мастер-смеси для титрования Biotinyl Cap PE mol% в промытые шарики кремнезема и аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз половину общего объема. Избегайте образования пузырьков, которые в избытке разрушают липидный бислой.
    4. Добавьте газ аргон (или азот) в трубку, содержащую образующиеся BSLB, чтобы вытеснить воздух и защитить липиды от окисления во время смешивания.
    5. Добавьте аргон в запасы липидов 0,4 мМ перед хранением и манипулируйте используя стерильную технику.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подключите небольшую трубку к газовому баллону с аргоном/азотом. Перед добавлением газа в трубки отрегулируйте регулятор газового баллона так, чтобы давление было установлено не выше 2 фунтов на квадратный дюйм. Подключите стерильный наконечник пипетки к выходной трубке, чтобы направить поток газа внутрь липосомного материала на 5 с и быстро закрыть крышку. В случае липидных запасов закройте крышку трубки парафиновой пленкой перед хранением при температуре 4 °C.
    6. Переместите BSLB в вертикальный лабораторный смеситель с переменным углом наклона (см. Таблицу материалов) и перемешивайте в течение 30 минут на RT, используя орбитальное смешивание 10 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап предотвратит осаждение шариков во время образования поддерживаемого липидного бислоя.
    7. Раскрутите шарики центрифугированием в течение 15 с в RT на настольной мини-центрифуге, а затем трижды промыть 1 мл HBS / HSA (BSA), чтобы удалить лишние липосомы.
    8. Блокируют образующиеся BSLB путем добавления 1 мл 5% казеина или 5% BSA, содержащего 100 мкМ NiSO4 для насыщения участков NTA и 200 нМ стрептавидина для равномерного покрытия всех биотиновых анкеровочных участков на BSLB. Аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз половину общего объема, и инкубируйте в вертикальном смесителе не более 20 мин при RT и 10 об/мин.
    9. Раскрутите BSLB путем центрифугирования в течение 15 с на RT на настольной миницентрифуге, а затем трижды промыть 1 мл буфера HBS/HSA (BSA).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите промытые бусины вертикально с небольшим объемом промывочного буфера, покрывающего BSLB. Избегайте обезвоживания BSLB, так как воздух разрушит липидный бислой.
  8. Для титрования his-меченых белков на 12,5 моль% DGS-(Ni)NTA-содержащих BSLB
    1. Приготовьте три тома липосомной мастер-смеси, содержащей конечные 12,5 моль% DGS-NTA(Ni).
    2. Используйте липосомную смесь, чтобы повторно суспендировать промытые шарики кремнезема и аккуратно перемешать, пипетируя вверх и вниз половину общего объема. Избегайте образования пузырьков, которые в избытке повреждают липидный бислой.
    3. Добавьте газ аргон (или азот) в трубку, содержащую образующиеся BSLB, чтобы вытеснить воздух и защитить липиды от окисления во время смешивания.
    4. Добавьте аргон в запасы липидов 0,4 мМ перед хранением и манипулируйте используя стерильную технику.
    5. Переместите BSLB в вертикальный смеситель и перемешивайте в течение 30 минут на RT, используя орбитальное смешивание при 10 оборотах в минуту.
    6. Раскрутите шарики центрифугированием в течение 15 с в RT на настольной мини-центрифуге, а затем трижды промыть 1 мл HBS / HSA (BSA), чтобы удалить лишние липосомы.
    7. Блокируют образующиеся BSLB путем добавления 1 мл 5% казеина (или 5% BSA), содержащего 100 мкМ NiSO4 , для насыщения NTA-сайтов на BSLB. Осторожно перемешайте и инкубируйте в вертикальном смесителе не дольше 20 мин при RT и 10 об/мин.
    8. Промыть три раза, используя HBS/HSA (BSA), чтобы удалить лишний блокирующий раствор.
    9. В новой U-нижней 96-луночной пластине готовят 2-кратное серийное разведение белков.
      1. Подготовьте начальную концентрацию 100 нМ для интересующего белка в общем объеме 200 мкл буфера HBS/HSA (BSA), распределите 100 мкл этого раствора в первой колонке, а оставшиеся 100 мкл поверх колонки No2, содержащей 100 мкл буфера HBS/HSA (BSA).
      2. Продолжайте последовательно передавать 100 мкл из колонки No 2 в колонку No 3 и повторяйте по мере необходимости, чтобы охватить все точки титрования. Оставьте последний столбец серии без белка, так как он будет использоваться в качестве пустой ссылки для количественной оценки.
    10. Повторно суспендировать подготовленные BSLB в объеме таким образом, чтобы 5 × 105 BSLB содержались в 100 мкл буфера HBS/HSA (BSA).
    11. Перенесите 100 мкл суспензии BSLB в скважины второй U-нижней 96-луночной плиты таким образом, чтобы каждая скважина получала 5 × 105 BSLB.
    12. Открутите вторую пластину, содержащую BSLB, в течение 2 мин при 300 × г и RT и выбросьте супернатант.
    13. Перенесите объемы 100 мкл с пластины титрования белка на пластину, содержащую осажденные BSLB. Осторожно перемешайте, избегайте образования избыточных пузырьков во время пипетки и инкубируйте в течение 30 мин при RT и 1000 об/мин с помощью пластинчатого шейкера. Защитите от света алюминиевой фольгой.
    14. Промыть пластину три раза буфером HBS/HSA (BSA), используя ступени осаждения 300 × г в течение 2 мин при RT.
    15. Если рекомбинантный белок, используемый при калибровке, непосредственно конъюгирован с фторхромами и имеет известные значения F/P, перейдите к шагу 5.8.20.
    16. Если рекомбинантный белок, используемый при калибровке, не маркирован или конъюгирован с фторхромами или нет стандарта MESF, используйте Alexa Fluor 488 или 647-конъюгированные антитела с известными значениями F / P для окрашивания BSLB с белковым покрытием.
    17. Окрашивание с насыщенными концентрациями количественных антител.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от целевого уровня экспрессии они варьируются от 5 до 10 мкг/мл.
    18. Окрашивание в течение 30 мин при RT и 1000 об/мин с помощью пластинчатого шейкера. Защитите от света с помощью алюминиевой фольги.
    19. Дважды промывайте буфером HBS/HSA (BSA) и один раз PBS, используя ступени осаждения 300 × г в течение 2 мин при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте PBS, pH 7.4 для повторного суспендирования промытых BSLB перед приобретением. Не следует использовать буферы, содержащие белок, так как это приводит к образованию пузырьков при автоматическом смешивании образцов с высокопроизводительными пробоотборниками.
    20. Приобретите стандарты MESF, убедившись, что самые яркие пики остаются в линейном диапазоне обнаружения для детектора количественной оценки (канала), как показано на рисунке 1B (vii).
    21. Приобретайте образцы вручную или с помощью HTS. При использовании последнего повторно суспендируют BSLB в 100 мкл PBS и приобретают 80 мкл, используя скорость потока от 2,5 до 3,0 мкл/с, объем смешивания 100 мкл (или 50% от общего объема, если объем повторного суспендирования меньше), скорость смешивания 150 мкл/с и пять смесей для обеспечения монодисперсирования BSLB.
    22. Экспортируйте файлы FCS.
    23. Сосредоточьтесь на единичных событиях для анализа (рисунок 2A), так как дублеты или триплеты внесут ошибку в определение. Используйте вложенную идентификацию отдельных событий, как указано на этапе 1.2.3 протокола.
    24. Измерьте МФО каждой фракции MESF (1-4) и вычтите MFI из пустых шариков для извлечения скорректированных MFI (cMFI).
    25. Выполнить линейный регрессионный анализ для извлечения уклона (b) MESF над cMFI, рассчитанным для стандартов MESF, который будет использоваться на этапе 5.33.
    26. Извлеките МФО из каждой точки титрования и вычтите МФО бусин без белка для получения цМФИ.
    27. Разделите cMFI на наклон, рассчитанный на шаге 5.31, чтобы извлечь MESF, привязанный к BSLB для каждой точки титрования.
    28. Разделите MESF, связанный с BSLB, на значение F/P количественного антитела для извлечения среднего числа молекул, связанных на BSLB.
    29. Используя диаметр BSLB (5,00 ± 0,05 мкм), извлеките площадь поверхности шарика (SA = 4pr2) для расчета конечной плотности белка (молек./мкм2) на точку титрования (концентрацию белка).
    30. Выполните новый регрессионный анализ концентрации белка над плотностью белка , чтобы рассчитать наклон (b) линии наилучшего соответствия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация 12,5 моль% DGS-NTA(Ni) обеспечивает максимальную анкерную способность приблизительно 10 000 молек/мкм210 без индуцирования неспецифической активации Т-клеток или влияния на боковую подвижность SLB.

6. Проведение экспериментов по синаптическому переносу между Т-клетками и BSLB

  1. Перед запуском эксперимента по синаптическому переносу
    1. Приобретайте нефлуоресцентные BSLB, BSLB с флуоресцентными липидами, неокрашенные клетки (или компенсационные шарики; см. Таблицу материалов) и одноцветные окрашенные ячейки (или компенсационные шарики) для идентификации взаимодействий флуоресцентного спектра прибора. Сосредоточьтесь на детекторах с высоким распространением побочных эффектов, чтобы перепроектировать полихроматическую панель, повысить чувствительность и уменьшить погрешность измерения на критических детекторах (см. 14).
    2. Титруйте антитела для обнаружения, чтобы найти оптимальную концентрацию, позволяющую обнаруживать положительные события без ущерба для обнаружения отрицательных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторяйте этот шаг всякий раз, когда изменяется партия антител, поскольку значения F / P и яркость варьируются от партии к партии.
    3. Дополнительно: Оптимизируйте напряжения PMT путем получения образца в различных диапазонах напряжения (т. Е. Напряжение идет), чтобы найти PMT, ведущие к оптимальному сигналу над шумом (т. Е. Разделение отрицательных и положительных при обеспечении того, чтобы сигнал самой яркой популяции оставался в линейном диапазоне).
  2. Измерение передачи выхода Т-клеток на BSLB
    1. Готовят препарат RPMI 1640 (в настоящем описании среды R10), содержащий 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 мкМ заменимых аминокислот, 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Используйте среду R10 для культивирования и расширения Т-клеток.
    2. На 1-й день выделяют Т-клетки из камер периферической крови или системы лейкоредукции (LRS). Используйте наборы для изоляции и разделения клеток иммуноденции (см. Таблицу материалов) для обогащения человеческих CD4+ и CD8+ Т-клеток.
    3. Посейте клетки в конечной концентрации в диапазоне от 1,5 до 2,0 × 106 клеток/мл, используя пластины из 6 лунок с общим количеством не более 5 мл на лунку.
    4. Активируйте Т-клетки, используя соотношение 1:1 активации Т-клеток человека (анти-CD3 / анти-CD28) магнитных шариков (см. Таблицу материалов) и добавьте 100 МЕ рекомбинантного человеческого IL-2 для поддержки пролиферации и выживания клеток.
    5. На 3-й день снимите активирующие магнитные шарики с помощью магнитных колонок (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что магнитные шарики прикреплены к боковым сторонам трубки, прежде чем восстанавливать ячейки для дополнительных этапов промывки.
    6. Вымойте магнитные шарики еще раз 5 мл свежей среды R10, хорошо перемешайте и положите их обратно в магнит. Восстановите этот объем и смешайте с клетками, восстановленными на шаге 6.2.5.
    7. Повторно суспендировать клетки до 1,5-2 × 106 клеток/мл в свежем R10, содержащем 100 Ед/мл IL-2. Пополняют среду через 48 ч, следя за тем, чтобы последнее добавление ИЛ-2 было за 48 ч до дня экспериментирования (дни с 7 по 14 посева).
    8. В день эксперимента по синаптическому переносу подготовьте среду Synaptic Transfer Assay (см. Таблицу 1), добавив среду RPMI 1640 без фенола 10% FBS, 100 мкМ заменимых аминокислот, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Не включайте рекомбинантный человеческий IL-2.
    9. Подсчитайте клетки, используя либо окрашивание трипановым синим цветом, либо исключение электрического тока, и повторно суспендируйте их до конечной концентрации 2,5 × 106 клеток/мл в среде. Если наблюдается чрезмерная гибель клеток (>10%), удалите мертвые/умирающие клетки с помощью смеси полисахарида и диатризоата натрия (см. Таблицу материалов) следующим образом:
      1. Слой 15 мл клеточной культуры поверх 13 мл раствора полисахарид-натрия диатризоата.
      2. Центрифуга на 1 250 × g в течение 20 мин при РТ с минимальным ускорением и разгоном. Соберите клеточный слой (облако) в интерфейсе между средой и раствором полисахарид-натрия диатризоата.
      3. Промыть клетки не менее двух раз предварительно расплавленной средой для анализа синаптического переноса (подготовленной на этапе 6.2.7).
      4. Подсчитайте и повторно суспендируйте клетки до конечной концентрации 2,5 × 106 /мл с использованием среды Synaptic Transfer Assay. Кокультура 100 мкл этой клеточной суспензии с BSLB (см. этап 6.2.15).
    10. Рассчитайте количество BSLB, необходимое для эксперимента; рассмотрим все различные мастер-смеси белков и титрование антигенов, подлежащие тестированию (либо биотинилированные мономеры HLA/MHC-пептидов, либо монобиотинилированные анти-CD3ε Fab).
    11. Соберите BSLB, выполнив те же шаги, что и в разделе 5 протокола, но на этот раз объедините все титрования белков и липидов, необходимые для восстановления сложной мембраны APC (рисунок 3A). Сохраняйте одинаковые соотношения vol: vol между начальным объемом шариков кремнезема и объемом белковой смеси, используемой во время калибровки, а также временем и температурами, используемыми при загрузке BSLB. Например, если для первоначальной калибровки было использовано 0,5 мкл шариков кремнезема/лунка и 100 мкл/лунка белковой смеси, поддерживайте соотношение 5:1000 об/об, чтобы подготовить BSLB к кокультурированию с Т-клетками.
    12. После того, как BSLB были загружены интересующей белковой смесью, дважды промыть BSLB HBS / HSA (BSA), чтобы удалить лишние несвязанные белки. Используйте скорость осаждения 300 × г в течение 2 мин при РТ на каждом этапе промывки и выбрасывайте супернатанты.
    13. Повторное суспендирование 5 × 105 BSLB на скважину в 200 мкл.
    14. Перенесите 100 мкл на скважину на новую U-донную 96-луночную пластину, чтобы сделать дубликат, так что конечное количество BSLB на скважину составляет 2,5 × 105.
    15. Раскрутите BSLB при 300 × g в течение 2 мин и RT и выбросьте супернатант.
    16. Повторное суспендирование BSLB с использованием 100 мкл суспензии Т-клеток; аккуратно перемешать, чтобы предотвратить образование пузырьков.
    17. Инкубировать кокультуры в течение 90 мин при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, клетки и шарики могут быть повторно суспендированы в буфере HBS/HSA (BSA) вместо Phenol-Red free RPMI для кокультуры. В этом случае инкубация должна быть выполнена в инкубаторе без CO2 , так как этот газ будет быстро подкислять буфер в отсутствие бикарбоната.
    18. Охладите клеточные кокультуры BSLB-T, сначала инкубируя клетки в RT в течение как минимум 15 минут. Защитите их от света.
    19. Центрифугировать ячейки в течение 5 мин при 500 × г и РТ; отбросьте супернатант.
    20. Повторное суспендирование клеток в RT 2% BSA-PBS (Ca2+ и Mg2+-free) для блокировки. Поместите ячейки на лед на 45 мин. Защита от света.
    21. Во время инкубации клеток приготовьте смесь антител с использованием ледяного 0,22 мкм-фильтрованного 2% BSA в PBS в качестве буфера окрашивания, который обеспечит дополнительную блокировку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые партии антител, конъюгированных с красителями Brilliant Violet, имеют тенденцию связываться с BSLB неспецифически. Блокировка с 5% BSA-PBS помогает уменьшить этот шум. Отныне убедитесь, что холодовая цепь не нарушена.
    22. Вращайте кокультуры при 500 × г в течение 5 мин и 4 °C. Прежде чем выбрасывать супернатанты, кратко убедитесь, что гранула присутствует, осмотрев дно 96-луночной пластины с помощью подсветки.
    23. Используя многоканальную пипетку, повторно суспендируйте клетки в мастер-смеси окрашивания, содержащей оптимизированные концентрации антител.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наконечники пипеток без фильтра, чтобы предотвратить образование пузырьков и ошибок в распределении объемов окрашивания.
    24. Включают изотип-меченые клетки и BSLB, флуоресцентные и нефлуоресцентные BSLB, а также клетки и BSLB, окрашенные отдельно. Соблюдайте общее количество событий на скважину для всех контрольных групп (т.е. только BSLB, содержащих 5 × 105 BSLB/well, и только клеточные элементы управления, содержащие 5 × 105 клеток/скважину, чтобы избежать относительного увеличения антител на окрашенное событие).
    25. Аккуратно перемешайте, пипеткой вверх и вниз половину объема, и высиживайте в течение 30 минут на льду. Защита от света.
    26. Промывайте клетки и BSLB дважды, используя ледяной 2% BSA-PBS, pH 7,4 и стадии осаждения 500 × г в течение 5 мин при 4 °C. Повторно суспендируйте промытые сокультуры в 100 мкл PBS и немедленно приобретайте.
    27. Если требуется фиксация, исправьте, используя 0,5% мас./v PFA в PBS в течение 10 минут, промыть один раз и сохранить в PBS до приобретения. Защита от света.
    28. Перед компенсацией приобретите стандарты MESF, гарантируя, что как самые тусклые, так и самые яркие популяции попадают в линейный диапазон измерения.
    29. Получите компенсационные образцы, рассчитайте компенсацию и примените к эксперименту компенсационную матрицу (ссылку).
    30. Приобретите и сохраните не менее 2 × 104 общих стандарта MESF для каждого из каналов количественной оценки.
    31. Для сбора с использованием высокопроизводительных пробоотборников установите набор прибора на стандартный уровень, установите отбор проб на 80 мкл (или 80% от общего объема), расход пробы от 2,0 до 3,0 мкл/с, объем перемешивания проб 50 мкл (или 50% от общего объема, чтобы избежать образования пузырьков во время смешивания), смешивание проб 150 мкл/с и смешивание на скважину от 3 до 5.
    32. Приобретите минимум 1 × 104 одиночных BSLB на выборку (см. рисунок 3B панелей (i)-(vi) для стратегии эталонного сбора).
    33. Промыть работающий цитометр в течение 5 минут чистящим раствором, а затем 5 минут сверхчистой водой перед выключением инструмента. При использовании HTS следуйте параметрам на вкладке HTS и параметру Очистить .
    34. Экспорт файлов FCS.

7. Измерение синаптического переноса частиц в BSLB

  1. Откройте FCS-файлы эксперимента. Выберите популяцию клеток и BSLB на основе их боковых и передних областей рассеяния света (SSC-A против FSC-A), как показано на рисунке 3B (i).
  2. Выберите события в окне непрерывного сбора (рисунок 3B (ii)).
  3. Сосредоточьтесь на единичных событиях как ячеек, так и BSLB; идентифицировать одиночные ячейки сначала на основе низкого W в последовательных затворах FSC-W/FSC-H (синглеты-1, рисунок 3B панель (iii)) и SSC-W/SSC-H (синглеты-2; Рисунок 3В панель (iv)). Определите дополнительный затвор singlets-3, выбрав события с пропорциональными FSC-A и FSC-H (рисунок 3B, панель (v)).
  4. Извлеките МФО из фракций MESF заготовки и от 1 до 4 и из отдельных клеток и MESF для каждого экспериментального образца.
  5. Генерация скорректированных значений MFI (cMFI) для фракций MESF от 1 до 4 путем вычитания MFI пустой популяции бусин из каждой дроби.
  6. Генерация cMFI для отдельных BSLB и ячеек (см. рисунок 3C панели (i)).
  7. Используйте сигнал от BSLB, окрашенный контрольными антителами изотипа, для коррекции MFI BSLB, окрашенного антителами, против соответствующих маркеров Т-клеток. Используйте cMFI для расчета нормализованного процента синаптического переноса (NST%) с помощью уравнения, показанного на рисунке 3C панели (ii).
  8. Если вас интересуют частицы, специально передаваемые в ответ на срабатывание TCR, вычтите сигнал из нулевых BSLB из MFI агонистических BSLB. Используйте этот cMFI для расчета NST%, управляемого TCR , используя уравнение, показанное на рисунке 3C панели (ii).
  9. Если вы заинтересованы в определении общего количества молекул, передаваемых в качестве груза частиц через интерфейс Т-клетка-BSLB, приобретите эталонные шарики MESF, используя те же настройки прибора и сеанс сбора для кокультур Т-клеток-BSLB.
  10. Анализ популяций шариков MESF и извлечение их цМФИ, как указано на этапах протокола 5.8.15-5.8.17. Рассчитайте наклон линии, наиболее подходящей для регрессионного анализа MESF над cMFI.
  11. Используйте рассчитанный наклон для извлечения количества MESF, нанесенных на BSLB. Используйте cMFI, рассчитанные с использованием либо элементов управления изотипом, либо нулевого BSLB в качестве пробелов, чтобы извлечь количество MESF, переданных специально стимулирующим BSLB.
  12. Рассчитать количество молекул маркеров, перенесенных в BSLB, разделив рассчитанные (средние) MESF на BSLB на значение F/P количественного антитела.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

FCM для абсолютной количественной оценки белка на поверхности клетки
Восстановление BSLB, представляющих физиологические плотности лигандов, требует оценки общей плотности белка на моделируемом подмножестве клеток. Для восстановления BSLB включите любой соответствующий лиган...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

BSLB являются универсальными инструментами для изучения выхода твердых частиц Т-клеток, стимулируемых модельными мембранами APC. Гибкость метода позволяет воссоздать сложные и редукционистские мембранные композиции для изучения влияния лигандов и их сигналов на секрецию tSV и частиц суп...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Мы благодарны членам нашей лаборатории и сообществу Института ревматологии Кеннеди за конструктивные научные дискуссии, особенно нашему менеджеру центра проточной цитометрии Джонатану Уэбберу. Эта работа финансировалась Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) и Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (все три для MLD). PFCD был поддержан долгосрочной стипендией EMBO (ALTF 1420-2015, совместно с Европейской комиссией (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) и Marie Sklodowska-Curie Actions) и стипендией Оксфорд-Бристоль Майерс Сквибб.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)Avanti Polar Lipids790404C-25mg18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform

PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL		GilsonFA10011
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholineAvanti Polar Lipids850375C-25mg 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390ATTO-TECAD 390-165DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488ATTO-TECAD 488-165DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565ATTO-TECAD 565-165DOPE ATTO 565
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt)Avanti Polar Lipids870273C-25mg18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform
200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, StackStarlabS1111-0206
5 mL polystyrene round-bottom tubesFalcon®352052
5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beadsBangs Laboratories Inc.SS05003
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic.Costar®3799For FCM staining and co-culture of BSLB and cells.
96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic.Costar®3894For FCM staining of cells or beads in suspension.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester)Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™A37573 and A20006
Allegra X-12R CentrifugeBeckman CoulterFor normal in tube staining of biological samples for FCM
Aluminum FoilAny brandFor protecting cells and BSLBs from light
anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31BioLegend310815 and 310818Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4BioLegend356934For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19BioLegend302234For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD2, clone RPA-2.10BioLegend300202Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD2, clone TS1/8BioLegend309218Brilliant Violet 421 conjugate.
anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1BioLegendAlexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD28, clone CD28.2eBioscience16-0289-85Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8ThermoFisher Scientific, invitrogen53-3179-42Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E.
anti-human CD38, clone HB-7BioLegend356624Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD38, clone HIT2BioLegend303514Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD39, clone A1BioLegendLabeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4BioLegend317436For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD4, clone A161A1BioLegend357414 and 357421PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD4, clone OKT4BioLegend317414 and 317422PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD40, clone 5C3BioLegend334304Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD40, clone G28.5BioLegendLabelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD45, clone HI30BioLegend304056 and 368516Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates
anti-human CD47, clone CC2C6BioLegend323118Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54BioLegend322702Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6BioLegend353020 and 353015PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD73, clone AD2BioLegend344002Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD80, clone 2D10BioLegend305216Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD81, clone 5A6BioLegend349512 and 349502PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively.
anti-human CD82, clone ASL-24BioLegend342108Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD86, clone IT2.2BioLegend305416Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD8a, clone HIT8aBioLegend300920Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD8a, clone SK1BioLegend344724Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32BioLegend311414 and 311402Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human HLA-DR, clone L243BioLegend307656 and 307622Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human ICAM-1, clone HCD54BioLegend322702Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human ICOS, clone C398.4ABioLegend313516Armenian Hamster IgG
anti-human ICOSL, clone MIH12BioLegend329611Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human ICOSL, clone MIH12eBioscience16-5889-82Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human LFA-1, clone TS1/22BioLegendProduced in houseLabelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35)BioLegend350018Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-1 , clone EH12.2H7BioLegend135230 and 329902Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L1, clone 29E.2A3BioLegend329702Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L2, clone 24F.10C12BioLegend329611Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-L2, clone MIH18BioLegend345502Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human TCRab, clone IP26BioLegend306712 and 306714Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14BioLegend352702
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38EBioLegend348404Alexa Fluor 647 conjugate
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888BioLegend400902Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer Setup and Tracking beadsBecton Dickinson & Company (BD)641319Performance track of instruments before quantitative FCM
BD FACSDivaBecton Dickinson & Company (BD)23-14523-00Acquisition software
Bovine Seum AlbuminMerck, Sigma-AldrichA3294
CaCl2, Calcium chlorideMerck, Sigma-AldrichC5670anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0%
Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powderMerck, Sigma-AldrichC5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28ThermoFisher Scientific, Gibco11132D
DynaMag-2ThermoFisher Scientific, Invitrogen™12321DFor the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL
DynaMag™-15ThermoFisher Scientific, Invitrogen™12301DFor the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL
Fetal Bovine Serum Qualified, One ShotThermoFisher Scientific, GibcoA3160801Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC
Ficoll-Paque PLUSCytiva, GE HealthcareGE17-1440-02Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation
Fixable Viability Dye eFluor 780eBiosciences65-0865-14For the exclusion of dead cells during analyses
FlowJoBecton Dickinson & Company (BD)Version 10.7.1Analysis software
Grant Bio MPS-1 Multi Plate ShakerKeison ProductsMPS-1For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation)
HEPES Buffer Solution (1 M)ThermoFisher Scientific, Gibco15630-056
HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid.Merck, Sigma-AldrichH4034For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture
HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless SteelThermoFisher Scientific51026282For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Hula Mixer® Sample MixerThermoFisher Scientific, Life Technologies15920DVertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings.
Human Serum Albumin, 30% aqueous solutionMerck, Sigma-Aldrich12667-M
Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking SolutionBioLegend422302Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples
Innovatis CASY cell counter and analyzer TTBiovendis Products GmbHFor the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current.
KCl, Potassium chlorideMerck, Sigma-AldrichP5405Powder, BioReagent, suitable for cell culture
L-Glutamine 200 mM (100x)ThermoFisher Scientific, Gibco25030-024
MgCl2, Magessium chlorideMerck, Sigma-AldrichM2393BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubesKeison ProductsP-2-24Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini IncubatorLabnet International I5110A-230VFor the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino AcidsThermoFisher Scientific, Gibco11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody controlMerck, Sigma-AldrichPP54Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards
Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21BioLegend400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785  conjugates, respectively.
Mouse IgG1, k Isotype, clone X40Becton Dickinson & Company (BD), Horizon562438Brilliant Violet 421 conjugate.
Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1eBioscience14-4714-82Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173BioLegend400240Alexa Fluor 647 conjugate
Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11BioLegend400330 and 400355Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively
Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasmaFalcon353046For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Na2HPO4, Disodium PhosphateMerck, Sigma-AldrichS7907
NaCl, Sodium chlorideMerck, Sigma-AldrichS5886BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99%
NiSO4, Nickel(II) sulfateMerck, Sigma-Aldrich656895For saturating NTA sites; added during the blocking process
Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL StreptomycinThermoFisher Scientific, Gibco15140-122
Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterileThermoFisher Scientific, Gibco10010No Ca2+ or Mg2+ added
Polyethersulfone (PES) Filter unitThermo Scientific Nalgene UY-06730-43Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-ArBOC Ltd.11-YFor the protection of lipid stocks stored at +4 ºC.
Purified StreptavidinBioLegend280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF beadsBangs Laboratories Inc.488Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF beadsBangs Laboratories Inc.647Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20ThermoFisher Scientific, invitrogenSA1-25258Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Recombinant human IL-2Peprotech200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-GlutamineThermoFisher Scientific, Gibco31870-025
Rosette Human B Cell Enrichment CocktailSTEMCELL Technologies15064Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment CocktailSTEMCELL Technologies15022C.1
Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment CocktailSTEMCELL Technologies15361Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS.
Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment CocktailSTEMCELL Technologies15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol RedThermoFisher Scientific, Gibco11835-063For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements.
Sodium Pyruvate (100 mM)ThermoFisher Scientific, Gibco11360-070
Sprout mini centrifugeFisherScientific, Heathrow Scientific LLC120301Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes.
Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubesFalcon352058
UltraComp eBeads Compensation BeadsThermoFisher Scientific, invitrogen01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCOThermo Fisher Scientific, Invitrogen™89882

Ссылки

  1. Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling. FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).
  2. Choudhuri, K., et al. Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse. Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).
  3. Saliba, D. G., et al. Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells. elife. 8, 47528(2019).
  4. Barcia, C., et al. In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells. Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).
  5. Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).
  6. Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).
  7. Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions. Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).
  8. Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells. Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).
  9. Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
  10. Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 18 Unit 18.13 (2007).
  11. Abcam. Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2021).
  12. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  13. Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers. Frontiers in Physiology. 11, 613367(2020).
  14. Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).
  15. Céspedes, P. F., et al. Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses. bioRxiv. , (2021).
  16. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654(2017).
  17. Roederer, M. Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not. Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).
  18. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  19. Balint, S., et al. Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells. Science. 368 (6493), 897-901 (2020).
  20. Cespedes, P. F., et al. Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены