تقييم القدرة على التحمل على السباحة وسلوك السباحة في أسماك الزرد البالغة

Summary

الزرد البالغ قادر على التعافي الوظيفي بعد إصابة الحبل الشوكي ، وهو نظام نموذجي رئيسي لتوضيح الآليات الفطرية للتجديد العصبي. هنا ، نصف اختبارات تحمل السباحة وسلوك السباحة كقراءات وظيفية لتجديد الحبل الشوكي.

Abstract

نظرا لقدرتها التجديدية الشهيرة ، تعد أسماك الزرد البالغة نموذجا رائدا للفقاريات لاستجواب آليات تجديد الحبل الشوكي الفطري. بعد الانتقال الكامل للحبل الشوكي ، تقوم أسماك الزرد بتمديد الجسور الدبقية والمحورية عبر الأنسجة المقطوعة ، وتجديد الخلايا العصبية القريبة من الآفة ، واستعادة قدراتها على السباحة في غضون 8 أسابيع من الإصابة. وبالتالي فإن استعادة وظيفة السباحة هي قراءة مركزية لإصلاح الحبل الشوكي الوظيفي. هنا ، نصف مجموعة من الفحوصات السلوكية لتحديد سعة محرك الزرد داخل نفق سباحة مغلق. الهدف من هذه الطرق هو توفير قياسات قابلة للقياس الكمي لقدرة التحمل على السباحة وسلوك السباحة في أسماك الزرد البالغة. من أجل تحمل السباحة ، تتعرض أسماك الزرد لسرعة تيار مائي متزايدة باستمرار حتى الإرهاق ، ويتم الإبلاغ عن الوقت عند الإرهاق. لتقييم سلوك السباحة ، تخضع أسماك الزرد لسرعات تيار منخفض ويتم التقاط مقاطع فيديو السباحة مع منظر ظهري للأسماك. توفر النسبة المئوية للنشاط وتردد الانفجار والوقت المستغرق ضد تيار الماء قراءات قابلة للقياس الكمي لسلوك السباحة. قمنا بقياس قدرة التحمل على السباحة وسلوك السباحة في أسماك الزرد البرية قبل الإصابة وبعد نقل الحبل الشوكي. وجدنا أن الزرد يفقد وظيفة السباحة بعد نقل الحبل الشوكي ويستعيد تدريجيا هذه القدرة بين 2 و 6 أسابيع بعد الإصابة. يمكن تطبيق الطرق الموصوفة في هذه الدراسة على الدراسات السلوكية العصبية والعضلية الهيكلية وتجديد العضلات الهيكلية والتجديد العصبي في أسماك الزرد البالغة.

Introduction

تستخدم أسماك الزرد البالغة بشكل بارز للتحقيق في آليات التطور العصبي العضلي والعضلي الهيكلي ونمذجة ^{الأمراض1}،^2،3. الزرد قادرة على إصلاح فعال وعفوي للأنسجة المتعددة ، بما في ذلك الدماغ والحبل الشوكي والعضلات ^{الهيكلية4}،^5،6،7. إن القدرة الرائعة على تجديد الأنسجة العصبية العضلية والأمراض النموذجية تجذب مجتمعا علميا متناميا إلى أبحاث أسماك الزرد البالغة ^1،2،3. ومع ذلك ، في حين أن اختبارات الحركة وسلوك السباحة متاحة وموحدة لأسماك الزرد اليرقية ، هناك حاجة متزايدة لتطوير بروتوكولات مماثلة في الأسماك البالغة8،^9،10،11. الهدف من هذه الدراسة هو وصف بروتوكولات لتحديد قدرة التحمل على السباحة وسلوك السباحة في أسماك الزرد البالغة. نقدم هذه البروتوكولات في سياق أبحاث تجديد الحبل الشوكي. ومع ذلك ، فإن البروتوكولات السلوكية الموصوفة هنا تنطبق بنفس القدر على دراسات التجديد العصبي والعضلات ، والتطور العصبي العضلي والعضلي الهيكلي ، وكذلك نمذجة الأمراض العصبية العضلية والعضلية الهيكلية.

الزرد عكس الشلل في غضون 8 أسابيع من نقل الحبل الشوكي الكامل. على عكس الثدييات سيئة التجدد ، تعرض أسماك الزرد استجابات للإصابات المناعية والعصبية والدبقية الداعمة للتجدد المطلوبة لإصلاح الحبل الشوكي الوظيفي 12^،13،14. القراءة النهائية لإصلاح الحبل الشوكي الوظيفي هي قدرة الأنسجة المصابة على استعادة وظيفتها بعد الإصابة. تشمل مجموعة من الطرق الموحدة لتقييم التجديد الوظيفي في القوارض الاختبارات الحركية والحركية والحسية والحسية الحركية15،^16،17. تشمل الاختبارات المستخدمة على نطاق واسع في إصابة الحبل الشوكي للفأر مقياس باسو للماوس الحركي (BMS) ، واختبارات حركية الأطراف الأمامية ، والاختبارات الحسية اللمسية ، واختبارات المشي الحسي الحركي الشبكي ^15,17. وعلى النقيض من أنظمة أسماك الزرد الثديية أو اليرقات، فإن الاختبارات السلوكية في أسماك الزرد البالغة أقل تطورا، ولكنها مطلوبة بشدة لاستيعاب الاحتياجات المتزايدة لمجتمعات تجديد الأنسجة ونمذجة الأمراض.

يؤدي نقل الحبل الشوكي الكامل إلى شلل ذيلي كامل في موقع الإصابة. بعد فترة وجيزة من الإصابة ، تكون الحيوانات المشلولة أقل نشاطا وتتجنب السباحة قدر الإمكان. للتعويض عن القدرة المفقودة على السباحة ، تعرض الحيوانات المشلولة رشقات نارية قصيرة ومتكررة عن طريق الإفراط في استخدام زعانفها الصدرية ، والتي تقع على السطح للآفة. تؤدي استراتيجية السباحة التعويضية هذه إلى استنفاد سريع وانخفاض قدرة السباحة. مع تجدد الحبل الشوكي لسمك الزرد ، تستعيد الحيوانات وظيفة السباحة المتذبذبة الملساء الذيلية للآفة ، مما يسمح بزيادة القدرة على التحمل على السباحة وتحسين معلمات سلوك السباحة. هنا ، نصف طرقا لقياس قدرة أسماك الزرد على السباحة عند زيادة سرعات تيار الماء وسلوك السباحة بسرعات تيار منخفضة.

Protocol

تم الاحتفاظ بأسماك الزرد البالغة من سلالات Ekkwill و AB في المرفق الأساسي لأسماك الزرد بجامعة واشنطن. تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا للبروتوكولات الحيوانية المؤسسية IACUC.

ملاحظة: يظهر مثال على الإعداد التجريبي في الشكل 1A. يوضح الشكل 1B غطاء المعايرة (مخصص) وغطاء تحمل السباحة (مخصص) وغطاء سلوك السباحة (غطاء نفق قياسي مغلق). يتم عرض سير العمل التجريبي في الشكل 2.

1. إعداد نفق السباحة ومعايرته

1. املأ نفق السباحة والخزان العازل المحيط به بمياه نظام أسماك الزرد (10 لتر من المياه المصفاة ؛ القلوية: 50-150 مجم / لتر _CaCO3 ؛ الرقم الهيدروجيني: 6.8-7.5 ؛ درجة الحرارة: 26-28.5 درجة مئوية ؛ < النترات 50 مجم / لتر ؛ النتريت < 0.1 مجم / لتر ؛ والملوحة < 0.5-1 جم / لتر).
2. املأ خزان تدفق إضافي بمياه نظام الزرد (≈7.5 لتر). ضع نفق السباحة وخزان التدفق للسماح بتدفق مياه نظام الزرد الزائدة من الخزان العازل إلى خزان التدفق من خلال أنبوب تدفق مثبت على جانب الخزان العازل.
3. بمجرد ملء النفق والخزان العازل ، قم بما يلي.
   1. ضع مضخة التدفق داخل الخزان العازل وقم بتوصيلها بنفق السباحة المجاور باستخدام أنابيب PVC. ضع مضخة التدفق داخل خزان التدفق وقم بتوصيلها بجدار الخزان العازل.
   2. قم بتشغيل مضخة التدفق الموجودة داخل الخزان العازل ومضخة التدفق الموجودة في خزان التدفق لبدء دوران المياه.
      ملاحظة: سيضمن نظام المضخة المزدوجة التدفق المستمر للمياه إلى نفق السباحة (من مضخة التدفق) وإلى الخزان العازل (من مضخة التدفق من خلال).
   3. قم بإزالة أي فقاعات هواء محاصرة داخل نفق السباحة عن طريق زيادة سرعة تيار الماء تدريجيا من 10 سم / ثانية إلى 100 سم / ثانية على فترات 10 سم / ثانية. قلل السرعة مرة أخرى إلى 0 سم / ثانية في فترات من 10 سم / ثانية. للتحكم في سرعة التدفق، انقر فوق السهمين لأعلى ولأسفل في قسم السرعة في برنامج التحكم في سرعة التدفق (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: المحرك والدوار متصلان بالكمبيوتر المصاحب. يتواصل برنامج التحكم في سرعة التدفق مع المحرك لإنشاء سرعة التدفق المطلوبة. استخدام برنامج التحكم في سرعة التدفق اختياري. البديل هو التحكم يدويا في محرك تيار الماء.
4. المعايره
   ملاحظة: يلزم إجراء المعايرة قبل كل تجربة.
   1. استخدم غطاء المعايرة لإغلاق نفق السباحة.
      ملاحظة: يتم تخصيص غطاء المعايرة بفتحة مركزية معززة تناسب مسبار مقياس التدفق المستخدم في المعايرة (الشكل 1B). يتم استخدام ثمانية أجنحة لتأمين جميع الأغطية إلى النفق.
   2. قم بتشغيل مقياس التدفق الرقمي وقم بتوصيله بمسبار مقياس التدفق. ضع مسبار مقياس التدفق داخل نفق السباحة عبر غطاء المعايرة. ضع شفرات مسبار مقياس التدفق عموديا على اتجاه التدفق.
   3. قم بمعايرة خرج محرك نفق السباحة (الذي يتم التحكم فيه باستخدام برنامج التحكم في سرعة التدفق) باستخدام مقياس التدفق الرقمي. للقيام بذلك، قم بتنفيذ الخطوات التالية.
   4. افتح برنامج التحكم في سرعة التدفق وانقر فوق معايرة.
   5. قم بتغيير الخيارات الموجودة في الجزء العلوي الأيسر إلى RPM مقابل الجهد. قم بزيادة سرعة التدفق من 0 سم / ثانية إلى 100 سم / ثانية بزيادات قدرها 5 سم / ثانية ، عن طريق كتابة القيم في قسم السرعة في برنامج التحكم في سرعة التدفق. في كل خطوة ، انقر فوق الزر "+" وسجل السرعة الحالية المشار إليها بواسطة مقياس التدفق الرقمي.
      ملاحظة: يجب أن يكون للعلاقة الخطية الناتجة قيمة ^R2 قريبة من 1.
   6. لتأكيد المعايرة، قم بزيادة سرعات تيار الماء من 0 إلى 10 و 25 و 50 و 75 و 100 سم / ثانية ، ثم قم بتقليل السرعات إلى 75 و 50 و 25 و 10 سم / ثانية باستخدام السهمين لأعلى ولأسفل في قسم Uwater [سم / ثانية] من برنامج التحكم في سرعة التدفق. عند كل سرعة (من البرنامج) ، قم بقياس وتسجيل السرعة المقابلة المشار إليها بواسطة مقياس التدفق الرقمي.
   7. ضع في اعتبارك أن النفق تمت معايرته ودقته إذا كانت سرعات تيار الماء المقاسة ضمن انحراف قدره ±2 سم / ثانية. إذا كان الانحراف يتجاوز ±2 سم/ثانية، فكرر الخطوات من 1.4.4 إلى 1.4.6 لضمان المعايرة المناسبة.

2. تقييم القدرة على التحمل السباحة

ملاحظة: تنقسم المجموعات التجريبية إلى مجموعات من 10 أو أقل لتحمل السباحة.

1. قم بإعداد برنامج التحكم في سرعة التدفق.
   ملاحظة: استخدام برنامج التحكم في سرعة التدفق في هذا القسم اختياري. البديل هو التحكم يدويا في محرك تيار الماء. للتحكم اليدوي في تيار المياه، انتقل إلى الخطوة 2.3 وقم بزيادة سرعة تيار الماء يدويا بالزيادات المحددة في الخطوتين 2.5 و2.6.
   1. افتح برنامج التحكم في سرعة التدفق. انقر على المربع المسمى تجربة. قم بإلغاء تحديد Uswim و Uwater.
   2. قم بتغيير سرعة التدفق في مربع Uwater [cm/s] في أسفل اليسار لضبط سرعات تيار الماء.
   3. لبدء بروتوكول تلقائي ، انقر فوق المربع بدء التسجيل . في نافذة الحوار التي تفتح، اختر تلقائي من القائمة المنسدلة.
   4. لاختيار ملف بروتوكول تم حفظه مسبقا ، انقر فوق رمز الملف بجوار ملف البروتوكول لفتح البروتوكول المطلوب.
   5. قم بإعداد ملف الإخراج بالنقر فوق رمز الملف بجوار ملف السجل. في نافذة مستكشف الملفات التي تفتح ، قم بتسمية ملف الإخراج وحفظه في الموقع المطلوب.
2. قم بإعداد نافذة مؤقت دورة مقسمة. تأكد من الوصول المتزامن إلى برنامج التحكم في سرعة التدفق ونوافذ المؤقت على شاشة الكمبيوتر.
3. قم بإنشاء خزان لجمع الأسماك لإيواء الأسماك المنهكة بعد إزالتها من نفق السباحة. املأ خزان التجميع بماء نظام الزرد (0.75 لتر). املأ أنبوبا PVC طويلا بماء نظام الزرد.
   1. ضع أحد طرفي (النهاية 1) من أنبوب PVC المعبأ مسبقا في خزان التجميع والطرف الآخر (النهاية 2) في الخزان العازل. تأكد من أن المياه يمكن أن تتدفق بحرية من الخزان العازل إلى خزان التجميع.
   2. قم بتثبيت الطرف العلوي من أنبوب PVC (النهاية 2) بمشبك موثق لمنع تدفق المياه. استخدم مشبك الموثق للتحكم في تدفق المياه حسب الحاجة.
4. أغلق نفق السباحة باستخدام غطاء تحمل السباحة.
   ملاحظة: يتم تخصيص غطاء تحمل السباحة مع نافذة نفق السباحة لإزالة الأسماك المنهكة من نفق السباحة ، دون مقاطعة بقية الفحص (الشكل 1B).
5. ضع مجموعة واحدة من الأسماك داخل نفق السباحة. ابدأ تشغيل مؤقت الدورة المنقسمة أثناء ضبط السرعة الحالية إلى 0 سم / ثانية لمدة 5 دقائق ، و 9 سم / ثانية لمدة 5 دقائق ، و 10 سم / ثانية لمدة 5 دقائق عن طريق كتابة هذه القيم في قسم Uwater [سم / ثانية] من برنامج التحكم في سرعة التدفق.
   ملاحظة: ستؤدي هذه الخطوة إلى تأقلم الحيوانات مع نفق السباحة واتجاه التدفق.
6. بعد تأقلم الأسماك ، ابدأ برنامج التحكم الآلي في سرعة التدفق الذي سيزيد من سرعة تيار الماء بمقدار 2 سم / ثانية كل دقيقة.
   ملاحظة: سوف تسبح الأسماك حتى الإرهاق. يتم دفع الأسماك المنهكة نحو الطرف الخلفي من نفق السباحة.
7. عندما يتم استنفاد سمكة ، قم بفك أنبوب جمع الأسماك ، وافتح نافذة نفق السباحة واجمع الأسماك في خزان التجميع. سجل الوقت عند الإرهاق باستخدام مؤقت اللفة المقسمة.
   ملاحظة: يمكن للأسماك أن تنجرف أحيانا إلى الطرف الخلفي من نفق السباحة دون أن تستنفد. لضمان استنفاد السمكة ، انقر برفق على الطرف الخلفي من النفق أو قم بإنشاء ظل فوق تلك المنطقة لتحفيز الأسماك على السباحة. الأسماك المنهكة لا تستجيب لحافز الدهشة وتستلقي بشكل مسطح في الطرف الخلفي من النفق.
8. كرر الخطوة 2.7 حتى يتم استنفاد جميع الأسماك وجمعها في خزان التجميع. انقر فوق الزر إيقاف الطوارئ في برنامج التحكم في سرعة التدفق وأوقف المؤقت.
   ملاحظة: تحقق مرة أخرى طوال السباحة مما إذا كان عدد الأسماك التي تمت إزالتها من غرفة نفق السباحة يتطابق مع الأوقات المسجلة.
9. كرر الخطوات من 2.5 إلى 2.8 لكل مجموعة من الأسماك.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ، ولكن لكي تكون دقيقا إلى النقطة الزمنية بعد الإصابة ، يوصى بإجراء الأفلام والسباحة في التحمل في نفس اليوم. يمكن أن يستمر النفق في الدوران أثناء إيقاف التجارب مؤقتا.

3. التقاط مقاطع فيديو لفحص سلوك السباحة

ملاحظة: يمكن تتبع ما يصل إلى خمسة فقط في المرة الواحدة. إذا كانت المجموعات التجريبية أكبر من خمسة حيوانات، يمكن التقاط مقاطع فيديو متعددة لكل مجموعة، حيث يتتبع الفيديو الأول خمسة أو أقل ويتتبع الفيديو الثاني الحيوانات الخمسة الأخرى أو أقل. بالنسبة للدراسات الطولية التي تهدف إلى تتبع الحيوانات الفردية بمرور الوقت ، يمكن إيواء الأسماك بشكل فردي وتتبعها عبر نقاط زمنية متعددة. تتوفر جميع البرامج النصية للتتبع والتحليل عبر GitHub (انظر جدول المواد).

1. قم بتشغيل لوحة ضوء الأشعة تحت الحمراء الموجودة أسفل نفق السباحة. قم بتأمين الكاميرا على حامل السقف أعلى نفق السباحة. اضبط حلقات التركيز البؤري وفتحة العدسة.
   ملاحظة: تعتمد إعدادات التركيز البؤري وفتحة العدسة على المسافة بين الكاميرا ونفق السباحة، بالإضافة إلى بيئة الإضاءة.
2. افتح برنامج تسجيل الكاميرا (انظر جدول المواد). قم بتعيين إعدادات البرنامج على النحو التالي.
   1. انقر فوق شاشة العرض 1:4. تأكد من أن مجال الرؤية يغطي نفق السباحة بأكمله. قم بإيقاف تشغيل التباين التلقائي وتوازن اللون الأبيض التلقائي لتطبيع الخلفية والتباين عبر المجموعات.
   2. افتح نافذة خصائص الكاميرا بالنقر فوق رمز مفتاح الربط. اضبط المعلمات على النحو التالي: ساعة البكسل: 344 ميجاهرتز ، معدل الإطارات: 70 إطارا في الثانية ، انقر فوق المربع بجوار الانتظار للتحقق منه ، وقت التعرض: 0.290 مللي ثانية. لا تغلق هذه النافذة.
   3. قم باقتصاص نافذة التسجيل لتغطية غرفة السباحة في النفق فقط عن طريق إمالة/تدوير الكاميرا حسب الحاجة.
3. افتح نافذة التسجيل بالنقر فوق أيقونة بكرة الفيلم. اضبط إعدادات التسجيل على النحو التالي:
   1. حدد المربع الخاص بالحد الأقصى لعدد الإطارات.
   2. أدخل يدويا 63000 لعدد الإطارات.
   3. حدد المربع الخاص بمعدل إطارات Calc. يسمح هذا للبرنامج بسحب معدل الإطارات المحدد في الخطوة 3.2.2 (70 إطارا في الثانية).
   4. تغيير جودة JPEG إلى 30.
4. تسجيل تشغيل تجريبي.
   1. انقر فوق إنشاء وتسمية الملف الجديد اختبار وحفظه على سطح المكتب.
   2. ارجع إلى نافذة التسجيل وانقر على تسجيل. دع فيلم الاختبار يعمل طوال مدة البروتوكول (15 دقيقة).
   3. بمجرد الانتهاء من الاختبار ، تأكد من عدم وجود إطارات متساقطة وتسجيل 63000 إطار.
5. ضع مجموعة من الأسماك في نفق السباحة وأغلق النفق باستخدام غطاء قياسي مغلق بالكامل (الشكل 1B).
   ملاحظة: تأكد من وجود جميع الأسماك في النفق قبل تشديد الغطاء بالكامل. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء تحت الغطاء. هذا سيؤثر على النتائج.
6. افتح نافذة تسجيل جديدة وقم بتسمية الملف. مثال: 2_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi
   ملاحظة: تأكد من أن الإعدادات وفقا للمعلمات في الخطوتين 3.2 و 3.3. ستعود جودة JPEG دائما إلى الوضع الافتراضي وتحتاج إلى إعادة تعيين لكل فيلم جديد.
   تنبيه: لا تنقر فوق سجل بعد.
7. ابدأ تجربة جديدة باستخدام برنامج التحكم في سرعة التدفق.
   ملاحظة: لبدء بروتوكول تلقائي انقر فوق المربع بدء التسجيل . في نافذة الحوار التي تفتح، اختر تلقائي من القائمة المنسدلة. لاختيار ملف بروتوكول تم حفظه مسبقا ، انقر فوق رمز الملف بجوار ملف البروتوكول لفتح البروتوكول المطلوب.
   1. لبدء بروتوكول يدوي، اضبط سرعة التدفق على 0 سم/ثانية لمدة 5 دقائق، و10 سم/ثانية لمدة 5 دقائق، متبوعة ب 20 سم/ثانية لمدة 5 دقائق باستخدام مربع Uwater [cm/s] في برنامج التحكم في سرعة التدفق.
   2. احفظ ملف إخراج البيانات الجديد (سيتم حفظه كملف .csv) بنفس اسم ملف الفيلم وفي نفس المجلد.
      تنبيه: لا تنقر فوق ابدأ بعد.
8. ضع منشفة ورقية أو قطعة قماش على جانب نفق السباحة للتأكد من أن جميع السلوكيات ناتجة عن سباحة الأسماك وليس بسبب استجابة مذهلة ناجمة عن الحركة في البيئة.
9. في تتابع سريع ، تأكد من أن الماء هادئ ولا توجد تموجات تتحرك عبر الإطار. انقر فوق تسجيل في نافذة برنامج الكاميرا لبدء تسجيل ملف الفيلم. انقر فوق ابدأ في برنامج التحكم في سرعة التدفق لبدء البروتوكول، والذي سيستمر دون انقطاع.
10. شاهد الفيلم للتأكد من عدم إسقاط أي إطارات ، وعدم وجود فقاعات في مجال الرؤية ، وتسجيل جميع الأسماك.
11. بمجرد اكتمال تسجيل الفيلم ، انقر فوق إيقاف الطوارئ لإنهاء بروتوكول التحكم في سرعة التدفق. تحقق من ملف إخراج البيانات الذي يتم حفظه تلقائيا. انقر فوق إغلاق في نافذة التسجيل لحفظ ملف الفيلم.
12. قم بإزالة الغطاء. استرجع الأسماك بعناية وأعادها إلى خزانها.
13. كرر الخطوات من 3.5 إلى 3.12 لكافة مجموعات الأسماك.
14. بمجرد الانتهاء من تسجيل الفيلم لجميع المجموعات ، قم بتحويل الأفلام من مقاطع فيديو بمعدل 70 إطارا في الثانية إلى مقاطع فيديو بمعدل 20 إطارا في الثانية باستخدام MovieProcessing_v5.bat النص. للقيام بذلك ، انقل ملف البرنامج النصي إلى المجلد الذي يحتوي على مقاطع الفيديو الخام. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الملف واختر تشغيل.
    ملاحظة: يتم تشغيل البرنامج النصي تلقائيا. ستظهر نافذة موجه الأوامر التي تعرض تقدم البرنامج النصي. الخطوة أعلاه اختيارية. فهو يقلل من عدد الإطارات في فيديو مدته 15 دقيقة من 63000 إلى 18000 إطار ويجعل SwimBehavior_v7. تشغيل البرنامج النصي R بسرعة أكبر.
15. إفراغ النفق ووضع بعيدا جميع المعدات.

4. تحليل الأفلام لتقييم سلوك السباحة

ملاحظة: يمكن إكمال تسجيل الأفلام وتحليلها في أيام منفصلة.

1. افتح البرنامج النصي Tracking_v2.ijm في فيجي وانقر فوق تشغيل لبدء تشغيل البرنامج. في النافذة المنبثقة، اختر المجلد الذي يحتوي على أفلام سلوك السباحة لتعقبها وانقر فوق فتح. ابحث عن الإطار 1 من الفيلم الأول ومربع حوار ومدير منطقة الاهتمام (ROI) الذي سيظهر.
2. اتبع الإرشادات الواردة في مربع الحوار. قم بإنشاء عائد استثمار لأسفل غرفة نفق السباحة وانقر فوق موافق. تأكد من عدم رؤية أي زوايا سوداء.
   ملاحظة: سيتم فتح نافذة العتبة جنبا إلى جنب مع إطار 1 معدل.
3. قم بتغيير نظام الألوان من B&W إلى الأحمر. اضبط القيمة القصوى حتى يظهر الإطار 1 الأسماك باللون الأحمر ولا شيء آخر. سجل العتبة. انقر فوق موافق في مربع الحوار.
   ملاحظة: سيتم تشغيل البرنامج تلقائيا. سيتم تحديد عائد الاستثمار الذي تم إجراؤه للإطار 1 باستمرار وغير محدد للإطارات اللاحقة. وسيراقب شريط التقدم العملية في الزاوية السفلية اليسرى من نافذة فيجي . يستغرق التتبع حوالي 40 دقيقة لكل فيلم. عندما يتم تتبع جميع الأفلام ، سيتوقف برنامج فيجي . سيتوقف تحديد عائد الاستثمار. سيحتوي المجلد الذي يحتوي على الأفلام الآن على ملف _raw.csv لكل فيلم. يمكن إغلاق فيجي في هذه المرحلة.
4. محاذاة الإحصاءات الوصفية وتجميعها والحصول عليها
   1. افتح Behavior_v7 السباحة. R النص في R ستوديو.
   2. انقر فوق المصدر في الزاوية العلوية اليمنى من قسم البرنامج النصي. في نافذة جديدة تفتح، اختر المجلد الذي يحتوي على الملفات _raw.csv التي أنشأتها فيجي. انقر فوق فتح.
      ملاحظة: سيتم تشغيل البرنامج تلقائيا.
   3. في مربع حوار ينبثق يطلب تأكيد عدد الأسماك في كل فيلم، انقر فوق نعم إذا كانت الأرقام الواردة صحيحة، أو انقر فوق لا إذا كانت الأرقام غير صحيحة.
      ملاحظة: إذا تم النقر فوق "لا " ، فستظهر رسالة منبثقة تطلب إعادة تتبع الأفلام باستخدام عائد استثمار وعتبة جديدين. إذا تم النقر فوق نعم ، فسيستمر البرنامج.
   4. في النافذة الجديدة التي تفتح للسؤال عما إذا كان يجب إزالة الأسماك غير السباحة، انقر فوق نعم أو لا.
      ملاحظة: تعرف الأسماك غير السباحة بأنها الأسماك ذات النشاط الأقل من 50٪ عند 10 سم / ثانية. لا ينصح بإزالة الأسماك غير السباحة.
   5. في نافذة منبثقة جديدة تسأل عما إذا كانت المجموعات غير عمياء وما إذا كان المستخدم يرغب في الجمع بين أي مجموعات أو إلغاء التعمية أو دمج المجموعات إذا كان هناك أكثر من مجموعة تحكم واحدة.
   6. بعد إعطاء إجابة للسؤال السابق ، تأكد من أن البرنامج يعطي رسالة محاذاة الملف X من Y ، حيث X هو الملف الحالي الذي تتم محاذاته و Y هو إجمالي عدد الملفات المراد محاذاتها. يستغرق الأمر حوالي 30 ثانية لمحاذاة كل ملف.
5. بمجرد محاذاة الملفات، تحقق من وجود ملف .csv جديد تم إنشاؤه بنفس الاسم (_aligned.csv). تأكد من أن البرنامج يجمع بين البيانات ويقوم بتشغيل الإحصاءات ورسم الرسوم البيانية للمخرجات. تحقق من ملفات التحليل التي تم إنشاؤها في مجلد جديد يسمى النتائج داخل المجلد الأصل الذي يحتوي على _raw.csv وملفات _aligned.csv .
6. ضمن مجلد النتائج ، تحقق من وجود مجلدين باسم التشخيصات والرسوم البيانية وأربعة ملفات .csv المسماة BulkData_Avg BulkData_Full SummaryData_Avg SummaryData_Full.
   ملاحظة: يحتوي SummaryData_Full.csv على البيانات الفردية لكل سمكة في كل مجموعة في كل نقطة زمنية. يتم رسم هذه البيانات تلقائيا ولكن يمكن استخراجها ورسمها في مكان آخر.
   1. تأكد من أن مجلد الرسوم البيانية يحتوي على الرسوم البيانية التي تم إنشاؤها بواسطة البرنامج .csv الملفات التي تحتوي على نقاط البيانات لكل رسم بياني.
   2. تأكد من أن مجلد "بيانات التشخيص" يحتوي على ملف .csv واحد يحتوي على بيانات تشخيصية للملفات المحاذاة.
      ملاحظة: تتضمن الأعمدة الموجودة في ملف .csv التشخيصات ما يلي: أ) عدد الإطارات التي تحتوي على كائنات إضافية، والتي يجب أن تكون أقل من 100. تشير الكثير من الإطارات التي تحتوي على كائنات إضافية إلى وجود مشكلة في التتبع. ب)عدد الإطارات التي تحتوي على كائنات مفقودة أو مدمجة. من الطبيعي أن يكون هذا المقياس مرتفعا. غالبا ما يتم اجتياح الأسماك التي لم تتجدد بشكل جيد إلى الجزء الخلفي من النفق وسيتم احتسابها على أنها مفقودة. ج) إطارات مع أكثر من 240 بكسل يقفز. يزداد هذا العدد مع عدد الكائنات (الأسماك) في فيلم واحد. يتم توفير شرح مفصل لكيفية حساب مقاييس السلوك في الملف التكميلي 1.

النتائج

أنشأنا نفق السباحة كما هو موضح في القسم 1 من هذا البروتوكول (الشكل 1). قمنا بتقييم قدرة التحمل على السباحة (القسم 2 من هذا البروتوكول) وكذلك سلوك السباحة (القسمان 3 و 4 من هذا البروتوكول) لأسماك الزرد البالغة عند خط الأساس وبعد إصابة الحبل الشوكي (الشكل 2).

Discussion

الزرد البالغ هو نظام فقاري شائع لنمذجة الأمراض البشرية ودراسة آليات تجديد الأنسجة. لقد أحدث تحرير الجينوم CRISPR/Cas9 ثورة في الدراسات الجينية العكسية لنمذجة المرض في أسماك الزرد. ومع ذلك، فإن التحديات البيولوجية والتقنية أعاقت علم الوراثة على نطاق واسع في أسماك الزرد البالغة، بما في ذلك عدم ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AutoSwim software	Loligo Systems	MI10000	Optional - for Automatic control of current velocity
Customized lid	Loligo Systems	MI10001	This customized lid is used for swim endurance
DAQ-BT	Loligo Systems	SW10600	Optional - for Automatic control of current velocity
Eheim pump	Loligo Systems	PU10160	20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank.
Fiji	Fiji	Freely available through Image J (Fiji)	Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior
Flowtherm	Loligo Systems	AC10000	Handheld digital flow meter - for calibration
High Speed Camera	Loligo Systems	VE10380	USB 3.0 color video camera (4MP)
IR light panel	Loligo Systems	VE10775	450 x 210 mm, placed under the swim tunnel  chamber
Monofocal lens	Loligo Systems	VE10388	25mm manual lens
PVC Tubing	VWR	60985-534	5/16 x 7/16"  Wall thickness: 1/16"
R Studio	R Studio	Freely available. Version 3.6 with extra packages.	Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior
Swim tunnel respirometer	Loligo Systems	SW10060	5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration
uEye Cockpit	IDS	Freely available software to control camera parameters	Alternative cameras and accompanying softwares could be used
Vane wheel flow probe	Loligo Systems	AC10002	Digital flow probe - for calibration