הערכה של סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדגי זברה בוגרים

Summary

דגי זברה בוגרים, המסוגלים להחלמה תפקודית לאחר פגיעה בחוט השדרה, הם מערכת מודלים מובילה להבהרת מנגנונים מולדים של התחדשות עצבית. כאן, אנו מתארים סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדיקות כמו קריאות פונקציונליות של התחדשות חוט השדרה.

Abstract

בשל יכולת ההתחדשות המפורסמת שלהם, דגי זברה בוגרים הם מודל מוביל של בעלי חוליות לחקור מנגנונים של התחדשות מולדת של חוט השדרה. לאחר העברה מלאה של חוט השדרה שלהם, דגי זברה מרחיבים גשרי גליה ואקסונל על פני רקמות קטועות, מחדשים נוירונים קרובים לנגע, ומחזירים את יכולות השחייה שלהם תוך 8 שבועות מפציעה. התאוששות של תפקוד השחייה היא אפוא קריאה מרכזית לתיקון חוט השדרה תפקודי. כאן, אנו מתארים סדרה של בדיקות התנהגותיות כדי לכמת את יכולת המנוע של דגי הזברה בתוך מנהרת שחייה סגורה. מטרתן של שיטות אלה היא לספק מדידות הניתנות לכימות של סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדגי זברה בוגרים. עבור סיבולת שחייה, דגי זברה נתונים למהירות זרם מים גדלה כל הזמן עד תשישות, וזמן תשישות מדווח. להערכת התנהגות השחייה, דגי זברה נתונים למהירויות זרם נמוכות וסרטוני שחייה נלכדים עם מבט גב של הדגים. פעילות אחוזים, תדירות התפרצות וזמן שהושקע כנגד זרם המים מספקים קריאות הניתנות לכימות של התנהגות השחייה. כימתנו סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדגי זברה מסוג בר לפני פציעה ואחרי מעבר חוט השדרה. גילינו שדגי זברה מאבדים את תפקוד השחייה לאחר מעבר חוט השדרה ומחזירים בהדרגה את היכולת הזו בין שבועיים לשישה שבועות לאחר הפציעה. השיטות המתוארות במחקר זה ניתן ליישם neurobehavioral, שרירים ושלד, התחדשות שרירי השלד, ומחקרי התחדשות עצבית בדגי זברה בוגרים.

Introduction

דגי זברה בוגרים משמשים באופן בולט כדי לחקור מנגנונים של התפתחות שרירית שרירית ושרירים ושלד ומודלים של מחלות ^1,2,3. דגי זברה מסוגלים לבצע תיקון יעיל וספונטני של רקמות מרובות, כולל המוח, חוט השדרה ושרירי ^{השלד4,5,6,7}. היכולת המדהימה לחדש רקמות נוירו-שריריות ומחלות מודל מושכת קהילה מדעית הולכת וגדלה למחקר דגי זברה למבוגרים1,2,3. עם זאת, בעוד בדיקות של תנועה והתנהגות לשחות זמינים סטנדרטיים עבור דגי זברה זחליים, יש צורך גובר לפתח פרוטוקולים אנלוגיים דגים בוגרים8,9,10,11^. מטרת המחקר היא לתאר פרוטוקולים לכמת סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדגי זברה בוגרים. אנו מציגים פרוטוקולים אלה בהקשר של מחקר התחדשות חוט השדרה. עם זאת, הפרוטוקולים ההתנהגותיים המתוארים כאן ישימים באותה מידה למחקרים של התחדשות עצבית ושרירים, התפתחות עצבית שרירית ושרירים ושלד, כמו גם מודלים של מחלות שריריות ושרירים ושלד.

שיתוק הפוך של דגי זברה תוך 8 שבועות מהעברת חוט השדרה המלאה. שלא כמו יונקים מתחדשים בצורה גרועה, דגי זברה מציגים תגובות לפגיעה חיסונית, עצבית וגלייתית פרו-רגנרטיביות הנדרשות לתיקון תפקודי של חוט השדרה 12,13,14. קריאה אולטימטיבית של תיקון חוט השדרה תפקודי היא היכולת של הרקמה הנגעה לחזור לתפקודה לאחר פציעה. חבילה של שיטות סטנדרטיות להערכת התחדשות תפקודית במכרסמים כוללת בדיקות לוקומוטור, מנוע, חושים וסנסימוטורים15,16,17. בדיקות נפוצות בפגיעה בחוט השדרה של העכבר כוללות את סולם העכברים של לוקומוטור באסו (BMS), בדיקות מוטוריות מקדימות, בדיקות חושיות מישוש ובדיקות סנסורימוטורי הליכה ^{ברשת15,17}. בניגוד למערכות של דגי זברה יונקים או זחלים, בדיקות התנהגותיות בדגי זברה בוגרים פחות מפותחות, אך נחוצות מאוד כדי להתאים לצרכים הגדלים של קהילות התחדשות הרקמות ומודול מחלות.

עבירות שלמות בחוט השדרה גורמות לשיתוק מוחלט באתר הפציעה. זמן קצר לאחר הפציעה, בעלי חיים משותקים פחות פעילים ונמנעים משחייה ככל האפשר. כדי לפצות על אובדן כושר השחייה, בעלי חיים משותקים מציגים התפרצויות קצרות ותכופות על ידי שימוש יתר בסנפירי החזה שלהם, השוכנים רוסטרלי לנגע. אסטרטגיית שחייה מפצה זו גורמת לתשישות מהירה ולקיבולת שחייה נמוכה יותר. ככל שחוט השדרה של דגי הזברה מתחדש, בעלי החיים חוזרים לתפקוד שחייה תנודתי חלק עד הנגע, מה שמאפשר סיבולת שחייה מוגברת ופרמטרים משופרים של התנהגות השחייה. כאן, אנו מתארים שיטות לכמת סיבולת שחייה של דגי זברה בהגדלת מהירויות זרם המים והתנהגות השחייה במהירויות זרם נמוכות.

Protocol

דגי זברה בוגרים של זני אקוויל ו- AB נשמרו במתקן הליבה של דגי הזברה באוניברסיטת וושינגטון. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים המוסדיים של IACUC בבעלי חיים.

הערה: דוגמה להתקנה הניסיונית מוצגת באיור 1A. מכסה הכיול (מותאם אישית), מכסה סיבולת השחייה (מותאם אישית) ומכסה התנהגות השחייה (מכסה מנהרה סטנדרטי וסגור) מוצגים באיור 1B. זרימת העבודה הניסיונית מוצגת באיור 2.

1. הכנה וכיול מנהרת שחייה

1. מלא את מנהרת השחייה ואת מיכל החיץ שמסביב במי מערכת דגי זברה (10 L מסוננים מים; אלקליניות: 50-150 מ"ג / L _CaCO3; pH: 6.8-7.5; טמפרטורה: 26-28.5 °C (26 °F; חנקות < 50 מ"ג / ליטר; ניטריט < 0.1 מ"ג / ליטר; ומליחות < 0.5-1 גרם / ליטר).
2. מלאו מיכל זרימה נוסף במי מערכת דגי זברה (≈7.5 ליטר). מקם את מנהרת השחייה ואת מיכל הזרימה כדי לאפשר עודף מי מערכת דגי זברה לזרום ממיכל החיץ למיכל הזרימה דרך צינור זרימה מאובטח בצד של מיכל החיץ.
3. לאחר מילוי המנהרה ומיכל החיץ, בצע את הפעולות הבאות.
   1. מקם את משאבת הסומק בתוך מיכל החיץ וחבר אותה למנהרת השחייה הסמוכה עם צינורות PVC. הנח את משאבת הזרימה בתוך מיכל הזרימה וחבר אותה לקיר מיכל החיץ.
   2. הפעל את משאבת הסומק הממוקמת בתוך מיכל החיץ ואת משאבת הזרימה הממוקמת במיכל הזרימה כדי להתחיל את זרימת המים.
      הערה: מערכת המשאבה הכפולה תבטיח זרימת מים רציפה למנהרת השחייה (ממשאבת השטיפה) ולמיכל החיץ (ממשאבת הזרימה).
   3. נקה את כל בועות האוויר שנלכדו בתוך מנהרת השחייה על ידי הגדלה הדרגתית של מהירות זרם המים מ-10 ס"מ/ש' ל-100 ס"מ לשנייה במרווחים של 10 ס"מ לשנייה. להקטין את המהירות בחזרה ל 0 ס"מ / s במרווחים של 10 ס"מ / ש'. לשליטה במהירות הזרימה, לחצו על החצים למעלה ולמטה במקטע מהירות של תוכנת בקרת מהירות הזרימה (ראו טבלת חומרים).
      הערה: המנוע והרוטור מחוברים למחשב המצורף. תוכנת בקרת מהירות הזרימה מתקשרת עם המנוע כדי ליצור את מהירות הזרימה הרצויה. השימוש בתוכנת בקרת מהירות הזרימה הוא אופציונלי. החלופה היא לשלוט באופן ידני במנוע זרם המים.
4. כיול
   הערה: יש צורך בכיול לפני כל ניסוי.
   1. השתמש במכסה הכיול כדי לסגור את מנהרת השחייה.
      הערה: מכסה הכיול מותאם אישית עם פתח מרכזי מחוזק שמתאים לבדיקת מד הזרימה המשמשת לכיול (איור 1B). שמונה כנפיים משמשים לאבטחת כל המכסים למנהרה.
   2. הפעל את מד הזרימה הדיגיטלי וחבר אותו לבדיקת מד הזרימה. מקם את גשושית מד הזרימה בתוך מנהרת השחייה דרך מכסה הכיול. מקם את הלהבים של גשושית מד הזרימה בניצב לכיוון הזרימה.
   3. כייל את הפלט של מנוע מנהרת השחייה (הנשלט באמצעות תוכנת בקרת מהירות הזרימה) באמצעות מד הזרימה הדיגיטלי. לשם כך, בצע את השלבים הבאים.
   4. פתח את תוכנת בקרת מהירות הזרימה ולחץ על כיול.
   5. שנה את האפשרויות בפינה הימנית העליונה לסל"ד לעומת מתח. הגדל את מהירות הזרימה מ- 0 ס"מ/ ש' ל- 100 ס"מ/ ש' במרווחים של 5 ס"מ/ s, על-ידי הקלדת הערכים במקטע המהירות של תוכנת בקרת מהירות הזרימה. בכל שלב, לחץ על לחצן "+" והקלט את המהירות הנוכחית המצוינת על-ידי מד הזרימה הדיגיטלי.
      הערה: קשר הגומלין הליניארי שנוצר צריך לכלול ערך ^R2 קרוב ל- 1.
   6. כדי לאשר כיול, הגדל את מהירויות זרם המים מ- 0 ל- 10, 25, 50, 75 ו- 100 ס"מ / s ולאחר מכן הקטן את המהירויות ל- 75, 50, 25, 10 ס"מ / s באמצעות החצים למעלה ולמטה בחלק Uwater [cm/s] של תוכנת בקרת מהירות הזרימה. בכל מהירות (מהתוכנה), מודדים ומתעדים את המהירות המתאימה המצוינת על ידי מד הזרימה הדיגיטלי.
   7. קחו בחשבון את המנהרה מכוילת ומדויקת אם מהירויות זרם המים הנמדדות נמצאות בתוך סטייה של ±2 ס"מ לשנייה. אם הסטייה חורגת ±2 ס"מ לשנייה, חזור על שלבים 1.4.4 עד 1.4.6 כדי להבטיח כיול תקין.

2. הערכה של סיבולת שחייה

הערה: קבוצות ניסיוניות מחולקות לקבוצות של 10 בעלי חיים או פחות לסיבולת שחייה.

1. הגדר את תוכנת בקרת מהירות הזרימה.
   הערה: השימוש בתוכנת בקרת מהירות הזרימה בסעיף זה הוא אופציונלי. החלופה היא לשלוט באופן ידני במנוע זרם המים. לשליטה ידנית בזרם המים, המשך לשלב 2.3 והגדל ידנית את מהירות זרם המים במרווחים שצוינו בשלבים 2.5 ו- 2.6.
   1. פתח את תוכנת בקרת מהירות הזרימה. לחץ על התיבה הנקראת ניסוי. בטל את הסימון של אוסווים ואווטר.
   2. שנה את מהירות הזרימה בתיבה Uwater [cm/s] בפינה השמאלית התחתונה להתאמת מהירויות זרם המים.
   3. כדי להתחיל פרוטוקול אוטומטי, לחץ על התיבה התחל רישום . בחלון הדו-שיח שנפתח, בחר אוטומטי מהרשימה הנפתחת.
   4. כדי לבחור קובץ פרוטוקול שנשמר בעבר, לחץ על סמל הקובץ לצד קובץ פרוטוקול כדי לפתוח את הפרוטוקול הרצוי.
   5. הגדר את קובץ הפלט על-ידי לחיצה על סמל הקובץ לצד קובץ יומן הרישום. בחלון סייר הקבצים שנפתח, תן שם לקובץ הפלט ושמור אותו במיקום הרצוי.
2. הגדרת חלון טיימר הקפה מפוצל. הקפד לקבל גישה בו-זמנית לתוכנת בקרת מהירות הזרימה ולחלונות הטיימר על מסך המחשב.
3. להקים מיכל איסוף דגים כדי לאכלס דגים מותשים לאחר הסרתם ממנהרת השחייה. מלאו את מיכל האיסוף במי מערכת דגי זברה (0.75 ליטר). מלאו צינור PVC ארוך במי מערכת דגי זברה.
   1. מקם קצה אחד (סוף 1) של צינור ה- PVC הממולא מראש במיכל האיסוף ואת הקצה השני (סוף 2) במיכל החיץ. ודא שמים יכולים לזרום בחופשיות ממיכל החיץ למיכל האיסוף.
   2. מהדקים את הקצה העליון של שפופרת PVC (סוף 2) עם קליפ קלסר למניעת זרימת מים. השתמש במהדק הקלסר כדי לשלוט ביציאת המים לפי הצורך.
4. סגור את מנהרת השחייה באמצעות מכסה סיבולת השחייה.
   הערה: מכסה סיבולת השחייה מותאם אישית עם חלון מנהרת שחייה כדי להסיר דגים מותשים ממנהרת השחייה, מבלי להפריע לשאר הבדיקה (איור 1B).
5. מניחים קבוצה אחת של דגים בתוך מנהרת השחייה. הפעל את טיימר ההקפה המפוצל תוך התאמת מהירות הזרם ל- 0 ס"מ/ש' למשך 5 דקות, 9 ס"מ/ש' למשך 5 דקות ו- 10 ס"מ/ש' למשך 5 דקות על-ידי הקלדת ערכים אלה במקטע Uwater [cm/s] של תוכנת בקרת מהירות הזרימה.
   הערה: שלב זה יתאקלם בעלי חיים למנהרת השחייה וכיוון הזרימה.
6. לאחר התאקלמות הדגים, התחל את תוכנית בקרת מהירות הזרימה האוטומטית שתגדיל את מהירות זרם המים ב -2 ס"מ / ש 'בכל דקה.
   הערה: דגים ישחו עד תשישות. דגים מותשים נדחפים לכיוון הקצה האחורי של מנהרת השחייה.
7. כאשר דג מותש, בטלו את צינור איסוף הדגים, פתחו את חלון מנהרת השחייה ואספו את הדגים במיכל האיסוף. הקלט את השעה בתשישות באמצעות טיימר ההקפה המפוצל.
   הערה: דגים יכולים מדי פעם להיסחף לקצה האחורי של מנהרת השחייה מבלי להיות מותשים. כדי להבטיח שהדגים מותשים, הקישו בעדינות על הקצה האחורי של המנהרה או צרו צל מעל אזור זה כדי לעורר את הדגים לשחות. דגים מותשים אינם מגיבים לגירוי המבהיל ושוכבים שטוחים בקצה האחורי של המנהרה.
8. חזור על שלב 2.7 עד שכל הדגים מותשים ונאספים במיכל האיסוף. לחץ על לחצן עצירת חירום בתוכנת בקרת מהירות הזרימה והפסק את הטיימר.
   הערה: בדקו פעמיים לאורך השחייה אם מספר הדגים שהוצאו מתא מנהרת השחייה תואם את הזמנים שתועדו.
9. חזור על שלבים 2.5 עד 2.8 עבור כל קבוצת דגים.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, אך ליתר דיוק עד לנקודת הזמן לאחר הפציעה, מומלץ לבצע סרטים ושחיות סיבולת באותו יום. המנהרה יכולה להמשיך להסתובב בזמן שהניסויים מושהים.

3. לכידת קטעי וידאו לבדיקת התנהגות שחייה

הערה: ניתן לעקוב אחר עד חמישה בעלי חיים בלבד בכל פעם. אם קבוצות ניסוי גדולות מחמש חיות, ניתן לצלם סרטונים מרובים עבור כל קבוצה, כאשר הסרטון הראשון עוקב אחר חמש חיות או פחות והסרטון השני עוקב אחר חמש החיות האחרות או פחות. עבור מחקרים אורכיים שמטרתם לעקוב אחר בעלי חיים בודדים לאורך זמן, דגים יכולים להיות מאוחסנים בנפרד ומעקב על פני נקודות זמן מרובות. כל הסקריפטים למעקב וניתוח זמינים באמצעות GitHub (ראה טבלת חומרים).

1. הפעל את לוח האור אינפרא אדום הממוקם מתחת למנהרת השחייה. אבטחו את המצלמה על מתקן התקרה מעל מנהרת השחייה. התאם את המיקוד ואת טבעות הצמצם.
   הערה: הגדרות המיקוד והצמצם תלויות במרחק בין המצלמה למנהרת השחייה, כמו גם בסביבת האור.
2. פתח את תוכנת הקלטת המצלמה (ראה טבלת חומרים). הגדר את הגדרות התוכנה באופן הבא.
   1. לחץ על תצוגת ההיבטים של 1:4. ודא ששדה הראייה מכסה את כל מנהרת השחייה. בטל את הניגודיות האוטומטית ואת האיזון הלבן האוטומטי כדי לנרמל את הרקע והניגודיות בין קבוצות.
   2. פתח את החלון מאפייני מצלמה על-ידי לחיצה על סמל מפתח הברגים. הגדר את הפרמטרים כדלקמן: שעון פיקסל: 344 MHz, קצב פריימים: 70 fps, לחץ על התיבה לצד החזק כדי לבדוק את זה, זמן חשיפה: 0.290 אלפיות השנייה. אל תסגור חלון זה.
   3. חתוך את חלון ההקלטה כדי לכסות רק את תא השחייה של המנהרה על-ידי הטיה/סיבוב המצלמה לפי הצורך.
3. פתח את חלון ההקלטה על-ידי לחיצה על סמל סליל הסרט. הגדר את הגדרות ההקלטה באופן הבא:
   1. סמן את התיבה עבור המספר המרבי של מסגרות.
   2. הזן ידנית 63,000 עבור מספר המסגרות.
   3. סמן את התיבה עבור חישוב קצב פריימים. פעולה זו מאפשרת לתוכנית למשוך את קצב הפריימים המוגדר בשלב 3.2.2 (70 fps).
   4. שנה את איכות JPEG ל - 30.
4. הקלט ריצת מבחן.
   1. לחץ על צור ושם לקובץ החדש בדוק ושמור אותו בשולחן העבודה.
   2. חזור לחלון ההקלטה ולחץ על הקלט. תן לסרט הבדיקה לפעול לכל משך הפרוטוקול (15 דקות).
   3. לאחר סיום הבדיקה, ודא כי אין מסגרות שהושמטו וכי 63,000 מסגרות נרשמות.
5. הניחו קבוצת דגים במנהרת השחייה וסגרו את המנהרה באמצעות מכסה סגור לחלוטין (איור 1B).
   הערה: ודאו שכל הדגים נמצאים במנהרה לפני הידוק מלא של המכסה. ודא שאין בועות אוויר מתחת למכסה. הדבר ישפיע אחרת על התוצאות.
6. פתח חלון הקלטה חדש ותן שם לקובץ. דוגמה: 2_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi
   הערה: ודא שההגדרות הן בהתאם לפרמטרים בשלבים 3.2 ו- 3.3. איכות JPEG תמיד תחזור לברירת המחדל ויש לאפס אותה עבור כל סרט חדש.
   שים לב: אל תלחץ עדיין על רשומה.
7. התחל ניסוי חדש באמצעות תוכנת בקרת מהירות הזרימה.
   הערה: כדי להתחיל פרוטוקול אוטומטי, לחץ על התיבה התחל רישום . בחלון הדו-שיח שנפתח, בחר אוטומטי מהרשימה הנפתחת. כדי לבחור קובץ פרוטוקול שנשמר בעבר, לחץ על סמל הקובץ לצד קובץ פרוטוקול כדי לפתוח את הפרוטוקול הרצוי.
   1. כדי להתחיל פרוטוקול ידני, הגדר את מהירות הזרימה ל-0 ס"מ/ש' למשך 5 דקות, 10 ס"מ לשנייה למשך 5 דקות, ולאחר מכן 20 ס"מ/ש' למשך 5 דקות באמצעות התיבה Uwater [cm/s] בתוכנת בקרת מהירות הזרימה.
   2. שמור את קובץ פלט הנתונים החדש (יישמר כקובץ .csv) תחת שם זהה לזה של קובץ הסרט ובאותה תיקיה.
      שים לב: אל תלחץ עדיין על התחל.
8. מניחים מגבת נייר או פיסת בד בצד מנהרת השחייה כדי להבטיח שכל ההתנהגויות נובעות משחייה בדגים ולא בגלל תגובה מבהילה הנגרמת על ידי תנועה בסביבה.
9. ברצף מהיר, ודאו שהמים רגועים ושאין אדוות נעות על פני המסגרת. לחץ על הקלט בחלון תוכנת המצלמה כדי להתחיל להקליט את קובץ הסרט. לחץ על התחל בתוכנת בקרת מהירות הזרימה כדי להתחיל את הפרוטוקול, אשר ימשיך ללא הפרעה.
10. צפה בסרט כדי לוודא כי אין מסגרות נפלו, כי אין בועות בשדה הראייה, וכי כל הדגים מתועדים.
11. לאחר השלמת הקלטת הסרט, לחץ על עצירת חירום כדי לסיים את פרוטוקול בקרת מהירות הזרימה. חפש את קובץ פלט הנתונים שנשמר באופן אוטומטי. לחץ על סגור בחלון ההקלטה כדי לשמור את קובץ הסרט.
12. הסר את המכסה. בזהירות לאחזר את הדגים ולהחזיר אותם למיכל שלהם.
13. חזור על שלבים 3.5 עד 3.12 עבור כל קבוצות הדגים.
14. לאחר סיום הקלטת הסרט עבור כל הקבוצות, המר סרטים מסרטוני 70 fps ל- 20 סרטוני fps עם סקריפט MovieProcessing_v5.bat . לשם כך, העבר את קובץ ה- Script לתיקיה המכילה את סרטוני הווידאו הגולמיים. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הקובץ ובחר הפעל.
    הערה: קובץ ה- Script פועל באופן אוטומטי. יופיע חלון שורת פקודה המציג את התקדמות קובץ ה- Script. השלב שלעיל הוא אופציונלי. הוא מפחית את מספר הפריימים בסרטון של 15 דקות מ-63,000 ל-18,000 פריימים והופך את SwimBehavior_v7. סקריפט R פועל מהר יותר.
15. לרוקן את המנהרה ולשים בצד את כל הציוד.

4. ניתוח סרטים להערכת התנהגות שחייה

הערה: ניתן להשלים הקלטה וניתוח של סרטים בימים נפרדים.

1. פתח את קובץ ה- Script של Tracking_v2.ijm בפיג'י ולחץ על הפעל כדי להתחיל את התוכנית. בחלון שמופיע, בחר את התיקיה המכילה את סרטי התנהגות השחייה למעקב ולחץ על פתח. חפש את מסגרת 1 של הסרט הראשון, תיבת דו-שיח ואת מנהל אזור העניין (ROI) שיעלה.
2. בצע את ההוראות שניתנו בתיבת הדו-שיח. צור החזר השקעה של החלק התחתון של תא מנהרת השחייה ולחץ על אישור. ודא שלא יראו פינות שחורות.
   הערה: חלון הסף ייפתח יחד עם מסגרת 1 ערוכה ומסומנת בסף.
3. שנה את ערכת הצבעים מ - B&W לאדום. התאם את הערך המרבי עד שמסגרת 1 תציג את הדג באדום ולא שום דבר אחר. רשום את הסף. לחץ על אישור בתיבת הדו-שיח.
   הערה: התוכנית תופעל באופן אוטומטי. ההחזר על ההשקעה שנוצר עבור מסגרת 1 ייבחר ברציפות ולא ייבחר עבור המסגרות הבאות. מד התקדמות יפקח על התהליך בפינה השמאלית התחתונה של חלון פיג'י . המעקב אורך כ-40 דקות לכל סרט. כאשר כל הסרטים הם במעקב, תוכנית פיג'י תפסיק. ההחזר על ההשקעה יפסיק להיבחר. התיקיה המכילה את הסרטים תכלול כעת קובץ _raw.csv עבור כל סרט. פיג'י יכולה להיות סגורה בשלב זה.
4. יישור, הרכבה ורכישה של סטטיסטיקות תיאוריות
   1. פתח את Behavior_v7 השחייה. תסריט R באולפן R.
   2. לחץ על מקור בפינה השמאלית העליונה של מקטע הסקריפט. בחלון חדש שנפתח, בחר את התיקיה המכילה את קבצי _raw.csv שנוצרו על-ידי פיג'י. לחץ על פתח.
      הערה: התוכנית תפעל באופן אוטומטי.
   3. בתיבת דו-שיח שקופצת ומבקשת לאשר את מספר הדגים בכל סרט, לחץ על כן אם המספרים שניתנו נכונים, או לחץ על לא אם המספרים שגויים.
      הערה : אם לא נלחץ, תופיע הודעה המבקשת לעקוב מחדש אחר הסרטים באמצעות החזר על ההשקעה והסף החדשים. אם לחץ על כן , התוכנית תמשיך.
   4. בחלון החדש שנפתח ושואל אם יש להסיר את הדגים שאינם שוחים, לחץ על כן או על לא.
      הערה: דגים שאינם שוחים מוגדרים כדגים עם פחות מ-50% פעילות ב-10 ס"מ לשנייה. לא מומלץ להסיר דגים שאינם שוחים.
   5. בחלון מוקפץ חדש ששואל אם הקבוצות אינן מאושרות והאם המשתמש מעוניין לשלב קבוצות כלשהן, לבטל את הבעיה או לשלב קבוצות אם יש יותר מקבוצת ביקורת אחת.
   6. לאחר מתן תגובה לשאלה הקודמת, ודא כי התוכנית נותנת הודעה יישור קובץ X של Y, כאשר X הוא הקובץ הנוכחי מיושר ו- Y הוא המספר הכולל של קבצים ליישר. נדרשים כ- 30 s כדי שכל קובץ יהיה מיושר.
5. לאחר יישור הקבצים, חפש קובץ .csv חדש שנוצר בעל שם זהה (_aligned.csv). ודא שהתוכנית משלבת את הנתונים, מפעילה סטטיסטיקה ומתווה תרשימי פלט. בדוק אם קיימים קבצי הניתוח שנוצרו בתיקיה חדשה הנקראת תוצאות בתוך תיקיית האב המכילה את קבצי _raw.csv _aligned.csv.
6. בתוך התיקיה תוצאות, חפש שתי תיקיות בשם Diagnostics and Graphs וארבעה קבצים .csv בשם BulkData_Avg, BulkData_Full, SummaryData_Avg SummaryData_Full.
   הערה: SummaryData_Full.csv מכיל את הנתונים הבודדים עבור כל דג בכל קבוצה בכל נקודת זמן. נתונים אלה מתווים באופן אוטומטי אך ניתן לחלץ אותם ולהתוות אותם במקום אחר.
   1. ודא שהתיקיה Graphs מכילה את הגרפים שנוצרו על-ידי התוכנית ואת .csv הקבצים המכילים את נקודות הנתונים עבור כל תרשים.
   2. ודא שהתיקיה Diagnostics מכילה קובץ .csv יחיד עם נתוני אבחון עבור קבצים מיושרים.
      הערה: עמודות בקובץ האבחון.csv כוללות את הפריטים הבאים: א) מספר המסגרות המכילות אובייקטים נוספים, שאמורות להיות פחות מ- 100. מסגרות רבות מדי עם אובייקטים נוספים מצביעות על בעיה במעקב. ב)מספר המסגרות עם אובייקטים חסרים או ממוזגים. זה נורמלי שהמדד הזה יהיה גבוה. דגים שלא התחדשו היטב ייסחפו לעתים קרובות לחלק האחורי של המנהרה וייספרו כנעדרים. ג) מסגרות עם יותר מ-240 פיקסלים של קפיצות. מספר זה גדל עם מספר האובייקטים (דגים) בסרט אחד. הסבר מפורט על אופן חישוב מדדי ההתנהגות מסופק בקובץ משלים 1.

תוצאות

הקמנו את מנהרת השחייה כמתואר בסעיף 1 לפרוטוקול זה (איור 1). הערכנו את סיבולת השחייה (סעיף 2 בפרוטוקול זה) כמו גם את התנהגות השחייה (סעיפים 3 ו-4 לפרוטוקול זה) של דגי זברה בוגרים בבסיס ואחרי פגיעה בחוט השדרה (איור 2).

לביסוס פונקציה מוטורית בסיסית, בד...

Discussion

דגי זברה בוגרים הם מערכת חוליות פופולרית למידול מחלות אנושיות ולחקר מנגנונים של התחדשות רקמות. עריכת הגנום CRISPR/Cas9 חוללה מהפכה במחקרים גנטיים הפוכים למידול מחלות בדגי זברה; עם זאת, גנטיקה בקנה מידה גדול בדגי זברה בוגרים הופרעה על ידי אתגרים ביולוגיים וטכניים, כולל אי זמינות של רקמות דגי זב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AutoSwim software	Loligo Systems	MI10000	Optional - for Automatic control of current velocity
Customized lid	Loligo Systems	MI10001	This customized lid is used for swim endurance
DAQ-BT	Loligo Systems	SW10600	Optional - for Automatic control of current velocity
Eheim pump	Loligo Systems	PU10160	20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank.
Fiji	Fiji	Freely available through Image J (Fiji)	Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior
Flowtherm	Loligo Systems	AC10000	Handheld digital flow meter - for calibration
High Speed Camera	Loligo Systems	VE10380	USB 3.0 color video camera (4MP)
IR light panel	Loligo Systems	VE10775	450 x 210 mm, placed under the swim tunnel  chamber
Monofocal lens	Loligo Systems	VE10388	25mm manual lens
PVC Tubing	VWR	60985-534	5/16 x 7/16"  Wall thickness: 1/16"
R Studio	R Studio	Freely available. Version 3.6 with extra packages.	Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior
Swim tunnel respirometer	Loligo Systems	SW10060	5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration
uEye Cockpit	IDS	Freely available software to control camera parameters	Alternative cameras and accompanying softwares could be used
Vane wheel flow probe	Loligo Systems	AC10002	Digital flow probe - for calibration